随着全球食品安全问题的日益突出，各地区及国家对食品真实性及可追溯性的监管要求不断提高。例如，欧盟《通用食品法》和我国《食品安全法》均明确规定，食品供应链必须确保食品的真实性和可追溯性，以防止食品欺诈和掺假行为[1-2]。山羊（Capra hircus）和绵羊（Ovis aries）作为人类最早驯化的家畜之一，在全球畜牧业中占据重要地位[3]。尽管二者同属牛科（Bovidae），但在生物学特性、经济价值和市场需求方面存在显著差异[4]。山羊生长速率较慢，繁殖率较低，对饲养环境要求较高，导致其产量有限。此外，与绵羊肉相比，山羊肉脂肪含量较低且肉质紧实、风味浓郁，深受消费者青睐，市场价格通常较高[5]。正因如此，近年来市场上出现以绵羊肉冒充山羊肉销售的掺假行为。例如，2022年英国赫尔市一家商店将绵羊肉标注为山羊肉出售，该行为不仅涉及食品安全问题，还严重侵害了消费者权益。
由于山羊和绵羊在外形、遗传背景及生物学特性上高度相似[6]，传统鉴别方法在实际应用中存在较大局限性，尤其在深加工肉制品中，形态特征被破坏后鉴别难度显著增加。目前，针对肉类产品快速消费的现状，现有方法难以满足大批量样品的快速筛查需求，特别是对同一类别不同物种的准确鉴定。因此，亟需开发一种快速、精准且灵敏的方法，以实现对绵羊肉和山羊肉的有效区分。
在分子检测技术中，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）及其衍生方法因具有高灵敏度和特异性，常被作为肉制品物种鉴别的首选手段，包括传统PCR[7]、实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，real-time PCR）[8]、数字PCR[9]及其相应的多重PCR[10]等。此类技术已被广泛应用于牛肉、驴肉、猪肉、鼠肉及鸡肉等常见肉类的鉴别[11-14]，但在绵羊肉和山羊肉区分方面的应用相对较少。其中，Uddin等[15]构建的多重PCR方法可实现山羊和绵羊DNA检测，但仍需依赖后续电泳分析，操作复杂、耗时长；Singh Yadav等[16]开发的基于TaqMan多重探针的real-time PCR方法可针对绵羊和山羊线粒体基因组区域进行扩增，特异性强、灵敏度高，但该方法仍依赖昂贵的变温仪器，检测时间较长，不利于基层推广；Vishnuraj等[17]则应用双重real-time PCR结合高分辨率熔解曲线分析对山羊肉和绵羊肉进行鉴别，尽管提升了掺假鉴别的准确性，但对操作人员专业水平要求高，且SYBR染料的使用相较于探针法更易造成污染，同样不适用于基层普及。
近年来，新兴的等温扩增技术，如环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）和重组酶辅助扩增（recombinase-aided amplification，RAA），因其操作简便、反应快速且无需复杂设备，成为替代传统PCR的理想选择。然而，LAMP技术引物设计复杂，易产生非特异性扩增，影响检测准确性[18]。相比之下，RAA技术利用重组酶和单链DNA结合蛋白（single-stranded DNA-binding protein，SSB）在恒温条件下实现目标DNA的快速扩增，可显著降低检测成本，缩短检测时间[19]。此外，可通过在反应体系中引入1 条核酸外切酶（exonuclease，exo）探针建立实时荧光RAA（real-time fluorescence RAA，real-time RAA）方法，实现对扩增过程的实时监测，进一步提高检测的灵敏度与特异性[20]。目前，该方法已成功应用于狗肉、马肉及驴肉等动物源性成分鉴别[21-23]，为开发双重real-time RAA技术同步鉴别山羊肉和绵羊肉提供了技术依据。与现有单一检测方法相比，双重real-time RAA技术能够在单次反应中实现2 个物种的同步鉴别，显著提升检测效率，在食品真实性监管领域具有广阔的应用前景。
因此，本研究拟构建一种双重real-time RAA检测方法，针对山羊和绵羊的细胞色素b（cytochrome b，Cytb）基因进行同步特异性鉴别，系统优化引物探针组合与反应温度等关键参数，评估方法的特异性与灵敏度，并采用市售样品验证其实际应用效果，旨在开发一种无需复杂仪器、适合基层检测需求的恒温核酸快速鉴别方案，为解决当前绵羊肉/山羊肉掺假鉴别中存在的技术瓶颈提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
