烧鸡作为我国传统风味食品的代表性品类之一，其制作工艺源远流长，在南北各地衍生出多种具有地域特色的流派，如德州扒鸡、道口烧鸡等。这类产品凭借酥烂脱骨的口感特征和浓郁的卤制风味深受消费者喜爱，其独特的卤制工艺不仅赋予产品醇厚的滋味，更保留了丰富的蛋白质、氨基酸等营养成分[1-3]，具有较高的食用价值，在市场中占据重要地位。然而，高水分含量与丰富的营养基质也为微生物生长与繁殖提供了理想环境，这对其贮藏稳定性提出严峻挑战。为延长保质期并保障食用安全，热处理杀菌技术被广泛应用于肉制品加工中，但这种处理方式存在明显的局限性。一方面，高温杀菌在灭活大部分细菌的同时，可能对产品风味、口感和营养价值造成不良影响[4-5]；另一方面，对于极端耐热微生物，尤其是能形成芽孢的微生物，常规杀菌工艺往往难以实现彻底灭活[6]。
耐热菌通常指经巴氏杀菌或超高温瞬时灭菌处理后仍能存活的一类微生物的总称[7]，其主要来源于土壤[8-10] 与水体[11-13]，可通过原料鸡肉污染、加工设备接触、包装材料附着或环境空气传播等途径污染烧鸡制品，常见种类包括芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属等[14]。其生物学特性表现为能形成具有厚壁结构的芽孢，这种特殊形态对各种物理和化学杀菌处理表现出极强的抗性[15]。当环境条件适宜时，芽孢可重新萌发成细菌营养体，通过分泌蛋白酶、脂肪酶等水解酶持续分解营养成分，不仅造成食品品质劣变、腐败与营养价值下降，某些菌株还可能产生对人体有害的代谢产物，存在引发消费者肠胃不适、食物中毒等风险，同时造成企业品牌信誉与经济利益的重大损失。目前已有大量研究证实，耐热芽孢杆菌普遍存在于热处理肉类[16]、乳制品[17]、罐头[18]等食品中，已成为制约这类产品货架期的主要微生物因素。烧鸡作为典型的热加工肉制品，同样面临耐热芽孢杆菌引发的腐败问题，深入解析其耐热芽孢杆菌污染特征有助于揭示产品腐败变质的微生物学机制，为开发针对性的保鲜技术提供科学依据。因此，分离筛选引起烧鸡腐败的关键微生物并对其生长特性进行研究，是明确烧鸡腐败动因、解析耐热芽孢杆菌污染机制的必要基础。
为明确腐败烧鸡中耐热菌种类及其生长特性，本研究以腐败烧鸡为材料，从中分离纯化出一株耐热菌，通过形态学观察、生理生化实验及16S rRNA测序等方法对其进行鉴定，分析该菌株在不同培养温度、pH值和NaCl含量条件下的生长规律，并评估其温度耐受性，以期为控制烧鸡中耐热微生物、延长产品货架期提供理论依据与技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
烧鸡 天津煜膳楼食品有限公司。
酵母浸粉 北京奥博星生物技术有限责任公司；胰蛋白胨、琼脂粉 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；氯化钠 天津科密欧化学试剂有限公司；牛肉膏天津英博生化试剂有限公司；可溶性淀粉、甘露醇西陇科学股份有限公司；葡萄糖 天津江天化工技术股份有限公司；乳糖 天津华盛化学试剂有限公司；明胶、硝酸盐还原试剂盒、芽孢染色试剂盒 广东环凯生物科技有限公司；革兰氏染色试剂盒 湖南比克曼控股有限责任公司；细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司。以上试剂均为分析纯或生化试剂。
1.2 仪器与设备
FD50A型立式蒸汽灭菌锅 致微（厦门）仪器有限公司；AlphaClean 1300型洁净工作台 力康精密科技（上海）有限公司；DRP-9272型生化培养箱 上海森信实验仪器有限公司；IS-RDD3型台式恒温振荡器美国精骐有限公司；BCD-186D型冷藏冷冻箱 创维电器股份有限公司；LICHEN型集热式恒温磁力搅拌器上海力辰邦西仪器科技有限公司；P-800型酶标仪杭州遂真生物技术有限公司；TDL-21型高速冷冻离心机四川蜀科仪器有限公司；B302型生物显微镜 重庆奥特光学仪器有限责任公司；TM4000Plus型扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM） 日本Hitachi公司。
