未漂洗鱼糜无漂洗工序，且与传统漂洗鱼糜相比，废水排放量大幅度减少，产品得率显著提高。但未漂洗鱼糜中残存大量内源性酶，包括蛋白酶、脂肪酶和核酸酶等，易水解蛋白、核酸、脂肪，致使未漂洗鱼糜品质劣化速率加快，贮藏保鲜难度大。冻藏未漂洗鱼糜品质变化及机制、保鲜技术，特别是天然保鲜剂研发等已成为研究热点[1-4]。
添加酶抑制剂是未漂洗鱼糜保鲜的有效方法[5]。Quan[6]、Benjakul[7]等发现，向鱼糜中添加蛋白酶抑制剂可以抑制鱼糜中的内源性蛋白酶，从而改善未漂洗鱼糜凝胶强度。但目前鲜见添加核酸酶抑制剂对未漂洗鱼糜品质影响的研究报道。核苷酸类代谢物是鱼肉中主要的滋味物质。其中ATP降解代谢物肌苷酸（inosine monphosphate，IMP）是鱼肉中代表性鲜味物质[8]。IMP不稳定，易在酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）[9]的作用下生成次黄嘌呤核苷（hypoxanthine nucleoside，HxR）和次黄嘌呤（hypoxanthine，Hx），最后在黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）的作用下生成尿酸（uric acid，UA）[10]。Hx、HxR和UA具有苦味，可能对未漂洗鱼糜的滋味品质有负面影响[11]。
Agbadua等[12]报道，葡萄多酚提取物（grape polyphenol extract，GPE）对ACP、XOD有一定抑制活性。GPE同时具有很强的抗氧化活性[13]，还可抑制鱼糜脂质氧化。所以，GPE可能是非常有效的未漂洗鱼糜保鲜剂，但其对未漂洗鱼糜品质的影响及机制还鲜见研究报道。植物多酚提取物组分比较复杂，其对食品品质的影响都是多组分、多靶点机制，识别其中的活性单体及靶点一直是研究中的难点。近年发展起来的代谢组学新技术通过差异代谢物识别和差异代谢途径富集分析，可快速识别靶点。
本研究将GPE添加到未漂洗鱼糜中，分析其对未漂洗鱼糜冻藏后的感官评分、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）-肽含量、硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值、ATP代谢物含量和K值等的影响，采用代谢组学技术识别GPE中的主要多酚单体及在冻藏未漂洗鱼糜中干预的代谢途径及关键代谢酶，并采用分子对接技术初步识别GPE中与关键代谢酶互作的活性多酚单体，为研发未漂洗鱼糜的天然保鲜剂提供理论依据及技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲜活草鱼（2～2.1 kg/尾） 市购；GPE（葡萄多酚含量（500.00±0.12）mg/g，以没食子酸当量计） 西安圣青生物科技有限公司。
高氯酸、氢氧化钠、氯化钠、TCA、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、磷酸二氢钾、甲醇、乙腈、乙酸铵、氨水（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯） 美国Tedia公司。
1.2 仪器与设备
5910R高速冷冻离心机 德国艾本德股份公司； AuY220电子分析天平 岛津（香港）有限公司；Prep 150LC Vanquish超高效液相色谱（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）仪 沃特世科技（上海）有限公司；TripleTOF-5600 Plus质谱（mass spectrometry，MS）仪 美国SCIEX公司；KQ-400BE数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；AQ-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）、液相色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm） 美国Waters公司。
