肉制品的色泽稳定性是决定其感官品质与市场竞争力的重要因素，而肌红蛋白（myoglobin，Mb）的氧化还原状态在肉品色泽变化过程中发挥关键作用。传统肉制品加工中常用亚硝酸盐作为护色剂，能够有效抑制脂质氧化，延缓Mb氧化变性，并通过与Mb结合形成稳定的亚硝基肌红蛋白（nitrosomyoglobin，NOMb），赋予产品特征粉红色[1]。然而，亚硝酸盐在加工与贮藏期间容易与蛋白质降解产物结合，形成潜在致癌性的亚硝胺类物质，进而引发食品安全问题，促使研究者积极开发更为天然、安全的替代技术[2]。
在肉制品加工中，亚硝酸盐作为一种经典的多功能添加剂被广泛使用，其不仅能够抑制肉毒梭菌等致病菌的生长，更能与Mb反应生成NOMb[3]，其使用过程中存在安全隐患[4]。出于对食品安全的关切，开发亚硝酸盐的天然替代物已成为肉品科学领域的研究热点。在此背景下，天然抗氧化剂与功能性添加剂展现出巨大潜力。近年来，基于茶多酚、迷迭香提取物等天然多酚以及甜菜红、红曲红等植物色素的研究取得了显著进展。这些天然物质一方面通过其显著的抗氧化活性，有效延缓Mb中Fe2+的氧化，稳定色泽；另一方面，部分成分本身也可直接参与发色反应[5]。然而，许多天然替代物仍面临着色力不足、自身带有异味或成本高昂等挑战。因此，探寻兼具高效护色能力、良好兼容性与经济可行性的新型天然替代方案，仍是当前研究的重点与难点。
乳酸菌作为功能性益生菌，以其在肉制品中的风味改良、货架期延长及病原菌抑制等功能受到广泛关注[6]。近年来，乳酸菌衍生的后生元因其良好的稳定性及多样化的生物功能，成为替代亚硝酸盐的潜在新型材料[7]。后生元是由灭活乳酸菌菌体及其代谢产物（如有机酸、细菌素、胞外多糖等）组成的一类功能性复合物，无需微生物活菌增殖即可直接发挥抗氧化、抑菌与协同护色作用[8-10]。同时，后生元避免了传统微生物发酵过程中活菌不稳定、易污染及工艺复杂等问题，使其在肉制品工业中具有良好的应用前景。
本研究将发酵粘液乳杆菌后生元（postbiotics of Limonsilactobacillus fermentum，PLF）与亚硝酸钠共同添加至肉糜体系中，评估在肉糜冷藏过程中PLF与亚硝酸钠表现出的协同护色效果。色度参数红度值（a*）的测定包括两方面：1）不同添加量PLF与亚硝酸钠的护色效果；2）PLF与不同添加量亚硝酸钠的护色效果。同时，对各处理组的Mb含量、NOMb相对含量及亚硝酸钠残留量进行测定，以综合评估PLF的护色能力及其在亚硝酸盐减量应用中的可行性。然后，结合紫外-可见（ultraviolet-visible，UV-Vis）光谱、傅里叶变换红外（Fourier transform infrared，FTIR）光谱和表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）解析PLF-Mb复合体系的结构变化及其动态互作特征；并利用荧光猝灭动力学模型计算亚硝酸钠与PLF-Mb复合体系之间的结合常数（Ka）及热力学参数，阐明PLF与Mb之间的相互作用机制，以揭示其分子结合机制，为肉制品中亚硝酸盐替代技术的发展及护色机制的精细调控提供理论依据与技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
猪背最长肌为市购，在4 ℃条件下运回实验室（约1 h），贮藏在-20 ℃的环境中；发酵粘液乳杆菌（Limonsilactobacillus fermentum）TQ-1、MRS肉汤 培养基 杭州微生物试剂有限公司；Mb 美国Sigma-Aldrich公司。
MRS肉汤 杭州微生物试剂有限公司；亚硝酸钠、抗坏血酸钠、硼砂、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、对氨基苯磺酸、亚铁氰化钾、柠檬酸三钠、三氯乙酸、EDTA-2Na、溴化钾、Triton X-100 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硝酸银、Tris、丙酮、盐酸 国药集团化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
WR10精密色差仪 深圳市威福光电科技有限公司； D-1均质机 德国Miccra公司；Z-10N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；5810R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；UV-6100B UV-Vis分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；F-280荧光分光光度计 天津港东科技发展股份有限公司；Nicolet iS50 FTIR仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；XploRA Plus共聚焦显微拉曼光谱仪 法国HORIBA France SAS公司。