实验用鼠 广东省医学实验动物中心；鲜肉质控样品（狗肉、猫肉、狐狸肉、貂肉、山羊肉和绵羊肉）广州硕谱生物科技有限公司；常规质控样品（牛肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、马肉、鹅肉、驴肉和骆驼肉） 本实验室保存；兔肉、马鹿肉、梅花鹿肉为线上采购，并通过GB/T 38164—2019《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法》进行真实性验证，结果符合标准。
RAA（荧光型）核酸扩增试剂盒 东莞元佳实验科技有限公司。
1.2 仪器与设备
CFX96 Touch型real-time PCR仪 美国Bio-Rad 公司；JXFSTPRP-32型组织研磨仪 上海净信实业发展有限公司；ME403型千分之一电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；Nanodrop ONEc型超微量分光光度计 美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.3 方法
1.3.1 样品DNA提取
取约30～100 mg样品于含钢珠离心管中，加入300 µL DNA裂解液（1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）、1 mol/L LiCl、0.5 mol/L乙二胺四乙酸、1%（V/V）乙基苯基聚乙二醇、1 g/100 mL 3-磺丙基十六烷基二甲甜菜碱及1 mol/L(NH4)2SO4），使用组织研磨仪充分研磨混匀后，12 000 r/min离心1 min，取上清液，加入1 mL体积分数95%乙醇，12 000 r/min离心1 min，弃上清液，采用75%（V/V）乙醇洗涤沉淀2 次，即得目的DNA。采用超微量分光光度计测定DNA纯度（OD260 nm/OD280 nm值在1.7～2.0范围内），将合格目的DNA稀释至50 ng/μL，-20 ℃保存备用。
1.3.2 引物和探针设计与合成
从GenBank数据库分别下载山羊（GenBank登录号：MN540081.1）和绵羊（GenBank登录号：MH938654.1）线粒体Cytb基因序列。使用SnapGene 6.0.2软件进行序列比对，确定Cytb基因的保守序列，并根据real-time RAA引物探针设计原理，在保守区域分别设计山羊和绵羊的特异性RAA引物及exo探针（表1）。所有引物和探针均通过美国国家生物技术信息中心中BLAST工具进行特异性验证。
表1 用于检测绵羊和山羊源性成分的real-time RAA引物和探针序列
Table 1 Real-time RAA primer and probe sequences for detection of sheep and goat-derived ingredients
目标物种引物和探针引物和探针序列（5’→3’）Capra-F1TAGTCCACCTGCTCTTCCTCCACGAAACAG Capra-R1ATTTGCTGGGATATAGTTGTCTGGGTCTCC山羊Capra-F 2AACAGGATCGAACAACCCCACAGGAATTCCCapra-R2AGGTCGGGTGTGAATAGTACTAGTAATATTAG Capra-PCATTTCACCCTTACTACACCATTAAAGATA[FAM-dT][THF]T[BHQ1-dT]AGGCGCCATGCTACT-C3spacer Ovis-F1AGGATCCAACAACCCCACAGGAATTCCATC Ovis-R1TGTTAAGTGGGTTTGCTGGGGTGTAGTTGTC绵羊Ovis-F2TAGTTCACCTACTCTTCCTCCACGAAACAG Ovis-R2TAGGAAGTATCATTCAGGTTTGATGTGAGG Ovis-TACCCTTATTACACCATTAAAGACATCCTAGG[ROX-dT][THF]C[BHQ2-dT]ATCCTACTAATCCTC-C3spacer
1.3.3 real-time RAA引物筛选