1.3 方法
1.3.1 未漂洗鱼糜及冻藏鱼糜样品制备
参考Xu Pengfei等[14]的方法并稍作修改。将新鲜草鱼进行去鳞、去皮、去头、去尾处理后，立即用碎冰覆盖，1 h内手工取肉，用绞肉机打成鱼糜放入密封袋中冷藏（4 ℃），1 h内使用。
新鲜组：新鲜鱼糜加入0.25%（质量分数，以鱼糜质量计，下同）蒸馏水，混匀。
GPE组：通过预实验确定GPE添加量。新鲜鱼糜加入0.25% GPE，混匀，立即置于-18 ℃冻藏室冻藏，冻融循环处理3 次（在-18 ℃下冻藏12 h，然后在室温条件下解冻3 h，直至鱼糜中心温度在-5～-3 ℃之间，即为冻融1 次）。
对照组：新鲜鱼糜加入0.25%蒸馏水，混匀，立即置于-18 ℃冻藏室冻藏，冻融循环处理3 次。
1.3.2 感官评价
冷冻未漂洗鱼糜室温下解冻至中心温度4 ℃，蒸制15 min，取出冷却，进行感官评价[15]。新鲜组鱼糜直接蒸制。感官评价小组由经基础感官培训的10 名评价人员（男女各半）组成，参考Li Wenrong等[16]方法，将鱼糜样品切成厚度5 mm的薄片，进行感官评价。感官评分标准见表1。
表1 鱼糜感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation criteria for surimi
具有鱼肉特有的鲜味，无苦味90～100几乎无鱼肉鲜味，味微苦60～80无鱼肉鲜味，有明显苦味＜60评分标准感官评分鱼肉鲜味较淡，无苦味80～90
1.3.3 TCA-肽含量测定
TCA-肽含量可以作为评价鱼糜贮藏过程中蛋白质降解程度的指标。参考Gu Minghui等[17]的方法并稍作修改。取2.0 g鱼糜，加入18 mL 5 g/100 mL TCA溶液，10 000 r/min均质2 min，4 ℃静置1 h后，8 000 r/min离心5 min，用Lowry法测定上清液中肽的含量，TCA-肽含量以mg/kg表示。
1.3.4 TBARS值测定
参考Fu Xiangjin[18]、Sun Shan[19]等的方法并稍作修改。将15 g TCA和1.3 g TBA溶解在100 mL水中，在95 ℃加热10 min，溶解TBA，制备TCA-TBA溶液。将1 g样品加入到5 mL TCA-TBA溶液中，65 ℃水浴加热1 h，8 000 r/min离心15 min，取上清液，在532 nm波长处测定吸光度。以MDA为标准品制作标准曲线（y＝0.842 6x-0.003 6，R2＝0.999），TBARS值以mg/kg表示。所有实验均重复进行3 次。
1.3.5 鱼糜ATP代谢物靶向分析及K值的计算
参考Yokoyama等[20]的方法并稍作改动。取5 g样品置于离心管中，加入10 mL预冷后5%高氯酸溶液，匀浆预冷10 min，在4 ℃下2 900 r/min离心5 min，移取上清液。沉淀再用5%高氯酸重复上述操作提取，合并提取液，用超纯水定容至50 mL。用氢氧化钠饱和溶液调节pH值至6.0～6.4，过0.45 µm有机相滤膜后待测[21]。
采用高效液相色谱法对ATP代谢物进行靶向分析。色谱柱：AQ-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相由A相和B相组成，其中A相为磷酸二氢钾溶液（0.02 mol/L，pH 6.78），B相为甲醇；流动相总流速为1.00 mL/min，其中A相流速0.97 mL/min、B相流速0.03 mL/min，A相与B相体积比97∶3；检测波长设定为254 nm；柱温控制在30 ℃；进样量20 µL。
ATP代谢物含量参考Yokoyama等[20]的方法计算。
K值是鱼肉中常见的鲜度指标[22]，按下式计算：
式中：ATP、5’-二磷酸腺苷（5’-adenosine diphosphate，ADP）、5’-一磷酸腺苷（5’-adenosine monophosphate，AMP）、IMP、HxR和Hx分别为对应物质的含量/（mg/kg）[23]。