1.3 方法
1.3.1 培养基配制
LB固（液）体培养基、不同pH值培养基与不同NaCl含量培养基均参照文献[19-21]配制。
1.3.2 污染菌分离纯化
选取生产日期在保质期内、真空包装完好（无漏气）、鸡肉呈浅黄褐色且质地紧实有弹性、无异味的新鲜烧鸡，置于30 ℃恒温培养箱中，每日观察腐败特征变化。腐败判定标准：包装由紧贴鸡肉转为局部或整体凸起；按压时具有气体支撑感及紧绷感；鸡肉色泽变暗或出现霉斑、质地变软且发黏，出现酸馊或腐臭味，当样品出现上述任一特征，即判定为腐败。
参照张奕敏等[22]的方法并略作修改。在无菌操作台中打开样品包装袋，分别从鸡胸、鸡腿和鸡翅根3 个部位采样，每个部位分别采集表层与深层组织，混合均匀后作为一个独立样品，共制备3 份平行样品。样品经90 ℃水浴加热30 min，冷却至室温后，无菌条件下称取25 g并迅速放入装有225 mL无菌生理盐水的均质袋中，密封，充分均质后静置。取1 mL上清液进行10-1～10-6梯度稀释，每个稀释度设置3 个平行，37 ℃倒置培养24 h。挑取生长较快的单菌落进行划线分离，直至获得单一形态的菌落。
1.3.3 菌种保藏
将分离纯化菌株置于最适生长温度下培养，通过生长曲线确定对数生长末期，收集菌悬液，与灭菌50%甘油溶液按1∶1（V/V）混合均匀后，于-20 ℃冻存。
1.3.4 菌种活化及种子液制备
取甘油保藏菌种划线接种至LB固体培养基，37 ℃恒温培养24 h，使其充分活化，挑取活化后的单菌落，接入新鲜LB液体培养基，37 ℃振荡（150 r/min）培养24 h，摇匀后即得扩大培养种子液。
1.3.5 菌种鉴定
1.3.5.1 形态学观察
使用接种环从筛选菌株甘油冻存管内挑取菌种，采用划线法接种至LB固体培养基平板，37 ℃倒置培养24 h。观察培养皿中的菌落形态并拍照。
1.3.5.2 革兰氏染色
使用革兰氏染色试剂盒进行染色后，采用生物显微镜观察。
1.3.5.3 芽孢染色
采用Schaeffer-Fulton法[23]进行芽孢染色。将种子液按1%（V/V）接种量接种至LB液体培养基，37 ℃振荡（150 r/min）培养48 h，菌液经磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）洗涤3 次（4 ℃、6 000 r/min离心10 min），弃去上清液，采用PBS重悬并适当稀释。取少量芽孢悬液涂布于洁净载玻片，自然干燥后滴加孔雀绿染液，覆盖涂片，加热染色10～15 min，用无菌水冲洗至水流无颜色，干燥后以番红染液复染2～3 min，无菌水洗并晾干后镜检，营养体为红色，芽孢为绿色。
1.3.5.4 生理生化鉴定
选取革兰氏染色呈阳性且具有芽孢形成能力的菌株，根据《常见细菌系统鉴定手册》[24]与《伯杰细菌鉴定手册》[25]进行生理生化特性鉴定。
1.3.5.5 微观结构观察
将培养24 h种子液于4 ℃、6 000 r/min离心10 min，弃上清液，用PBS洗涤菌体3 次，离心并弃上清液，加入2.5%戊二醛溶液，4 ℃固定过夜。随后以PBS再次洗涤菌体3 次，离心并弃上清液，收集菌体；将菌体依次置于30%、50%、70%、85%、95%、100%（V/V）乙醇溶液中梯度脱水，各处理15 min，离心并弃上清液；再用无水乙醇重复脱水2 次，每次20 min。样品经冷冻干燥后，采用SEM观察菌体形态。
1.3.5.6 16S rRNA测序
