肉类及其制品作为全球广泛消费的食品,富含蛋白质、脂肪、维生素及多种人体必需营养成分[1]。近年来,肉类掺假引发的食品安全和质量问题备受关注。2013年欧洲“马肉风波”成为公众聚焦肉类掺假问题的关键事件,此后类似事件不断涌现[2-5]。不法分子常利用肉类外观相似性实施欺诈,通过添加剂使用以低价肉模仿高价肉风味并牟取暴利[6]。这些行为不仅扰乱市场秩序,还可能引发严重的食品安全问题[7]。因此,对肉及肉制品进行精准的种属鉴定,研究与开发高效、灵敏的肉类掺假检测技术已成为该领域研究热点。
现有肉类掺假检测方法主要包括:基于核酸的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、多重PCR、实时荧光定量PCR、微滴式数字PCR等;基于蛋白质的酶联免疫吸附法、质谱法;以及电子鼻、红外光谱和高光谱成像等无损检测技术[8-10]。然而,这些方法在实际应用中均存在明显局限:核酸检测往往需要专业的实验室设备且检测周期较长;蛋白质检测易受样品加工工艺影响,且酶联免疫吸附法易出现假阳性问题[11];无损检测技术虽操作简便,但普遍存在准确度和稳定性不足等问题。这些局限性使现有技术难以满足公安机关现场快速检测的实际需求[12]。因此,建立肉类掺假快速且高效的即时检测(point-of-care test,POCT)方法,对提升肉类掺假的鉴定效率、加强食品安全监管具有重要的现实意义。
成簇规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)组成的CRISPR/Cas系统是原核生物获得性免疫系统的一种形式,现已成为分子诊断领域的革命性工具[13]。目前已开发出SHERLOCK[14]、DETECTR[15]、HOLMES[16]等多种核酸检测平台,可实现对单碱基差异的高特异性识别,以及对低至阿摩尔水平靶标的高灵敏度检测,且无需复杂仪器即可实现现场检测,已逐步应用于肉类掺假鉴定[17-18]。本文将介绍CRISPR/Cas系统组成、分类及检测原理,重点总结CRISPR/Cas技术在肉类掺假检测中的研究进展,并根据不同扩增策略及信号传导方法进行分类(图1)。此外,本文还将探讨CRISPR/Cas技术在法医物证领域的技术优势并对现存问题进行分析和展望。
图1 基于不同策略的CRISPR/Cas肉类掺假检测应用及其操作流程图
Fig. 1 Application and operational flow chart of CRISPR/Cas based on different strategies for meat adulteration detection
CRISPR/Cas系统源自原核生物抵御噬菌体威胁的获得性免疫机制,现已发展成为一种高效、精准的核酸检测技术[19]。目前,CRISPR/Cas系统分为2 类、6 型[20]。其中,属于V型系统的Cas12a(又称Cpf1)在肉类掺假检测领域中的应用尤为广泛。Cas12a含1 个RuvC核酸酶结构域,能够在crRNA引导下与前间隔序列邻近基序(prespacer sequence adjacent motif,PAM)为5’-TTTV-3’的靶标DNA相结合并切割目标序列,这种切割也称顺式切割。当Cas12a的顺式切割活性被激活后,会同时激活其反式切割活性,以非特异性形式切割体系中的ssDNA。基于这一机制,研究者设计了荧光标记的ssDNA报告子,其一端修饰荧光基团,另一端修饰猝灭基团。当Cas12a的反式切割活性被激活后,报告子被切断,荧光基团与猝灭基团分离,释放荧光信号,从而实现对靶标DNA的高灵敏度检测[21-22]。
CRISPR/Cas系统的关键优势在于能够通过设计与筛选特异性crRNA序列,使Cas蛋白精准识别不同物种肉类的特异性基因序列(如线粒体DNA中的细胞色素b、细胞色素c氧化酶亚基I等基因)。这一特性使CRISPR/Cas技术能够高效区分牛、猪、羊、鸡等不同肉类物种,为开发精准、高效的肉类掺假检测方法提供了坚实基础。
