草鱼（Ctenopharyngodon idella）作为我国最重要的淡水经济鱼类之一，其养殖规模常年位居世界前列[1]。在我国南方地区，草鱼是加工鱼丸、鱼糕等传统鱼糜制品的主要原料[2]。然而，草鱼鱼糜在加工过程中易发生凝胶劣化现象，导致产品质构特性下降，严重影响其商业价值[3]。鱼糜凝胶劣化效应呈现显著的季节性变化规律。Itoh等[4]发现夏季捕获的狗母鱼（Saurida wanieso）制成的鱼糜凝胶强度显著低于冬季样品，表明高温季节鱼糜更易发生凝胶劣化。类似地，He Yating等[5]指出，夏季捕捞的鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）制备的鱼糜凝胶相较于冬季样品凝胶强度更低，断裂距离更大。这些现象提示鱼糜凝胶劣化可能与鱼类肌肉内部生理状态的季节性变化密切相关。
鱼类肌肉中存在一类肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（myofibril-bound serine proteinase，MBSP），其与肌原纤维蛋白结合紧密，难以通过常规漂洗工艺去除[6]。MBSP可降解肌原纤维蛋白，被认为是导致鱼糜凝胶劣化的重要原因[7]。MBSP活性也呈现明显的季节性差异。Jiang Xinjing等[8]研究发现，鲫鱼（Carassius auratus）MBSP活性在不同捕捞季节之间存在显著差异，但未明确其具体规律。Ohkubo等[9]在研究狗母鱼（Saurida undosquamis）鱼糜时也观察到鱼糜凝胶性能和MBSP活性均存在季节性波动，并强调进一步探究MBSP季节性变化规律对完善凝胶劣化机制研究具有重要意义。
目前，关于鱼类MBSP调控鱼糜凝胶劣化的研究在季节差异性方面仍存在较大局限。然而，在实际生产过程中，季节效应在原料供应或差异化处理中具有决定性影响。因此，本研究拟从夏季与冬季草鱼中提取MBSP，系统比较其酶学特性的季节性差异，以期为优化草鱼鱼糜生产加工流程提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲜活养殖草鱼（水库养殖，草鲢鳙鲫混养模式）16 条，（1.5±0.3）kg/条，于2024年12月（冬季）和2025年7月（夏季）购于北京市海淀区农贸市场。所有实验操作均符合动物伦理规范，屠宰前用木槌将鱼迅速击昏以减轻其应激反应，宰杀后立即取背部骨骼肌，并立即用于粗酶提取。
磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、酶促反应终止剂现配现用；MCA荧光底物（Boc-Phe-Ser-Arg-MCA，稀释至10 mmol/L于4 ℃贮存待用） 日本Peptide Institute公司；氢氧化钠、硫酸铵（均为分析纯）上海麦克林生化科技股份有限公司；PC0020-50T二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
FB 10A型绞肉机 浙江苏泊尔股份有限公司；T10型高速均质机 德国IKA公司；Allegra C-34R型离心机美国贝克曼库尔特有限公司；FE 20型pH计、AR2140型分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Supermax 3000FA型酶标仪 上海闪谱生物科技有限公司；F97 Pro型荧光分光光度计 上海棱光技术有限公司；W-201B型恒温水浴锅 上海申生科技有限公司；BCD-251WBCY型冰箱 青岛海尔股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 草鱼MBSP粗酶提取及硫酸铵沉淀条件确定
参考Osatomi等[10]的方法并作适当修改。取100 g新鲜草鱼背肌，用绞肉机搅碎成泥后加入3 倍体积的25 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4），4 ℃、8 000×g离心10 min，弃去上清液，漂洗。反复均质和离心至漂洗液中无法检出丝氨酸蛋白酶活性，以确保后续提取物为纯化的MBSP。取沉淀物于3 倍体积的25 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.4，含0.5 mol/L KCl、1 mmol/L MgCl2和5 mmol/L Na4P2O7）中匀浆，水浴加热至中心温度达45 ℃，孵育5 min，随后于冰水混合物中迅速冷却，4 ℃搅拌1 h，静置30 min后用3 mol/L盐酸溶液调节至目标pH值（pH 4.0、5.5），4 ℃静置2 h，4 ℃、8 000×g离心20 min，取上清液并调节pH值至7.5。采用硫酸铵梯度盐析法对粗酶提取液进行初步纯化，以10%饱和度为梯度，逐步向粗酶提取液中加入硫酸铵粉末并搅匀，逐级收集上清液与沉淀，将沉淀溶于50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0），使用10 kDa截留分子质量的半透膜在50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中透析过夜，去除残留盐离子，即得MBSP。