1.3 方法
1.3.1 PLF的制备
根据实验室前期的研究基础[11]，将发酵粘液乳杆菌TQ-1按2%的接种量在MRS肉汤中37 ℃培养18～22 h，水浴加热（60 ℃、50 min）发酵液灭活，离心（4 ℃、6 000×g、15 min）后取上清液，使用0.22 μm水系混合纤维素滤膜过滤，对上清液进行冷冻干燥后得到PLF。将PLF贮存在-80 ℃以备进一步使用。
1.3.2 肉糜样品的制备
本研究为冷藏（4 ℃）147 h实验。剔除原料肉的可见筋膜与结缔组织，切分后放入筛孔直径4 mm绞肉机中绞制均匀，加入亚硝酸钠及PLF后将斩拌均匀的肉糜压制为直径4.5 cm、厚度1.6 cm的肉饼，放置于4 ℃冷库中贮藏。取150 g肉糜制作肉饼，每组重复3 次。GB 2760—2024《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中亚硝酸盐在肉制品中添加量≤150 mg/kg，故选取加入150、75、37.5 mg/kg亚硝酸钠进行实验，分别命名为150N、75N和37.5N组，并在每组中加入250 mg/kg抗坏血酸钠。首先固定亚硝酸钠添加量150 mg/kg，设置PLF添加量（在肉糜中的质量分数）分别为0.5%、1%、2%、4%，筛选最优PLF添加量；其后固定PLF添加量为2%，设置亚硝酸钠添加量分别为150、75、37.5 mg/kg，完成后续全部实验。以不添加亚硝酸钠及PLF、仅添加等量去离子水为空白组（Control）。
各指标的测定时间点如下：1）a*：肉糜贮藏0、3、9、15、27、39、51、63、75、99、123、147 h；2）Mb含量：肉糜贮藏0、3、9 h；NOMb相对含量：肉糜贮藏0、3、9、15、27、39 h；3）亚硝酸盐残留量：根据GB 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》要求，在肉糜贮藏0、3、9、15、27、39、51、63 h进行测定；4）光谱分析（UV-Vis光谱、FTIR光谱、SERS、内源荧光光谱）：光谱类实验均在体系配制完成后立即测定（0 h）。
1.3.3 肉糜a*测定
使用标准板对色差仪进行校准，利用D65光源、8 mm测量口径范围及10°视角，对肉饼的a*进行测定，在每块肉饼上随机选择3 个不同区域进行测定，结果取平均值。样品制备后立即（0 h）测定初始值，随后在贮藏3、9、15、27、39、51、63、75、99、123、147 h测定。
1.3.4 肉糜Mb含量测定
参考魏海旺等[11]的方法，稍作修改。Mb含量采用紫外分光光度法测定。取5 g肉糜与15 mL冷的萃取介质（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，含1 mmol/L EDTA、25 g/L Triton X-100）4 ℃混匀，混合液在高速均质机中均质（10 000 r/min、1 min），4 ℃下静置1.5 h后9 600×g离心10 min，滤纸过滤得滤液。测定滤液（即Mb溶液）在542 nm和700 nm处的吸光度，重复测定3 次，取平均值。肉糜中Mb含量按式（1）计算：
1.3.5 肉糜NOMb相对含量测定
参考Wójciak等[12]的方法，稍作修改。NOMb含量测定：提取溶液为丙酮-水（40∶3，V/V）；总血红素含量测定：提取溶液为丙酮-水-盐酸（40∶2∶1，V/V）；测定时料液比为1∶4（g/mL），混匀振荡1 min后，5 000×g离心5 min，取上清液分别测定540 nm和640 nm波长处吸光度。肉糜NOMb相对含量按式（2）～（4）计算：
1.3.6 肉糜亚硝酸钠残留量及降解速率测定
参照GB 5009.33—2016进行测定。拟合每组肉糜亚硝酸钠残留量随时间的线性变化趋势，曲线方程如式（5）所示：
式中：b为降解速率/（µg/（h·g））。
1.3.7 亚硝酸钠与PLF-Mb体系的UV-Vis光谱测定
按1.3.4节方法得到Mb溶液后立即进行测定。组别设置如下：Mb（不添加亚硝酸钠和PLF）、Mb+2% PLF（不添加亚硝酸钠，添加2% PLF）、37.5N（添加37.5 mg/kg亚硝酸钠，不添加PLF）、75N、150N、 37.5N+2% PLF、75N+2% PLF、150N+2% PLF。波长扫描范围为220～650 nm，测定样品的UV-Vis光谱及二阶导数光谱。