由于CRISPR/Cas12a系统兼具精准识别与切割靶标功能和高灵敏度特点,科研人员基于CRISPR/Cas系统已开发出功能各异、适用于不同场景的肉类掺假检测平台及新型生物传感器,目前已报道的常见肉类检测方法如表1所示。
表1 基于不同扩增策略的CRISPR/Cas肉类掺假检测应用
Table 1 Application of CRISPR/Cas for meat adulteration detection based on different amplification strategies
方法物种目标基因信号输出方式检测限检测参考时间文献河豚COI比色0.10%(m/m)90 min[23]猪、鸡、鸭ND4、ND2、D-loop荧光及比色1.0 pg/μL 40 min[24]牛、鸭、猪mtDNA荧光10~100 copies/μL 45 min[25]猪mtDNA荧光1 pg/μL 30 min[26]鸭ND2荧光1.9 pmol/L>2.5 h[27]猪Cytb荧光0.05%(m/m)45 min[28]基于核酸牛mtDNA荧光10 pg/μL 45 min[29]扩增策略猪COI荧光5 pg/μL 50 min[30]牛、牦牛mtDNA荧光3.26~36.2 copies/μL 1 h[31]鸡、鸭、猪、牛、羊mtDNA比色1 copy/μL 60 min[32]猪Cytb比色50 pg/μL 1 h[33]猪Cytb电化学50 pg/μL 70 min[34]河豚COI电化学17.4 fg/μL无[35]牛Cytb拉曼光谱224 amol/L>80 min[36]猪Cytb荧光2.7 ng/μL>2.5 h[37]猪Cytb荧光1.13 ng/μL>2 h[38]基于免扩增策略鸭ND2拉曼光谱34.9 amol/L无[39]猪D-loop电化学4 fmol/L>1 h[40]猪Cytb电化学0.45 nmol/L 90 min[41]
核酸扩增技术可显著提升检测灵敏度,可满足 10-12 mol/L级目标物或低至0.1%掺假比例的检测要求[42]。 研究人员开发出多种基于不同核酸扩增方法的CRIPSR/Cas检测系统。例如,Yin Xinying等[23]将PCR扩增与CRISPR/Cas12a相结合,CRISPR/Cas12a特异性识别PCR产物后,反式切割G-四链体DNA酶,该酶能够模拟过氧化物酶活性,催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺硫酸盐发生颜色变化。当目标DNA序列存在时,Cas12a的激活将破坏 G-四链体DNA酶结构,从而抑制其催化活性。这种基于肉眼判读的颜色变化可直接用于河豚肉掺假的定性检测,为现场快速筛查提供了简便方案。
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)、重组酶辅助扩增(recombinase aided amplification,RAA)等恒温扩增技术已广泛应用于构建CRISPR检测平台。Tao Dagang等[24]结合LAMP和CRISPR/Cas12a,采用德州红标记的ssDNA报告器,通过荧光信号变化可在白光、蓝光和紫外光下实现猪、鸡和鸭DNA检测,灵敏度达1.0 pg/µL,检测周期约40 min。该系统在实验室和食品加工厂的现场测试中均表现出100%的可重复性。这项技术完全可在标准室内环境中部署使用,且其可视化检测结果直观简便,适用于法医物证和海关检测等多种场景需求。在荧光报告系统优化方面,DNA模板化银纳米簇(DNA-templated silver nanocluster,DNA-AgNCs)因其高光稳定性、显著增强的荧光特性、良好的生物相容性、有利的分散性和无毒性等优势,成为生物传感器中的理想荧光报告器[43]。Chen Jiahui等[27]以DNA-AgNCs作为CRISPR/Cas12a系统的报告子,利用LAMP和CRISPR/Cas12a系统,建立高灵敏度检测方法。结果表明,当DNA-AgNCs靠近富含鸟嘌呤的DNA序列时,鸟嘌呤向纳米簇的电子转移会使其荧光强度显著增强,由此可实现10 pmol/L~1 μmol/L高动态范围和低至1.9 pmol/L的高灵敏度检测,在实际应用中能够检出羊肉中低至0.4%(m/m)的鸭肉掺假。