1.3.6 非靶向代谢组学分析
称取25 mg样品于离心管中，加入500 μL提取液（甲醇∶乙腈∶水＝2∶2∶1（V/V），含同位素标记内标混合物），35 Hz研磨处理4 min，超声5 min（冰水浴）；重复上述步骤3 次后，于-40 ℃静置1 h；离心（4 ℃、13 800×g）15 min，取上清于进样瓶中上机检测。
采用UPLC-MS/MS对代谢物组进行非靶向检测：液相色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相A为水相（含25 mmol/L乙酸铵和25 mmol/L氨水），流动相B为乙腈；柱温箱温度设为40 ℃，样品盘温度维持4 ℃，进样体积2 μL。采用梯度洗脱方式，流动相总流速恒定为0.50 mL/min。梯度洗脱程序设置如下：0.00～0.25 min，95% B；0.25～3.50 min，线性梯度降至65% B；3.50～4.00 min，线性梯度降至40% B；4.00～4.50 min，保持40% B；4.50～4.55 min，快速回升至95% B；并在95% B条件下平衡至6.00 min。
MS仪参数如下：鞘气流速50 arb，辅助气流速15 arb，毛细管温度320 ℃，全扫描分辨率60 000，二级MS分辨率30 000，归一化碰撞能量模式，碰撞能量20/30/40，喷涂电压3 kV（正离子模式）或-3 kV（负离子模式）；随后，通过峰提取、内标校正和总离子强度归一化处理后，以对照组为参考基准，计算各代谢物在新鲜组和GPE组中的相对含量。
1.3.7 分子对接
从蛋白质数据库（protein data bank，PDB）（http://www.rcsb.org）获得腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）和ACP的晶体结构，并用AutoDock软件对ADA（PDB ID：1VFL）、ACP（PDB ID：1D2T）[24]进行加氢、去水等操作后，与从GPE组鱼肉中筛选出的多酚单体进行分子对接。使用Discovery Studio 2019软件生成分子对接可视图。
1.4 数据处理
每组实验重复3 次，用Excel软件计算平均值及标准差。使用SIMCA软件（V16.0.2，Sartorius Stedim Data Analytics AB，Umea，Sweden）对代谢组学数据进行对数转换加中心化格式化处理，然后进行正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），识别差异代谢物。用GraphPad Prim 8、SMICA、Discovery Studio 2019软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 GPE对冻藏未漂洗鱼糜感官评分、TCA-肽含量和TBARS值的影响
鲜味是鱼肉的突出滋味品质特征。如图1A所示，新鲜鱼糜感官评分为92.0±6.1，鲜味突出；经过冻藏的对照组鱼糜感官评分为79.0±7.7，已经出现苦味；而GPE组鱼糜冻藏后感官评分为90.0±6.5，滋味较好，无苦味；3 组感官评分存在显著差异（P＜0.05）。这表明GPE有效抑制未漂洗鱼糜苦味的产生，并有助于未漂洗鱼糜保持鲜味。葡萄多酚具有较强的抗氧化、抑菌作用[13]，能抑制鱼糜中脂质氧化、蛋白质降解，但GPE有效改善冻藏未漂洗鱼糜滋味品质是本研究新发现。
图1 GPE对冻藏未漂洗鱼糜感官评分（A）、TCA-肽含量（B）和TBARS值（C）的影响
Fig. 1 Effect of GPE on sensory score (A), TCA-peptide content (B), and TBARS value (C) of FUS