1.3.8 亚硝酸钠与PLF-Mb体系的FTIR光谱测定
根据Du Juanjuan等[13]的方法，并稍做修改。操作同1.3.7节，组别设置如下：Mb、37.5N、75N、150N、37.5N+2% PLF、75N+2% PLF、150N+2% PLF。样品混合均匀后，滴加在KBr压片上，采用FTIR光谱仪测定，光谱分辨率4 cm-1，扫描次数16，扫描波段500～4 000 cm-1。
1.3.9 亚硝酸钠与PLF-Mb体系的SERS测定
根据Su Liuyu等[14]的方法，并稍做修改。操作同1.3.7节，组别设置如下：Mb、37.5N、75N、150N、37.5N+2% PLF、75N+2% PLF、150N+2% PLF。样品混合均匀后，室温下稳定30 min，与纳米银颗粒（Ag nanoparticles，AgNPs）等体积混合，以增强拉曼散射信号。AgNPs根据Liu Jia等[15]的方法合成，所得AgNPs使用前用纯水洗涤3 次。所制备的AgNPs纯度较高，杂质较少，满足利用SERS技术对蛋白进行检测的要求[16]。将激光束聚焦在石英比色皿上，扫描石英比色皿上的3 个随机位置进行测定。实验过程中记录400～2 000 cm-1的发射光谱，功率衰减25%，光栅1 200 gr/mm，积分时间30 s，激发波长532 nm。
1.3.10 亚硝酸钠与PLF-Mb体系的内源荧光光谱与猝灭机制分析
参考Li Qian等[17]的方法，并稍做修改。操作同1.3.7节，组别设置如下：Mb+2% PLF、37.5N、75N、150N、37.5N+2% PLF、75N+2% PLF、150N+2% PLF。样品混合均匀后，在不同温度（298、308、318 K）下孵育30 min。将最大荧光发射强度的波长设置为激发波长，在320～420 nm范围内获得发射光谱。激发和发射狭缝宽度均设置为10 nm。猝灭机制由Stern-Volmer方程（6）证实，Ka和结合位点数（n）由式（7）计算，包括ΔH、ΔS、ΔG在内的热力学参数按式（8）、（9）计算：
式中：F0为Mb+PLF体系的荧光强度；Fc为Mb+PLF-亚硝酸钠复合物的荧光强度；c为亚硝酸钠浓度/（mol/L）；Ksv为Stern-Volmer猝灭常数/（L/mol）；Kq为双分子猝灭速率常数/（L/（mol·s））；τ0为Mb荧光团的平均寿命（10-8 s）；Ka为结合常数/（L/mol），表征PLF-Mb与亚硝酸钠的结合亲和力；n为结合位点数；ΔH、ΔS、ΔG分别为焓变/（J/mol）、熵变/（J/（mol·K））和吉布斯自由能变/（J/mol）；T和R分别为反应温度/K和摩尔气体常数（8.314 J/（mol·K））。
1.4 数据处理
对不同批次制备的样品分别重复3 次实验，数据以平均值±标准差表示。使用Microsoft Excel软件统计数据。用SPSS 27.0软件进行方差分析，以考虑数据间的显著性水平（P＜0.05），Origin 2021软件绘图。采用PeakFit软件分析FTIR光谱图上1 600～1 700 cm-1的二级结构。
2 结果与分析
2.1 不同添加量PLF与亚硝酸钠协同对肉糜a*的影响
如图1所示，PLF添加量对肉糜a*的影响可分为发色阶段（0～27 h）、护色保持阶段（27～99 h）及颜色衰退阶段（99～147 h）。以a*随时间变化的曲线下面积（area under the curve，AUC）评估护色效果，如表1所示，护色效果随PLF添加量增加而增强（4%＞2%＞1%＞0.5%），当添加量超过2%后，护色效果的提升趋于平缓（150N-2% PLF组的AUC仅为150N-4% PLF组的92.9%）。过高PLF添加量（如150N-4% PLF组）在后期（99 h后）反而导致a*下降幅度较大，不利于肉糜色泽的稳定性。150N-2% PLF组a*峰值达到13.14±0.21，较150N处理组明显提升，在增强护色效果的同时兼顾了色泽稳定性与食用品质，综合表现最优，因此选择2% PLF、不同亚硝酸钠添加量进行后续实验。
表1 150 mg/kg亚硝酸钠联合不同添加量PLF对肉糜a* AUC及峰值的影响
Table 1 Effect of 150 mg/kg sodium nitrite combined with different concentrations of PLF on the area under the curve and peak value of a* in minced meat
注：同列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