Liu Hua等[25]将CRISPR/Cas12a与RPA相结合,通过优化crRNA、报告子长度等参数,结合手持式荧光仪(可直接读取荧光信号强度),在37 ℃下45 min内能特异性检出低至10~100 copies/μL的牛、猪、鸭DNA。肉类掺假检测多以食物或生物样本为主,基质较复杂,建立与CRISPR/Cas系统相匹配的高效现场DNA提取方法是关键。Zhao Gang等[26]采取碱裂解法提取猪肉DNA,基于RPA与CRISPR/Cas12a建立的检测方法能够在30 min内检出低至10-3 ng的猪DNA,并能够高特异性区分生肉、煮沸、高压处理等不同加工条件下的混合肉样及商业产品。相较于需要荧光信号读取设备的的检测方法,基于比色分析的方法能够凭借肉眼实现可视化检测。侧向流动试纸(lateral flow dipstick,LFD)作为一种简便高效的比色检测手段,其通过LFD上简单的信号读取即可实现对目标核酸的检测[44]。Liu Yaqun等[32]建立的针对鸡、鸭、猪、牛、羊5 种肉类的RPA-CRISPR/Cas12a-LFD检测平台可实现低至1 copy/μL的高灵敏度检测。
不同的核酸扩增技术与CRISPR/Cas系统的整合应用需根据实际应用场景进行针对性选择。PCR技术虽然具有高特异性和灵敏度优势,但其依赖于精密温控设备和复杂操作流程,这使其主要适用于实验室环境。相比之下,LAMP和RPA等恒温扩增技术因其设备依赖性低、反应条件温和等优势,更适合与CRISPR/Cas系统结合用于现场快速检测。特别值得注意的是,近年来发展的一管法检测平台通过优化反应体系设计,有效降低操作复杂度和污染风险,为高效的肉类掺假现场快速检测提供新的解决方案。例如,Cai Chong等[33]将LAMP和CRISPR系统整合到一个反应体系中,并优化反应温度,将LAMP混合物置于试管底部,CRISPR/LbCas12a混合物置于试管顶部,从而实现单管检测,该方法可避免多次开盖操作,从而有效简化操作流程、减少气溶胶污染风险,更适合现场快速检测。
核酸扩增技术与CRISPR/Cas结合的检测体系虽能提高灵敏度,但存在操作复杂、检测时间较长等问题,且扩增产物暴露于空气中可能发生气溶胶污染,导致假阳性。为此,研究人员开发出无需核酸扩增的CRISPR/Cas检测策略,通过优化反应缓冲液、crRNA设计和报告子选择等关键参数实现直接检测。crRNA作为CRISPR/Cas12检测系统的关键组成部分,其设计与优化对于检测灵敏度和特异性具有至关重要的作用。Wu Yinhuan等[37] 尝试无需扩增直接使用CRISPR/Cas12检测猪肉Cytb基因,通过对9 个crRNA位点的筛选与验证得到最佳crRNA,并进一步优化crRNA与Cas12酶、报告子的比例,使检测信噪比达到最大,可在2.5 h左右检出低至2.7 ng/μL的猪Cytb基因。除筛选最优crRNA外,在同一系统中使用多重crRNA能够获得更高的灵敏度。Chen Yanju等[38]开发出一种无需预扩增的CRISPR/Cas12a肉类掺假检测方法,即多重crRNA增强CRISPR。该方法使用4 个靶向目的序列不同区域的crRNA引导Cas蛋白,检出限可达1.13 ng/μL,灵敏度相较于单一crRNA系统有明显提升。该研究表明多重crRNA策略能够有效增强Cas12a活性,适用于快速、灵敏的肉类掺假检测场景。