采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，以此为模板，采用通用引物bac_16S_27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和bac_16S_1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，引物由上海元莘生物医药科技有限公司合成。PCR扩增体系（50 μL）：2×AceTaq Master Mix 25 μL、正反向引物（10 μmol/L）各1 μL、模板DNA 1 μL，ddH2O补至50 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min，40 个循环（95 ℃-15 s、56 ℃-20 s、72 ℃-40 s）。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，纯化产物经测序后，通过NCBI数据库进行BLAST比对分析，采用MEGA 5.0软件构建系统发育树。
1.3.6 菌株生长特性测定
1.3.6.1 温度对菌株生长的影响
将种子液按2%（V/V）接种量接种至LB液体培养基，分别于4、25、32、37、45、50 ℃下150 r/min振荡培养24 h，每组3 个重复，以空白培养基作为对照，采用酶标仪在600 nm波长处测定培养液光密度（optical density，OD），即OD600 nm，以确定菌株最适生长温度。
1.3.6.2 生长曲线绘制
将种子液按2%（V/V）接种量接种至LB液体培养基，37 ℃、150 r/min振荡培养，以空白培养基作为对照，每隔2 h测定培养液OD600 nm，持续监测至24 h，每组3 个重复，根据时间-OD600 nm绘制生长曲线，分析菌株的延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期等生长阶段特征。
1.3.6.3 NaCl含量对菌株生长的影响
将种子液按2%（V/V）接种量分别接种至含0、2、5、8、11、14 g/100 mL NaCl的LB液体培养基，37 ℃、150 r/min振荡培养24 h，每组3 个重复，以空白培养基作为对照，测定培养液OD600 nm。
1.3.6.4 pH值对菌株生长的影响
将种子液按2%（V/V）接种量分别接种至pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的LB液体培养基，37 ℃、150 r/min振荡培养24 h，每组3 个重复，以空白培养基作为对照，测定培养液OD600 nm。
1.3.7 热杀菌对菌株生长的影响
1.3.7.1 杀菌温度对菌株生长的影响
参照白杰等[26]的方法并稍作修改。将种子液按2%（V/V）接种量接种至LB液体培养基，37 ℃培养4～12 h后，在无菌条件下将菌悬液接种至LB液体培养基，分别于85、95、105、115、125 ℃热处理30 min，每组3 个重复，热处理结束后立即冰浴冷却，37 ℃、150 r/min振荡培养24 h，测定培养液OD600 nm。
1.3.7.2 杀菌时间对菌株生长的影响
将种子液按2%（V/V）接种量接种至LB液体培养基，37 ℃培养4～12 h后，在无菌条件下将菌悬液接种至LB液体培养基，分别于85、95、105、115、125 ℃热处理5、10、15、20、25、30 min，每组3 个重复，热杀菌处理后立即冰浴冷却，37 ℃、150 r/min振荡培养24 h，测定培养液OD600 nm。
1.4 数据处理
采用Excel 2019软件处理数据，结果以平均值±标准差表示，采用OriginPro 2025软件绘图。
2 结果与分析
2.1 腐败烧鸡中耐热菌分离
通过90 ℃水浴加热30 min处理筛选可有效灭活烧鸡样品中的非耐热微生物，仅保留耐热菌。经稀释涂布及平板划线分离，从腐败烧鸡中成功分离纯化出1 株耐热细菌，编号为S-1。该分离结果表明，腐败烧鸡中确实存在耐热菌，推测其可能是导致烧鸡腐败的主要微生物之一。基于此，后续对该菌株展开系统的生物学分类鉴定。