TCA-肽含量是反映鱼糜冻藏过程中蛋白质降解程度的重要指标。冻融过程中，未漂洗鱼糜中的内源性蛋白酶使鱼糜蛋白质分解成小分子的肽，破坏蛋白质结构，降低鱼糜的凝胶强度。如图1B所示，新鲜组鱼糜TCA-肽含量为（796.00±22.91）mg/kg，蛋白质降解程度较低。对照组鱼糜TCA-肽含量为（1 476.00±39.69）mg/kg，加入GPE的冻藏鱼糜TCA-肽含量为（1 326.00±30.00）mg/kg，有所降低，说明GPE可以在冻藏过程中抑制蛋白质降解，提高鱼糜品质。
TBARS值可以反映鱼糜制品脂质氧化程度。如图1C所示，新鲜组鱼糜TBARS值为（0.181±0.008）mg/kg，说明未漂洗鱼糜的脂质氧化程度极低[25]；经过冻藏的对照组鱼糜TBARS值为（0.536±0.034）mg/kg，脂质氧化较严重；而GPE组TBARS值仅为（0.232±0.013）mg/kg， 远低于对照组，与新鲜组鱼糜接近，说明GPE有效抑制了鱼糜脂质氧化。
2.2 GPE对冻藏未漂洗鱼糜ATP代谢物含量及K值的影响
如表2所示，新鲜鱼糜中ATP、IMP、HxR含量及K值分别为（202.68±25.64）、（1 435.90±9.62）、（37.97±0.15）mg/kg和（2.81±0.32）%。对照组鱼糜的ATP含量为（75.95±0.83）mg/kg，而GPE组鱼糜ATP含量为（129.44±5.85）mg/kg，说明GPE可以有效抑制鱼糜中ATP的降解。对照组ADP含量与GPE组含量接近，对照组和GPE组的AMP含量分别为（70.11±0.76）、 （66.62±1.86）mg/kg，这可能是GPE抑制了ADP降解为AMP。对照组IMP含量为（1 210.78±28.14）mg/kg，低于GPE组的（1 435.46±19.86）mg/kg。在传统漂洗工艺中，鱼糜内大部分IMP被漂洗掉，导致鱼糜滋味较淡。而在未漂洗鱼糜工艺中，鱼糜中保留了大部分IMP。IMP可进一步降解为HxR，GPE组HxR含量为（66.91±2.91）mg/kg，显著低于对照组的（85.93±3.56）mg/kg；由于HxR与苦味呈正相关，其含量越高，鱼肉苦味越重[26]。以上研究结果表明，GPE能够有效抑制嘌呤代谢途径中的IMP降解，减少HxR、Hx的产生。K值可以代表水产品的新鲜程度，K值越低，新鲜程度越高。对照组鱼糜K值为（17.58±0.21）%，而加入GPE后，鱼糜的K值为（13.79±0.24）%，说明GPE能够有效抑制鱼糜K值的增长。
表2 GPE对冻藏未漂洗鱼糜ATP及其关联物降解代谢的影响
Table 2 Effects of GPE on the degradation and metabolism of ATP and its related substances in FUS
组别ATP含量/ADP含量/AMP含量/IMP含量/Hx含量/HxR含量/（mg/kg）（mg/kg）（mg/kg）（mg/kg）（mg/kg）（mg/kg）K值/%新鲜组202.68±25.64 a 174.35±24.07 a 90.71±14.18 a 1 435.90±9.62 a 15.22±5.09 c 37.97±0.15 c 2.81±0.32 c对照组75.95±0.83c70.96±3.00b70.11±0.76b1 210.78±28.14b218.63±5.56a85.93±3.56a17.58±0.21a GPE组129.44±5.85b70.55±2.32b66.62±1.86b1 435.46±19.86a203.54±9.09b66.91±2.91b13.79±0.24b
注：同列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
2.3 GPE对冻藏未漂洗鱼糜干预的代谢通路
采用OPLS-DA法对UPLC-MS/MS结果进行分析，并对模型进行置换检验，确保模型的可靠性；以变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）＞1、 P＜0.05、差异倍数（fold change，FC）＞2或FC＜0.5为条件筛选差异代谢物。
如图2所示，两两比较的鱼糜样品均分布在不同象限，在OPLS-DA得分图中可完全分开，说明添加GPE组鱼糜与未作处理的鱼糜相比，代谢物组发生了很大变化。所有样本均落在95%置信区间内，且