1.3.2 酶液蛋白质量浓度测定
参照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书测定酶液蛋白质量浓度。
1.3.3 酶活性测定
参考Guo Chuan等[11]的方法并略作修改。将100 μL MBSP加入800 μL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0），随后加入100 μL 10 mmol/L Boc-Phe-Ser-Arg-MCA启动反应，45 ℃孵育20 min；空白组以等量蒸馏水替代粗酶液。孵育结束后，立即加入1.5 mL终止剂（甲醇∶正丁醇∶蒸馏水＝35∶30∶35，V/V），避光冷却至室温，采用荧光分光光度计在380 nm激发波长和450 nm发射波长下测定酶解反应释放的7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）荧光强度。一个酶活单位被定义为每分钟释放0.1 nmol AMC所需酶量[12]。以未加硫酸铵的粗酶提取液中酶活为基准（100%）计算相对酶活。
1.3.4 草鱼MBSP最适温度的季节性差异
分别取冬季和夏季捕捞草鱼制备的MBSP酶液。将50 μL酶液与100 μL Boc-Phe-Ser-Arg-MCA混合，按1.3.3节方法，分别在30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃孵育后，测定酶活性。分别以40 ℃与45 ℃酶活性为基准（100%），计算冬季与夏季草鱼MBSP在不同孵育温度下的相对活性。
1.3.5 草鱼MBSP最适pH值的季节性差异
分别取冬季和夏季草鱼MBSP。将100 μL酶液分别与800 μL pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液混合，加入100 μL 10 mmol/L Boc-Phe-Ser-Arg-MCA启动反应，按1.3.3节方法测定酶活性。分别以pH 8.0、9.0条件下的酶活性为基准（100%），计算冬季与夏草鱼MBSP在不同pH值条件下的相对活性。
1.3.6 草鱼MBSP温度稳定性的季节性差异
分别取冬季和夏季草鱼MBSP。按1.3.3节方法，分别于-20、4、30、40、50、60、70 ℃孵育30 min后，测定酶活性。以-20 ℃酶活性为基准（100%），计算冬季与夏季草鱼MBSP在不同温度下的相对活性。
1.3.7 盐离子含量对不同季节草鱼MBSP活性的影响
分别取冬季和夏季草鱼MBSP。将100 μL MBSP分别加入800 μL含0、5、10、15、20、25、30、35、40 g/L NaCl的Tris-HCl缓冲液，随后加入100 μL 10 mmol/L Boc-Phe-Ser-Arg-MCA，按1.3.3节方法测定酶活性。以未添加NaCl下酶活性为基准（100%），分别计算冬季与夏季草鱼MBSP在不同盐离子含量下的相对活性。
1.3.8 金属离子浓度对不同季节草鱼MBSP活性的影响
将100 μL MBSP加入800 μL含不同浓度KCl与CaCl2的Tris-HCl缓冲液（反应体系中K+与Ca2+终浓度分别为0.1 mmol/L与0.5 mmol/L），加入100 μL 10 mmol/L Boc-Phe-Ser-Arg-MCA，按1.3.3节方法测定酶活性。以未添加金属离子时酶活性为基准（100%），分别计算冬季与夏季草鱼MBSP在不同金属离子浓度下的相对活性。
1.4 数据处理
实验设置3 组平行与3 次重复，采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析，采用GraphPad Prism 8软件绘制图表。
2 结果与分析
2.1 硫酸铵梯度盐析条件的确定