2.2 菌落形态观察及染色结果
由图1A可知，菌株S-1菌落呈淡黄色，近似圆形，直径2～5 mm，表面干燥且无光泽、不透明，中央轻微凸起，边缘不整齐；菌落质地较坚韧，不易破碎，易于用接种环挑起。这些特征与芽孢杆菌属细菌的典型形态一致，初步判定菌株S-1可能属于芽孢杆菌属。由图1B可知，菌株S-1菌体呈紫色，符合革兰氏阳性菌特征。菌体形态呈杆状，排列方式多样，多为单个或成对存在，也有3～5 个菌体相连呈短链状。这一结果进一步表明该菌株属于芽孢杆菌属。
图1 菌株S-1菌落形态学观察
Fig. 1 Colony morphology of strain S-1
由图1C可知，菌株S-1营养体呈红色，芽孢呈绿色，且芽孢中生或近端生，呈椭圆形，直径小于菌体，每个菌体仅形成1 个芽孢。这一特征与芽孢杆菌属的典型芽孢形态一致，尤其是其芽孢位置和大小与海内氏芽孢杆菌（Bacillus haynesii）相符[27]，为后续鉴定提供了关键的形态学依据。由图1D可知，菌株S-1菌体呈直杆状，形状大小均匀，进一步证实该菌株属于杆菌类微生物。
2.3 生理生化鉴定结果
如表1所示，菌株S-1接触酶、淀粉水解、V-P、明胶液化、葡萄糖利用、甘露醇利用及硝酸盐还原均呈阳性，而乳糖利用与柠檬酸盐利用则呈阴性。这一生化谱与芽孢杆菌属的代谢特征一致，进一步支持其分类学归属。
表1 菌株S-1生理生化鉴定结果
Table 1 Biochemical and physiological characteristics of strain S-1
利用利用利用利用还原反应结果++++++--+鉴定项目接触酶淀水粉解V-P明胶液化葡萄糖甘露醇乳糖柠檬酸盐硝酸盐
注：+.阳性；-.阴性。
2.4 16S rRNA测序鉴定结果
如图2所示，以菌株S-1基因组为模板，经PCR扩增获得的基因序列电泳条带在1 200 bp左右，与预期片段大小一致。将测序结果在NCBI的GenBank数据库中进行BLAST比对，发现菌株S-1与B. haynesii模式菌株NRRLB-41327的16S rRNA基因序列同源性达99.92%，覆盖率为100%。选取同源性较高的模式菌株16S rRNA基因序列，基于MEGA 5.0软件构建系统发育树[28]，结果如图3 所示，菌株S-1与B. haynesii NRRLB-41327聚为一支，亲缘关系最近。综合形态学、生理生化及分子生物学鉴定结果，最终鉴定菌株S-1为B. haynesii。
图2 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果
Fig. 2 Agarose gel electrophoresis results of polymerase chain reaction amplification product
图3 菌株S-1基因系统发育树
Fig. 3 Phylogenetic tree of strain S-1 gene
2.5 不同温度下菌株S-1生长特性
温度作为调控微生物生命活动的核心环境因子，其变化直接影响细胞的酶促反应速率与膜流动性，进而决定微生物的生长代谢效率。如图4所示，在4～37 ℃范围内，菌株S-1的OD600 nm随温度升高呈现明显的上升趋势，这一现象符合微生物生长代谢的基本规律。适宜的生长温度可维持胞内酶的高效催化活性，加速物质合成与能量代谢进程，从而促进菌体生长与增殖；在32～37 ℃范围内，OD600 nm均维持在较高水平，其中37 ℃时OD600 nm达到0.609，略高于32 ℃时的0.603，表明该温度区间为菌株S-1的适宜生长温度范围。在此温度范围内，菌株代谢活动处于平衡状态，其胞内酶系活性与膜结构功能等均处于适配状态，可保障菌体高效生长繁殖[29]；当温度超过37 ℃后，OD600 nm呈快速下降趋势，但在50 ℃条件下仍能生长，充分证实该菌株具有典型的耐热特性。