报告子作为决定CRISPR/Cas系统信号输出性能的基本元件,其长度与二级结构对系统检测灵敏度具有显著影响[45]。除传统ssDNA报告子外,基于纳米材料或纳米材料辅助的报告子也能显著提升检测性能。例如,金纳米颗粒(gold nanoparticles,AuNPs)具有高效的荧光猝灭能力,常被作为荧光团的锚定基底。通过设计基于AuNPs的核酸报告探针特殊结构,可构建稳定而灵敏的CRISPR/Cas检测系统[46]。Fu Xiaoyi等[47]将CRISPR/Cas12a的反式切割活性应用于AuNPs基质,其将FAM标记的硫代修饰DNA固定在AuNPs表面,开发出一种球状核酸报告子,该高密度球状核酸系统检测限低 至10 fmol/L,较传统ssDNA报告子灵敏度低2 个数量级,同时具备更优的稳定性。该研究为CRISPR检测系统的信号放大策略提供了新思路。
数字微流控是一种能够精确操控微尺度流体的技术,其核心在于通过微流控芯片在微米级尺度上集成样品制备、反应和检测分析等功能。将多功能集成微流控芯片与CRISPR技术相结合,可在微型设备及微观尺度上实现快速、高效的生物学分析检测,从而显著降低降低操作难度和成本。Han Xiangzhi等[48]创造性地利用CRISPR/Cas12a驱动的空气置换增强全反射荧光纤维嵌入微流控生物芯片,能够在免核酸扩增条件下实现真实环境水样中大肠杆菌O157:H7的高灵敏度、快速检测。
级联信号放大技术通常以第一个核酸酶的催化产物作为下一个酶反应的底物以实现信号放大。Csm6是一种源自III型CRISPR系统的RNA内切酶,与天然配体结合时,其RNase活性会被激活[49]。Liu等[50]将Cas13和Csm6 2 种CRISPR核酸酶串联开发出FIND-IT核酸检测平台。该平台采用化学稳定的激活剂,当Cas13特异性识别并结合目标RNA后,发挥激活剂剪切活性生成能够持续激活Csm6的线性激活配体,从而达到级联信号放大目的。
尽管基于优化报告子、数字微流控技术及级联信号放大技术等优化策略已开发出多种核酸检测平台,但针对肉类掺假检测系统的研究仍然较少。因此,基于免核酸扩增CRISPR/Cas技术的肉类掺假检测方法仍有必要进一步研究和改进。
综上所述,基于CRISPR/Cas系统的肉类掺假检测灵敏度与技术路线选择密切相关。核酸扩增策略通过对靶标DNA进行指数级扩增,可显著提升检测灵敏度(通常在pg/μL级别),使其能够有效检测极低浓度的目标物质,但同时也将不可避免地增加操作复杂性和污染风险。相较而言,免扩增策略致力于简化操作流程、降低污染风险,以实现现场快速检测,但由于其依赖CRISPR/Cas系统直接识别原始样本中未扩增的靶标,检测限通常较高(通常在ng/μL级别),这限制了其在极低比例掺假检测中的应用。因此,技术路线的选择需根据具体应用场景对检测灵敏度和操作复杂性的不同需求确定。
CRISPR/Cas检测系统常以荧光或比色作为信号输出方式,这种方法虽然直观、简便,但存在背景噪声高、定量效果差等突出问题[51]。因此,研究人员不断探索新的信号输出方式,目前开发出多种基于CRISPR/Cas的新型生物传感策略,其中以电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)和SERS信号输出方式在肉类掺假检测中应用较为广泛。
ECL技术主要通过靶标DNA与CRISPR/Cas复合物结合阻碍电极上的电子传递,从而引起电流响应变化。部分ECL传感器还可利用Cas酶切割固定在电极表面的ssDNA报告子,进而导致电流信号变化。ECL生物传感器因其高灵敏度、低背景噪声和宽线性动态范围而备受关注。例如,何杰城[34]将电信号指示剂MB标记的单链发夹DNA探针通过金硫键偶联在金电极表面,在靶标存在情况下,Cas12a蛋白的反式切割活性被激活,并随机切割金电极表面的MB-发夹探针,导致MB解离,电流信号下降,通过差分脉冲伏安法采集电流信号变化即可实现对猪肉源成分的检测。与之类似,Muflihah等[41]将巯基化ssDNA通过金硫键固定在电沉积AuNPs修饰的丝网印刷碳电极表面,当目标DNA存在时,电极表面ssDNA探针被切割,导致随后加入的银离子在ssDNA上的还原效率降低,银氧化电流信号下降,同样通过差分脉冲伏安法采集电流信号变化实现对猪肉DNA检测。