草鱼MBSP粗酶提取液硫酸铵盐析曲线表明，30%～60%硫酸铵梯度沉淀可较大程度去除杂蛋白并富集MBSP。如图1所示，随着硫酸铵饱和度的增加，上清液蛋白质含量与MBSP相对活性均呈下降趋势，表明MBSP发生逐级沉淀。当硫酸铵饱和度达到40%时，上清液MBSP相对活性出现显著降低（P＜0.05），提示硫酸铵饱和度达到30%时，MBSP已开始大量析出。而当饱和度提升至70%后，上清液MBSP相对活性基本保持不变（P＞0.05），表明硫酸铵饱和度达到60%后，大部分MBSP已沉淀。因此，最终确定硫酸铵梯度盐析法的硫酸铵饱和度范围为30%～60%。该结果与Cao Minjie等[13]纯化狗母鱼（S. wanieso）MBSP的条件基本一致，验证了该方法的普适性。
图1 草鱼MBSP粗酶提取液硫酸铵盐析曲线
Fig. 1 Ammonium sulfate salting curve of crude enzyme extract of MBSP from grass carp
2.2 草鱼MBSP最适温度的季节性变化
由图2可知，虽然冬季与夏季草鱼MBSP相对活性随温度变化规律基本一致，但在极端温度下仍存在明显差异。具体而言，夏季草鱼MBSP最适温度（45 ℃）较冬季样品（40 ℃）向高温方向偏移。从整体来看，草鱼MBSP与鲤鱼[10]、鲢鱼[14]等淡水鱼来源MBSP最适温度（55 ℃左右）基本一致，但表现出明显的季节适应性特征：冬季草鱼MBSP在40～45 ℃区间较夏季样品展现出更高的活性，但在55 ℃以上的较高反应温度下相对活性较低，这一差异与鱼糜凝胶品质的季节性变化情况高度吻合。Jiang Xinjing等[8]研究发现，在相同孵育温度（55 ℃）下，6月捕捞的鲫鱼肌原纤维蛋白相较于2月的自降解速率提高6 倍，这与本研究中夏季（7月）草鱼MBSP在较高温度范围（55～70 ℃）内仍能保持更高活性的结果一致。这一发现为鱼糜生产加工温度调控提供重要依据：针对夏季草鱼原料肉，建议在二段式加热工艺中强化中低温段控制力度，以抑制MBSP对肌原纤维蛋白的过度降解，从而改善高温季节鱼糜产品的凝胶品质。这种差异化的温度策略与不同季节来源草鱼鱼肉原料生理特性差异[15]相匹配，有望成为提升鱼糜制品质量稳定性的有效手段。
图2 草鱼MBSP最适温度的季节性变化
Fig. 2 Seasonal variations of the optimal temperature of grass carp MBSP
2.3 草鱼MBSP最适pH值的季节性变化
如图3所示，冬季与夏季草鱼MBSP相对活性随pH值变化规律基本一致，但在强碱及弱酸条件下仍表现出明显差异。从整体来看，冬季与夏季草鱼MBSP的最适pH值分别为8.0、9.0，与鲤鱼[10]、鲢鱼[14]等淡水鱼来源MBSP基本一致，属于碱性蛋白酶[16]；二者活性变化趋势相似，表明其催化中心对pH值的敏感性不受季节显著影响。然而，冬季草鱼MBSP在pH 5.0～7.0和pH 10.0～12.0下表现出更低的相对活性。极端pH值导致的酶活性丧失主要归因于蛋白质原始构象的改变[17]，夏季草鱼MBSP构象相较于冬季样品在pH值波动时更加稳定，这可能归因于不同季节来源草鱼MBSP蛋白结构存在差异。Gerlach等[18]研究指出，鲤鱼能够根据水体温度变化调整蛋白异构体基因表达，从而通过微调蛋白结构适应外界环境温度变化。本研究中，草鱼应对冬季与夏季水体温度变化的生理活动调节过程可能同样涉及MBSP在转录水平上的表达调控。草鱼通过在不同季节转录生成不同MBSP异构体RNA，最终导致不同季节来源草鱼MBSP呈现出相应的酶学特性差异[19]。在鱼糜生产加工过程中，鱼浆pH值基本维持在中性[20]，冬季草鱼MBSP的天然低活性特性可有效减轻凝胶劣化风险，这为季节性原料的差异化处理提供了理论依据。
图3 草鱼MBSP最适pH值的季节性变化
Fig. 3 Seasonal variations of the optimal pH of grass carp MBSP
2.4 草鱼MBSP温度稳定性的季节性变化
如图4所示，冬季与夏季草鱼MBSP在低温（-20、4 ℃）贮藏条件下的相对活性均无显著差异（P＞0.05），均保持较高稳定性；在30～40 ℃中温范围内，随着温度的升高，冬季草鱼MBSP相对活性显著降低（P＜0.05），而夏季草鱼MBSP相对活性虽有小幅下降，但差异不显著（P＞0.05）；在50～70 ℃高温范围内，随着温度的升高，冬季与夏季草鱼MBSP相对活性均呈显著下降趋势（P＜0.05），以冬季草鱼MBSP相对活性更低，其经60 ℃处理后相对活性仅为50%。蛋白高温失活主要源于高温对蛋白质分子内维持空间结构的化学键造成的不可逆破坏[21]，不同季节来源草鱼MBSP热稳定性差异同样可能归因于鱼体为适应季节温度变化对MBSP异构体蛋白表达的调控，这些季节性表达的异构体在氨基酸残基组成及表面电荷分布上存在差异，特别是关键功能位点的带电残基数量变化，这些结构特征差异直接影响蛋白质分子的热稳定性[22]。