这与何银等[30] 的研究结果相似，其分离的枯草芽孢杆菌、类芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌在低于15 ℃时生长微弱，OD600 nm随培养温度升高呈先升后降趋势，且在35 ℃时达到最佳生长状态，这些现象共同反映了芽孢杆菌属微生物对温度的相似适应机制。赵嘉旭等[31]的研究也得出类似结果，其报道的枯草芽孢杆菌在30～37 ℃生长最好，50 ℃仍能维持一定的生长能力。基于此，在实际生产过程中若要有效抑制该类微生物生长，建议将贮藏温度控制在30 ℃以下，因为在低于适宜温度范围时，微生物细胞内酶活性降低，代谢速率减缓，菌体增殖受到抑制，这与芽孢杆菌在低温环境下代谢活动减弱的生理特性相符[32]。
图4 培养温度对菌株S-1生长的影响
Fig. 4 Effect of incubation temperature on the growth of strain S-1
2.6 菌株S-1生长曲线
如图5所示，菌株S-1生长曲线呈现出典型的微生物群体生长规律。接种0～4 h，菌株需适应新环境，生长速率较为缓慢，处于迟缓期；4～12 h，菌株基本完成营养适应过程，开始快速生长繁殖，OD600 nm迅速上升，进入对数生长期；12 h后，OD600 nm趋于稳定并伴有轻微波动，但不再出现显著增长，进入稳定期；该菌株在24 h内未进入衰亡期。这一生长模式与鸽源益生性芽孢杆菌[33] 类似，其在4 h进入对数生长期，12 h进入稳定期，24 h内也未进入衰亡期。基于生长特性，本研究选取4～12 h（对数生长期）菌种开展后续耐热性实验。
图5 菌株S-1的生长曲线
Fig. 5 Growth curve of strain S-1
2.7 不同NaCl含量下菌株S-1生长特性
NaCl可通过改变外界渗透压，破坏微生物细胞内外的水分平衡，进而影响细胞结构稳定性与正常生理代谢。如图6所示，NaCl质量浓度为0～5 g/100 mL时，OD600 nm较为稳定，表明菌株受NaCl含量影响较小，生长状态良好。此时，菌株能够通过自身渗透压调节系统维持胞内渗透压平衡，保障基本代谢活动正常进行；当NaCl质量浓度超过5 g/100 mL后，随着NaCl质量浓度的升高，OD600 nm呈现快速下降趋势，表明菌株生长开始受到明显抑制，但仍维持一定的生长能力。高盐环境可导致胞外渗透压远高于胞内，引发细胞失水，进而破坏细胞膜结构完整性；当NaCl质量浓度超过11 g/100 mL时，菌株S-1生长完全被抑制，极端高盐环境已超出菌株渗透压调节能力与生长耐受极限，导致其生长基本停滞。这与王瑞等[34]从返稀蚝油中分离的贝莱斯芽孢杆菌的耐盐特性一致，二者在低盐环境下均表现出良好的生长特性。NaCl质量浓度小于5 g/100 mL时，贝莱斯芽孢杆菌生长良好，当NaCl质量浓度大于8 g/100 mL时，生长受到抑制，NaCl质量浓度大于17 g/100 mL时，部分芽孢杆菌已不能生长，与菌株S-1类似，表明芽孢杆菌属微生物普遍具有一定的耐盐特性，同时也说明烧鸡加工中常规食盐添加量可能不足以有效抑制该类微生物的生长。
图6 NaCl含量对菌株S-1生长的影响
Fig. 6 Effect of NaCl content on the growth of strain S-1
2.8 不同pH值下菌株S-1生长特性