将1.3.2节合成的山羊和绵羊引物分别进行两两组合，以筛选能够有效扩增目的片段的引物组合。随后将筛选的引物组合进行配对，以确定能够同步扩增山羊和绵羊的双重引物组合。每一组合扩增实验均设置2 个平行。
1.3.4 双重real-time RAA扩增条件
双重real-time RAA扩增体系：2 μL 10 μmol/L引物、0.6 μL 10 μmol/L探针、25 μL 20%聚乙二醇、2.5 μL 280 mmol/L醋酸镁缓冲溶液和1 μL目标DNA，ddH2O补齐至50 μL。在此扩增体系下，于29～45 ℃范围内优化双重real-time RAA扩增的最适反应温度，每一温度下设置3 个平行。所有扩增程序均采用30 s/循环，共计40 个循环。
1.4 数据处理
所有数据和原始扩增曲线均使用CFX Manager 3.1软件获得，采用Excel 2021软件进行数据整理，数据以平均值±标准差表示，采用PowerPoint 2021软件绘图。组间差异采用单因素方差分析进行多重比较检验，以P＜0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 real-time RAA引物筛选
为建立山羊和绵羊物种特异性同步检测体系，本研究首先对山羊和绵羊各4 对特异性引物-探针组合的扩增效率进行评估。结果显示，绵羊引物-探针组合均呈现典型的“S”型扩增曲线（图1A），而山羊仅有Capra-F2/R2引物-探针组合实现有效扩增（图1B）。
图1 绵羊（A）与山羊（B）特异性引物-探针组合对目标DNA的扩增曲线
Fig. 1 Amplification curves of target DNA using specific primer-probe sets for sheep (A) and goat (B)
为筛选最优的双重real-time RAA反应体系，将4 组绵羊引物-探针分别与山羊Capra-F2/R2探针组合配对，并进行同步扩增。在双重real-time RAA反应体系中，当山羊和绵羊引物（400 nmol/L）和探针（120 nmol/L）浓度相同时，所有组合均与目的DNA产生有效反应（图2A）。其中，山羊Capra-F2/R2与绵羊Ovis-F2/R1组合时，循环阈（cycle threshold，Ct）值最低（图2B）。因此，将该组合作为后续实验的双重real-time RAA扩增引物。
图2 山羊Capra-F2/R2探针与不同绵羊引物-探针组合 real-time RAA同步扩增结果
Fig. 2 Results of simultaneous amplification of goat-specific probe Capra-F2/R2 and different sheep-specific primer-probe sets
2.2 双重real-time RAA反应温度选择
由表2可知，双重real-time RAA反应体系的扩增效率与反应温度呈现相关性。在29～39 ℃区间内，山羊和绵羊源性成分的Ct值均随反应温度升高呈现降低趋势。当反应温度升至41 ℃时，2 种靶标的扩增效率出现差异，山羊Ct值仍在下降，而绵羊Ct值则呈现上升趋势。当反应温度超过41 ℃，2 种靶标的扩增效率均显著降低（P＜0.05）。综上所述，基于双重real-time RAA同步检测需兼顾2 种靶标的扩增效率，因此最终确定39 ℃为最佳反应温度。
表2 不同反应温度下双重real-time RAA检测山羊和绵羊 源性成分的Ct值
Table 2 Cycle threshold values of goat and sheep-derived components detected by dual real-time RAA at different reaction temperatures
反应温度/℃山羊绵羊2918.57±0.99a17.01±0.40a 3110.57±0.20b11.01±0.44b 338.58±0.49b8.76±0.32c 356.18±0.28c8.41±0.79c 375.56±0.12c6.78±0.28d 395.42±1.38d5.96±1.21e 414.57±1.14 c7.37±0.68 c 4331.57±0.18e29.37±0.70f 4528.40±0.40f26.77±0.30h
注：同列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