Tao Yan等[23]在3 种淡水鱼（鲢鱼、草鱼和鲫鱼）Ca-ATPase稳定性研究中也观察到类似现象，同种鱼来源Ca-ATPase稳定性在不同季节表现出明显差异，冬季鱼Ca-ATPase热失活和冷失活速率常数可达夏季的10 倍以上。从生理学角度看，这种肌肉蛋白结构与特征季节性调节机制是变温动物能够在环境温度波动时维持肌肉灵活性的重要原因之一。天然条件下，鱼类MBSP可能参与肌原纤维蛋白周转与更新，而对MBSP活性的季节性调控，也可能是鱼类适应环境温度变化的重要生理机制之一[24]。在夏季等高温季节，草鱼MBSP更耐高温失活，而在冬季等低温季节，草鱼MBSP结构相对脆弱，从而使鱼体在环境温度变化时可及时调控肌肉蛋白功能[18]。在鱼糜高温漂烫（如60 ℃）时，夏季草鱼原料肉中MBSP仍可能保持较高活性，因此需结合快速加热或添加蛋白酶抑制剂等手段，以减少其对凝胶品质的负面影响。
图4 草鱼MBSP温度稳定性的季节性变化
Fig. 4 Seasonal variations of the stability of grass carp MBSP
2.5 盐离子含量对草鱼MBSP相对活性影响的季节性变化
如图5所示，随着NaCl含量的增加，冬季和夏季MBSP相对活性均呈显著下降趋势（P＜0.05），但表现出明显的季节差异特征。在鱼糜加工常规盐质量浓度范围（5～15 g/L）内，冬季草鱼MBSP相对活性下降更为显著。盐离子可通过改变酶蛋白表面静电相互作用影响其催化活性[25]，冬季草鱼MBSP可能因其特定结构特征而对盐离子引起的微环境变化更敏感。传统鱼糜加工过程中，添加食盐不仅促进肌原纤维蛋白溶出[26]，同时也能部分抑制MBSP活性。但针对夏季原料，可能需要适当提高盐含量才能达到与冬季原料相当的酶活性抑制效果。
图5 NaCl含量对草鱼MBSP活性影响的季节性变化
Fig. 5 Seasonal variations of the effect of NaCl concentration on MBSP activity in grass carp
2.6 金属离子浓度对草鱼MBSP相对活性影响的季节性变化
如图6所示，K+与Ca2+对夏季草鱼MBSP活性存在显著促进作用（P＜0.05），且高浓度（5.0 mmol/L）金属离子较低浓度（0.1 mmol/L）活性促进作用更强。低浓度条件下，K+与Ca2+对冬季草鱼MBSP活性促进作用不显著（P＞0.05），当金属离子浓度提高至5.0 mmol/L后，才产生明显的活性促进作用。K+与Ca2+对鱼类MBSP活性的促进作用与大黄鱼MBSP[27]基本一致，由于鱼类MBSP具有金属蛋白酶属性[28-29]，其活性受K+与Ca2+等金属离子影响。从生理适应角度分析，温度季节性变化显著影响鱼体代谢，尤其是蛋白质代谢、能量消耗及金属离子生物可利用性等[30]。夏季高温环境加速草鱼代谢活动，为维持肌肉蛋白高效更新与重塑，MBSP对金属离子的敏感性可能会相应增强[31]。相反，冬季低温导致代谢减缓，MBSP可能需要更高浓度的金属离子才能达到同等激活水平。
图6 金属离子浓度对草鱼MBSP活性影响的季节性变化
Fig. 6 Seasonal variations of the effect of mental ions concentration on MBSP activity in grass carp
3 结 论
本研究系统分析草鱼MBSP的酶学特性及其季节性差异。通过硫酸铵梯度盐析法从粗酶提取液中富集草鱼MBSP的最佳硫酸铵饱和度范围为30%～60%。总体来看，冬季（12月）与夏季（7月）草鱼MBSP最适温度分别为40、45，最适pH值分别为8.0、9.0，均具有较好的温度稳定性，但Na+（0～40 g/L）可显著抑制其活性，而5.0 mmol/L K+、Ca2+则能显著促进其活性（P＜0.05）。不同季节来源草鱼MBSP酶学特性存在着显著差异，相较于夏季草鱼MBSP，冬季草鱼MBSP在45 ℃以上的中高温及弱酸、碱性条件下的活性更低；热稳定性更差；对金属离子的激活响应更为迟钝，这些差异可能与鱼类为适应季节温度变化而进行的生理调节有关，包括MBSP异构体的选择性表达及蛋白结构的适应性改变。本研究揭示了草鱼MBSP活性的季节性变化规律，为深入理解草鱼鱼糜凝胶品质的季节性波动提供了分子层面的解释，对优化季节性鱼糜加工工艺具有重要指导意义，特别是为针对不同季节原料制定差异化的温度控制、pH值调节和离子添加策略提供了理论依据。
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