，Q2＞0.5，说明OPLS-DA能解释和预测2 组之间的差异，且模型可靠，预测能力强。
图2 不同组鱼糜代谢物OPLS-DA得分图
Fig. 2 Orthogonal partial least squares discriminant analysis score plots showing variation in metabolite profile among different groups of surimi
如图3A所示，对照组和新鲜组鱼糜代谢物比较，共筛选出95 种差异代谢物，包括氨基酸类（10.23%）、脂类（35.23%）、核苷酸类（11.36%）、黄酮类（3.41%）、生物碱类（4.55%）、糖类（14.77%）、有机酸（11.36%）及其他物质（9.09%）。如图3B所示，GPE组和新鲜组鱼糜代谢物比较，共筛选出120 种差异代谢物，包括氨基酸类（5.00%）、脂类（34.17%）、糖类（15.00%）、核苷酸及其衍生物（5.83%）、有机酸（4.17%）及其他物质（35.83%）。GPE组鱼糜中检测到多酚及其类似物6 种，分别为甘草素、5-羟基黄酮、山药素I、香草酸、儿茶素和2-甲氧基-4-乙烯苯酚。
图3 不同组鱼糜差异代谢物火山图
Fig. 3 Volcano plots of differential metabolites among different groups of surimi
如图3C所示，GPE组和对照组代谢物比较，共筛选出44 种差异代谢物，包括氨基酸类（6.82%）、脂类（18.18%）、糖类（38.64%）、核苷酸及其衍生物（4.55%）、有机酸（13.64%）及其他物质（18.17%）。
将筛选出的差异代谢物进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，如图4A所示，对照组冻藏未漂洗鱼糜和新鲜组鱼糜比较，新陈代谢途径、ABC转运蛋白、甘油磷脂代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢、亚油酸代谢等8 条代谢通路具有显著差异（P＜0.05）。新陈代谢途径有显著差异（P＜0.05），表明未漂洗鱼糜在冻藏过程中发生了大量代谢，可能是因为未漂洗鱼糜中存在大量活性酶。总体而言，冻藏未漂洗鱼糜在贮藏过程中，脂肪、核苷酸类物质代谢途径有显著差异，与鱼糜中脂质易降解、氧化，核苷酸类易降解转化的研究报道一致。乙醛酸和二羧酸代谢、半乳糖代谢、丁酸代谢有显著差异，表明未漂洗鱼糜中一直在发生无氧酵解。氨基酸类代谢途径有显著差异，表明蛋白质在降解。
图4 不同组鱼糜差异代谢物KEGG通路富集分析（前15 条通路）
Fig. 4 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway enrichment analysis of differential metabolites among different groups of surimi (top 15 pathways)
如图4B所示，GPE组鱼糜和新鲜组鱼糜比较，新陈代谢途径、ABC转运蛋白、甘油磷脂代谢、嘌呤代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、碳代谢、淀粉与蔗糖代谢等代谢通路有显著差异（P＜0.05）。
如图4C所示，GPE组鱼糜和对照组鱼糜比较，ABC转运蛋白、咖啡因代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、磷酸戊糖途径、淀粉和蔗糖代谢、嘌呤代谢、半乳糖代谢10 条代谢通路有显著差异（P＜0.05）。表明添加GPE后，未漂洗鱼糜中脂质氧化降解、糖类无氧酵解、核苷酸降解等均被有效抑制。而且，添加GPE后，鱼糜中咖啡因代谢途径被显著富集。咖啡因代谢与ATP代谢密切连接，咖啡因通过一系列途径转化成黄嘌呤，进入嘌呤代谢通路；嘌呤代谢通路中的黄嘌呤转化成黄嘌呤核苷，接着转化成 7-甲基黄嘌呤核苷，再转化成7-甲基黄嘌呤，进入咖啡因代谢通路。GPE组鱼糜与对照组鱼糜相比，其中核苷酸及其类似物差异代谢物有2 种，分别为7-甲基黄嘌呤和 N4-乙酰胞苷，其水平均上调。