2.3 双重real-time RAA检测特异性
为评估该双重检测体系的交叉反应性，本研究选取提取自山羊、绵羊、鼠肉、猫肉、狗肉、狐狸肉、貂肉、牛肉、鹅肉、骆驼肉、猪肉、兔肉、鸡肉、梅花鹿肉、马肉、驴肉、马鹿肉及鸭肉18 个物种的基因组DNA进行扩增，并以ddH2O作为空白对照。结果显示，在优化条件下，仅山羊和绵羊DNA实现有效扩增，其他16 种非靶标物种的扩增曲线与空白对照完全重叠（图3A），且3 份重复样品间DNA检测结果高度一致，表明所选引物和探针组合能够有效避免与非靶标物种的交叉反应。此外，为进一步验证双重检测体系中2 个检测通道的独立性，分别采用山羊和绵羊单重检测方法对靶标DNA进行检测。如图3B、C所示，山羊和绵羊单重real-time RAA检测体系仅扩增出目标序列，未出现交叉反应现象。
图3 双重real-time RAA特异性验证
Fig. 3 Specificity verification of dual real-time RAA
2.4 双重real-time RAA检出限
以山羊肉和绵羊肉互为基底，分析0.1%～10%（m/m）添加量下的扩增情况，以确定双重real-time RAA方法检出限。如表3所示，当山羊肉添加量低于0.5%（m/m）时，荧光扩增信号无法被有效检出。相比之下，针对绵羊基因序列所设计的引物和探针呈现更高的灵敏度，即使在添加量0.2%（m/m）时仍能产生扩增信号。由于需满足双重real-time RAA同步检测要求，不以单一成分的检出限为准，将0.5%（m/m）确定为方法检出限。
表3 山羊和绵羊源性成分混合体系中双重real-time RAA方法灵敏度评估
Table 3 Sensitivity evaluation of the dual real-time RAA method for detecting mixed systems of goat- and sheep-derived components
山羊肉绵羊肉Ct值添加量/%添加量/%山羊绵羊10.090.05.81±0.509.18±0.245.095.06.37±0.197.16±0.172.098.09.18±0.966.21±0.041.099.011.14±1.876.19±0.810.599.518.41±2.205.80±0.530.299.8—5.08±0.530.199.9—4.89±0.5390.010.08.58±0.527.17±0.9995.05.07.11±0.159.66±0.3198.02.06.87±0.3111.64±1.0299.01.06.37±0.7211.99±0.9999.50.56.08±0.3514.20±2.2199.80.25.82±0.2918.02±0.8599.90.15.33±0.37—
注：—. Ct值≥40.0。
2.5 双重real-time RAA稳定性
检出限指在非目标分析物存在的情况下，样品中可被稳定检出的最低分析物浓度[15]。为进一步验证双重real-time RAA方法检出限的稳定性，基于表3扩增结果，以充分粉碎牛肉作为基底，制备含2.0%、1.0%、0.5%、0.2%（m/m） 山羊与绵羊成分的4 种混合样品，每组设置6 个平行。结果显示，对于对2.0%、1.0%和0.5%添加水平，双重 real-time RAA方法均能稳定检出全部6 个平行样品中的山羊和绵羊源性成分（图4A～C），但对于0.2%添加水平，仅能检出6 个绵羊源性成分（图4D）。此外，随着肉制品含量的下降，双重real-time RAA同步检测山羊和绵羊源性成分的Ct值均逐渐升高，但均低于30（图4E、F）。 由于本研究Ct值设置为40（远高于临界Ct值30）。因此，最终确定0.5%作为双重real-time RAA方法同步检测山羊和绵羊源性成分的检出限。
图4 双重real-time RAA方法同步检测山羊和绵羊源性成分稳定性
Fig. 4 Stability of the real-time RAA method for simultaneous detection of goat- and sheep-derived components
2.6 市售样品检测