此外,金属有机框架(metal organic frameworks,MOFs)材料因其高比表面积和催化活性被广泛用于ECL传感器开发。该类材料可作为共反应加速器,增强N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol,ABEI)/ H2O2系统的ECL信号。Zhang Xiaobo等[35]以钴基MOFs材料沸石咪唑酯骨架材料67(zeolitic imidazolate frame work 67,ZIF-67)为前驱体,结合金簇合成一种新型共反应加速器NiCo2O4 NCs@Au,并以NiCo2O4 NCs@Au-ABEI作为纳米发光体,将巯基化四面体DNA纳米结构(tetrahedral DNA nanostructures,TDNs)修饰于其表面,以实现多巴胺ssDNA密度和方向的可调控性。在靶标存在情况下,CRISPR/Cas12反式切割活性被激活,切割电极表面的多巴胺ssDNA并产生电信号。该研究基于ECL生物传感器结合PCR扩增与crRNA识别可特异性鉴别4 种河豚物种,并能检测出混合物样品中低至0.1% (m/m)的掺假河豚。
以SERS作为信号输出方式的CRISPR/Cas生物传感器依赖于与SERS活性阵列结合的单链探针断裂引起的拉曼强度变化[52]。SERS作为一种有效的振动光谱定量分析技术,具有便携性、操作简便和超高灵敏度特点,适合作为现场检测工具。Pan Ruiyuan等[36]将CRISPR/Cas12a系统和SERS技术相结合,ssDNA与PB NPs相连形成探针,当Cas12a反式切割活性被激活时,探针被切割并释放PB NPs。随后,利用碱性处理破坏剩余PB NPs,释放出具有特征性拉曼峰的铁氰化物离子。通过与金银核壳纳米颗粒结合,最终将目标DNA浓度转化为可定量的SERS信号,该方法对牛DNA的检测限可达224 amol/L。
杂交链式反应是一种具有代表性的信号放大技术。Liu Jianghua等[39]提出一种基于CRISPR/Cas12a的SERS和裸眼双模式生物传感器,通过级联信号放大实现核酸的超灵敏现场检测。在识别靶标后,Cas酶反式切割ssDNA并触发杂交链式反应,组装生成大量G-四链体/亚铁血红素DNA酶(G-quadruplex/hemin DNAzyme,GQH DNAzyme),进而实现级联信号放大。GQH DNAzyme催化L-半胱氨酸氧化为胱氨酸,扰乱4-硝基苯硫酚(4-nitrothiophenol,4-NTP)修饰AuNPs的聚集,导致拉曼信号变化。另一方面,GQH DNAzyme还能催化2,2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)的氧化反应,引发明显的颜色变化,实现便携式裸眼检测。该策略可将目标核酸浓度转化为高灵敏度拉曼信号和便携式可视化信号,检测限分别低至34.9 amol/L和1 pmol/L。 该生物传感器成功应用于肉类掺假检测,能够检出鸭肉含量低至0.03%(SERS)及0.5%(m/m)(裸眼观察)的掺假羊肉样品。
相较于传统荧光和比色检测方法,基于电化学信号和拉曼光谱信号的核酸传感器在降低背景噪声、提高定量准确性方面展现出显著优势。其中,ECL技术更适用于需高精度定量检测的实验室场景,而SERS技术凭借设备轻量化和快速响应优势,在基层现场检测中潜力更大。然而,这些新型传感策略仍面临诸多挑战:ECL技术需精密电极修饰和复杂纳米材料合成,对操作人员要求高且成本高昂,难以实现规模化应用;SERS技术的信号重复性受纳米颗粒均一性制约,且复杂样本基质易干扰拉曼谱峰识别,这些技术瓶颈仍需通过持续研究进行突破,以实现实际应用。