如图7所示，在pH 2～5范围内，菌株生长缓慢，几乎处于停滞状态，这种生长抑制现象主要源于酸性条件尤其是过酸环境对微生物细胞的多重破坏作用：首先，低pH值可改变细胞膜表面电荷分布，影响其通透性和选择性；其次，酸性环境可能导致关键酶蛋白的空间构象发生改变，破坏其活性中心，进而干扰正常的物质合成与能量代谢[35]；当pH值升至6～7时，菌株生长速率迅速提升，OD600 nm在pH 7时达到峰值，表明中性至弱碱环境为菌株S-1的最适生长环境；当pH值升高至8～9后，OD600 nm有所下降，但菌株仍能维持生长。高碱环境可通过改变胞内离子平衡和酶活性等方式抑制菌株生长。这一pH值适应性特征与巨大芽孢杆菌耐酸性[36]相似，其也在pH 7时表现出最佳生长状态，且在pH 9时仍能存活。这些共性特征证实芽孢杆菌属微生物对pH值环境的适应规律，同时也提示在实际食品保藏中，单纯依靠弱酸环境可能仅能延缓腐败进程而无法完全阻止腐败发生。
图7 初始pH值对菌株S-1生长的影响
Fig. 7 Effect of initial pH on strain S-1 growth
2.9 不同杀菌温度对菌株S-1生长的影响
如图8所示，在同一处理时间下，随着杀菌温度的升高，菌株培养液OD600 nm呈下降趋势。在85～95 ℃区间内，虽然OD600 nm随温度升高呈现下降趋势，但在95 ℃时仍有一定数量菌株能够生长，表明该温度范围已经对该菌株生长产生明显的抑制作用，但尚无法达到彻底杀菌效果。当杀菌温度超过95 ℃时，菌株培养液OD600 nm迅速下降并趋近于0，这一突变性变化表明菌体开始大规模死亡，生长能力基本丧失。基于此，95 ℃、30 min可确定为该菌株的临界杀菌条件，而要实现商业无菌要求，实际生产中需采用≥105 ℃的高温处理标准。
图8 杀菌温度对菌株S-1生长的影响
Fig. 8 Effect of sterilization temperature on the growth of strain S-1
2.10 不同杀菌时间对菌株S-1生长的影响
如图9所示，初始5 min热处理即可实现对菌株S-1营养体的有效杀灭，热处理时长超过5 min后，菌株S-1表现出差异化的热抗性特征，这种现象可能归因于菌群中存在具有特殊耐热性的孢子亚群，这些亚群能够适应加工过程中的极端环境胁迫[37]。85、95 ℃热处理0～30 min，OD600 nm呈现缓慢下降趋势，菌株仍保持一定的存活能力，未达到杀菌效果；相比之下，在105、115、125 ℃条件下，短时处理（≤5 min或10 min）即可使OD600 nm迅速降至接近0，与赤水晒醋中腐败菌（枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌）需100 ℃处理35 min才能灭活[30]相比，菌株S-1 在更高温度区间内仍需一定时间才可达到类似灭活效果，体现出更强的温度耐受性。这一现象与Berendsen等[38]的研究结果相吻合，其证实枯草芽孢杆菌属的耐热芽孢能够在120 ℃以上的高温中存活，这种优异的耐热性主要源于其复杂的细胞外壁结构，包括厚实的芽孢衣和皮层组织，这些特殊结构可有效阻隔热传导对细胞核心的破坏作用[39]。因此，传统的低温长时间巴氏杀菌对该耐热菌的灭活效果有限，在实际生产中建议采用高温短时杀菌或二次杀菌工艺。
图9 杀菌时间对菌株S-1生长的影响
Fig. 9 Effect of sterilization time on the growth of strain S-1
3 结 论
本研究从腐败烧鸡中分离筛选出一株耐热菌，经系统的形态学观察、生理生化特性测定、16S rRNA基因测序鉴定为B. haynesii。该菌株的分离鉴定为B. haynesii与烧鸡腐败的关联性研究提供了参考。生长特性研究显示，低温、高盐可有效抑制该菌株的生长与繁殖，而采用105 ℃处理5 min可达到良好的灭菌效果。这些结果可为烧鸡生产中灭菌工艺优化及货架期延长提供科学依据。然而，当前研究仅聚焦于单一耐热菌的分离鉴定与实验室纯培养条件下的生长特性研究，尚未解析腐败烧鸡中耐热菌制腐机制，提出的杀菌方案未结合实际烧鸡加工进行验证。未来可研究菌株的致腐机制，结合生产场景评估灭菌工艺的适用性。
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