为评估本研究建立的双重real-time RAA方法在市售肉制品中绵羊和山羊源性成分检测中的适用性，采用该方法和GB/T 38164—2019中的real-time PCR法对25 份市售肉制品进行检测和对比。如表4所示，2 种方法的检测结果呈现出高度一致性，符合率达到100%，表明本研究所建立的双重real-time RAA方法具有实际应用价值。
表4 双重real-time RAA和real-time PCR检测市售肉制品中绵羊和山羊源性成分结果
Table 4 Results of detection of sheep- and goat-derived ingredients by the dual real-time RAA method and real-time PCR in commercially available meat products
双重real-time RAAreal-time PCR样品类型样品数量/份检出山羊源性检出绵羊源性检出山羊源性检出绵羊源性成分样品数量/份成分样品数量/份成分样品数量/份成分样品数量/份鲜羊肉50505熟山羊肉42222新鲜山羊肉54141牛肉干60101牛肉串（烧烤）50202
3 讨 论
RAA是一种基于重组酶介导的新型等温核酸扩增技术，其主要通过重组酶、SSB和DNA聚合酶的协同作用，于37～42 ℃恒温条件下在5～30 min内即可完成特定靶标序列的高效扩增[24-26]。real-time RAA在RAA基础上引入exo探针，该探针为与靶序列互补的寡核苷酸，其内部含有四氢呋喃（tetrahydrofuran，THF）位点，两端分别标记荧光基团和猝灭基团[27]。当探针与目标DNA结合时，exo可特异性识别并切割THF位点，使荧光基团与猝灭基团分离而产生可检测荧光信号，整个扩增过程可通过常规荧光定量仪实时监测，不仅可省去传统电泳分析步骤，大幅缩短检测时间，还可有效降低交叉污染风险[28-29]。
建立高效、准确的双重real-time RAA检测体系依赖于特异性引物和探针的优化设计。与real-time PCR不同，RAA引物和exo探针需遵循特殊设计原则，其碱基序列通常需达到30 bp甚至更长，这限制了常规引物和探针设计软件的应用[30-31]。因此，多重real-time RAA反应需要设计多组引物，并需严格评估引物或探针之间结合的可能性及引物二聚体不良结构的形成风险。引物设计是RAA反应得以开展的前提，更是决定其能否成功的核心要素，需通过大量合成筛选和实验验证以确保检测特异性和效率[32-33]。
本研究利用SnapGene 6.0.2软件和BLAST工具进行同源序列比对，以确定线粒体基因Cytb分别在绵羊和山羊的保守区域。基于该区域，根据real-time RAA工作原理设计4 对引物（山羊与绵羊DNA扩增引物各2 对）和2 条exo探针（山羊与绵羊DNA扩增探针各1 条）。经单重real-time RAA扩增引物有效性评估确定4 组双重扩增引物-探针组合。其中，山羊Capra-F2/R2与绵羊Ovis-F2/R1 引物-探针组合呈现最佳扩增性能。该引物-探针组合在29～45 ℃恒温条件下均能有效扩增出靶标序列，当反应温度为39 ℃时，同步扩增效果最佳。此时，双重realtime RAA检测方法特异性强，山羊和绵羊的引物和探针之间未呈现交叉干扰现象。此外，双重real-time RAA可在20 个循环内在模拟样品中检出0.5%（m/m）山羊和绵羊源性成分，且稳定性良好。对25 份市售样品进行检测，其结果与real-time PCR结果高度一致，证实该方法具有实用性。
4 结 论
与常规PCR相比，本研究建立的双重real-time RAA方法显著提升了检测效率，降低了检测成本，并通过特异性引物和探针设计与反应条件优化确保了检测结果的准确性。然而，在复杂基质样品中，该方法可能受基质抑制效应干扰，进而影响检测灵敏度，且尚未充分验证该方法对多物种混合样品的检测能力，这在一定程度上限制了其在复杂样品检测中的适用性。后续研究将进一步优化反应体系，提升双重real-time RAA方法在复杂基质中的抗干扰能力，并拓展其在多重检测中的应用范围。此外，随着恒温扩增技术的不断完善和便携式检测仪器的快速发展，本研究建立的双重real-time RAA方法在基层实验室、市场监管现场及野外检测等场景中具有广阔的应用前景，将为食品溯源、物种鉴定及质量监控等领域提供一种高效、便捷的技术支持。
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