随着国民生活水平提升,肉类需求量持续增长。2023年我国肉类总产量达9 641万 t,同比增长4.5%[53],这对肉类检测与监管提出更高要求。作为一种新兴的分子检测技术,CRISPR/Cas检测体系已被证实具有高特异性与灵敏度,并广泛应用于病毒检测等领域[54]。同样地,CRISPR技术在肉类掺假检测领域展现出显著的应用潜力:第一,相较于PCR、质谱、电子鼻、光谱等技术需要昂贵的专业仪器,CRISPR技术仅需水浴加热或完全无需专业设备,大幅降低了检测成本,更适合基层执法部门推广应用;第二,传统PCR和质谱等技术通常需要3 h左右才能完成检测,CRISPR技术可将检测时间缩短至1 h左右,甚至更短,显著提高执法检测效率;第三,目前肉类掺假现场检测主要依赖酶联免疫吸附法,但该方法因特异性不足易出现假阳性结果,通常还需要实验室方法进行结果确认,而CRISPR技术特异性强,能够有效弥补现有现场检测方法的不足。
在CRISPR肉类掺假检测技术发展过程中,还需解决以下技术瓶颈:第一,Cas12a蛋白酶对PAM序列具有依赖性,这导致crRNA设计灵活性受到制约,将在一定程度上制约CRISPR/Cas12a系统的应用。针对这一问题,可在扩增产物中引入PAM序列或使用含PAM的引物等创新策略[55];第二,crRNA可能错误识别与靶标相似的非目标DNA序列,产生脱靶效应,导致非目标DNA序列被切割,进而产生假阳性结果。为应对此挑战,研究人员开发出基于机器学习(如支持向量机、随机森林)的crRNA脱靶效应预测模型。采用包含大量crRNA切割活性的数据集对模型进行训练,使之学习序列特征与切割活性之间的关系,从而在新crRNA设计中预测潜在脱靶位点,指导设计高特异性、高靶向效率的crRNA[56-57];第三,虽然核酸扩增是提高大多数基于CRISPR/Cas的肉类掺假检测系统灵敏度的关键步骤,但该过程也会增加操作复杂性并延长操作时间。相比之下,结合新型生物传感策略和微流控技术的免扩增CRISPR/Cas技术能够更好地满足现场快速检测需求。然而,目前免扩增CRISPR/Cas肉类掺假检测平台仍处于起步阶段,在结合新型报告子及生物传感策略方面有待进一步开发;第四,CRISPR/Cas系统在多重检测能力方面存在固有局限,这主要源于其非特异性反式切割活性,在单个反应体系内区分多个靶标具有较大挑战[58]。空间分离技术是解决这一问题的有效策略。该技术将针对不同靶标的CRISPR反应体系物理分隔在独立的微腔室或液滴中,为每个反应创造一个封闭环境,确保Cas蛋白的反式切割活性无法干扰其他单元的反应,从根本上杜绝由反式切割导致的信号串扰问题,进而实现多重检测。Ding Wei等[59]设计猪、羊、鸭、鸡、牛的通用引物并进行扩增,再针对不同肉类设计特异性crRNA,通过将crRNA包埋在多个反应腔室实现对5 种肉类的多重检测。Xiang Xinran等[60]将微针DNA提取技术与RAA-CRISPR/Cas12a系统整合到离心微流控芯片中,实现了DNA提取与检测的一体化,能够在30 min内完成对猪肉、鸡肉、鸭肉和羊肉产品的检测。然而,多重靶标检测往往会使实验操作与反应体系更加复杂,如何在保持高灵敏度和特异性的同时使其更适合实际应用场景也是必须解决的问题;第五,要实现现场POCT,建立与之适配的核酸提取方法至关重要。目前已有研究者将碱裂解法应用于CRISPR/Cas肉类掺假POCT平台开发[26],但该法适用的样品基质较为局限[61],仅有少数案例应用于动物样本提取,因此,仍有必要进一步开发适用于CRISPR/Cas肉类掺假POCT平台的核酸快速提取方法。
基于CRISPR/Cas系统的检测技术因其高特异性、快速及现场化优势,在肉类掺假鉴定领域展现出巨大的应用潜力。随着技术的日益进步,新一代CRISPR/Cas技术正朝着免扩增检测及新型生物传感器方向发展,旨在简化操作流程、提高检测效率,并通过微流控芯片和便携式设备集成为开发新一代现场快速检测平台提供核心解决方案,成为保障肉品质量与安全的重要技术手段。
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