鱼肉中的ATP在鱼死亡后经过嘌呤代谢途径逐步降解为ADP、AMP、IMP等，IMP为鲜味物质，能够提升鱼肉制品的鲜味。AMP、IMP再经嘌呤代谢酶如ADA、磷酸酶等降解为具有苦味的HxR、Hx等，造成鱼肉制品的感官品质下降，影响产品滋味。因此，嘌呤代谢对鱼肉制品的滋味影响较大。本研究对不同组别鱼糜的嘌呤代谢途径进行更深入的分析，如图5所示，与GPE组鱼糜相比，对照组鱼糜中IMP和腺苷相对含量均升高，Hx相对含量明显升高，这是导致鱼糜鲜味程度下降的关键。此外，腺苷在ADA的作用下，不可逆降解成HxR。但对照组鱼糜中HxR相对含量高于新鲜组和GPE组，推测可能是因为核糖水解酶活性较高，加快了HxR的降解，生成Hx，引起Hx累积。
图5 不同组鱼糜嘌呤代谢通路对比图
Fig. 5 Comparison of purine metabolic pathways in different groups of surimi
与新鲜组鱼糜相比，GPE组鱼糜IMP相对含量无较大变化，推测是由于GPE抑制了ACP活性，从而抑制了IMP降解；然而腺苷相对含量依旧下降，但HxR相对含量有所升高，但升高幅度有限，推测是由于GPE抑制了ADA活性，同时腺苷也可通过腺嘌呤途径降解为Hx，导致Hx累积。其中，Hx的FC为2.93，但对照组、新鲜组鱼糜差异代谢物相比，Hx的FC为3.22，由此可以验证GPE对Hx的累积存在抑制作用。
与对照组鱼糜相比，GPE组鱼糜中核苷酸及其类似物的相对含量呈现差异化变化。其中，IMP和腺苷相对含量有所上调，而HxR和Hx相对含量则有所降低。GPE组鱼糜腺苷相对含量升高，而HxR相对含量降低，因此可以推测GPE对ADA有抑制作用，从而抑制苦味物质的产生，延缓鱼糜滋味劣化。
2.4 多酚单体与靶点酶的分子对接验证
本研究将GPE组鱼糜中含有的多酚单体与ADA、ACP进行分子对接，如表3所示，甘草素、儿茶素、5-羟基黄酮、山药素I与ADA的分子对接结合能分别为-29.58、-28.24、-27.99、-24.10 kJ/mol，与ACP的分子对接结合能分别为-26.78、-24.35、-27.20、-21.59 kJ/mol，其互作方式主要是氢键和疏水相互作用[27]。这表明以上4 种多酚单体可能与ADA、ACP结合较强，再由代谢组学及其他数据推测，这几种多酚单体对ADA、ACP具有较强的抑制作用。
表3 多酚单体与ADA、ACP的结合能
Table 3 Binding energies of polyphenols with ADA and ACP
kJ/mol1甘草素-29.58-26.78序号多酚单体与ADA的结合能与ACP的结合能2儿茶素-28.24-24.3535-羟基黄酮-27.99-27.204山药素I-24.10-21.59
Ouyang Hui等[28]发现，洋葱多酚对XOD的活性具有较强的抑制作用。Li Yibin等[29]测定李子多酚对XOD的抑制作用，发现李子多酚可以作为潜在的天然XOD抑制剂。Lin Suyun等[30]研究发现，白杨素、芹菜素对XOD的抑制效果较好，其中白杨素的半抑制浓度为1.26 μmol/L，远低于对照组的2.93 μmol/L。
3 结 论
本研究向冻藏未漂洗鱼糜中加入GPE，探究其对未漂洗鱼糜冻藏过程中滋味的影响及其机制。研究发现，GPE能抑制冻藏未漂洗鱼糜滋味品质劣化。非靶向代谢组学识别出GPE能干预冻藏未漂洗鱼糜的嘌呤代谢途径，ATP代谢途径靶向分析证实GPE可有效抑制AMP和鲜味物质IMP降解为苦味的HxR、Hx，其机制可能是GPE中的甘草素、儿茶素、5-羟基黄酮、山药素I抑制了ADA、ACP的活性，减缓Hx、HxR等苦味物质的产生，从而有利于冻藏未漂洗鱼糜滋味品质。
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