组别AUC（0～147 h）峰值Control 1 154.56±8.51e 13.21±0.35d 150N 1 332.61±2.32a 10.21±0.32d 150N+0.5% PLF 1 423.23±4.65b 11.61±0.27c 150N+1% PLF 1 687.51±6.31d 12.30±0.15a 150N+2% PLF 1 789.32±5.12c 13.14±0.21b 150N+4% PLF 1 925.45±4.85b 13.65±0.14a
图1 150 mg/kg亚硝酸钠联合不同添加量PLF对肉糜a*的影响
Fig. 1 Effect of 150 mg/kg sodium nitrite combined with different concentrations of PLF on the a* of minced meat
如图2所示，PLF与不同添加量亚硝酸钠协同处理对肉糜a*产生明显影响。Control组a*在贮藏期间呈持续下降趋势，从初始的13.18±0.59降至147 h时的8.60±0.34，降幅达34.8%，其色泽劣化主要归因于Mb自然氧化为高铁肌红蛋白（metmyoglobin，MetMb）。在贮藏初期（0～3 h），a*随亚硝酸钠添加量升高而升高，150N、75N和37.5N组初始a*分别为10.54±0.29、7.09±0.12和7.91±0.29，体现了亚硝酸钠的发色作用；随后进入发色阶段，亚硝酸钠被还原为NO并与Mb结合形成NOMb[18]，促使肉糜的a*逐步回升。整体上a*与亚硝酸钠添加量呈正相关，但亚硝酸钠添加量越高，发色时间也越长，150N处理组发色期需要54 h结束，最高为13.50±0.31；表明添加PLF显著增强亚硝酸钠对肉糜a*的提升和维持作用，进一步证实PLF可在维持良好色泽的基础上有效降低亚硝酸钠的使用量，提高肉制品的安全性。
图2 2% PLF与不同添加量亚硝酸钠对肉糜a*的影响
Fig. 2 Effect of 2% PLF combined with different concentrations of sodium nitrite on the a* of minced meat
2.2 肉糜贮藏期间Mb含量变化
Mb含量减少与肉制品的色泽劣变及食用品质下降密切相关。如图3所示，Control组肉糜的Mb在贮藏期间持续氧化，Mb含量从初始（0 h）的1.59 mg/g明显降至9 h时的0.82 mg/g，降幅达48.4%，说明自然氧化是引起肉制品色泽劣变的主要途径。添加亚硝酸钠后，其作用呈现双重性。一方面，亚硝酸钠可作为发色前体，这与其添加量在一定范围内呈正相关趋势（图2）。但另一方面，亚硝酸钠本身也是强氧化剂。随着亚硝酸钠添加量的升高，其对Mb的氧化损伤效应显著增强。150N处理组在初始（0 h）时Mb含量仅为0.59 mg/g，相较于Control组（1.59 mg/g）降低62.9%。这表明高添加量的亚硝酸钠在发挥发色作用的同时也加速了Mb氧化为MetMb的过程，导致可用于发色反应的还原态Mb底物减少，从而从源头上限制了发色反应的最终潜力。这解释了为何尽管亚硝酸钠添加量增加，但150N组的a*峰值（图2）并未与添加量成比例地大幅提高，其发色效率受到制约。然而，添加后生元的37.5N+2% PLF处理组Mb含量与未添加PLF的37.5N组相比显著提高（P＜0.05），贮藏期间由0 h时的1.57 mg/g降至9 h的0.76 mg/g（降幅51.6%），与Control组（降幅48.4%）无显著差异（P＜0.05）。这一结果进一步证实PLF能够有效降低Mb的氧化损伤，促进Mb与NO结合，从而提升肉糜体系的a*。
图3 肉糜贮藏期间Mb含量变化
Fig. 3 Changes in Mb content during minced meat storage
2.3 肉糜贮藏期间NOMb相对含量变化
随着Mb含量的下降，其与亚硝酸钠反应生成的NOMb成为维持肉制品特征性粉红色泽的关键物质。如图4所示，150N处理组肉糜贮藏初期（0～15 h）NOMb的生成速率较缓慢（相对含量由11.6%增加至26.2%），这主要是因为高添加量亚硝酸钠氧化部分Mb形成MetMb，而MetMb无法与NO稳定结合；随后阶段（15～39 h）NOMb相对含量下降并趋于稳定（由26.2%下降至16.2%），可能由于部分NOMb进一步氧化为亚硝基高铁肌红蛋白[19]。而PLF通过减缓Mb氧化，为亚硝化反应持续提供底物，并且能够将亚硝酸钠还原为NO，进一步促进NOMb的生成。在150N+2% PLF处理组中，NOMb相对含量在9 h内由12%迅速增加至36.1%，生成速率为150N处理组的2.1 倍。在低添加量亚硝酸钠体系中，该促进效应同样明显：37.5N+2% PLF处理组NOMb相对含量增幅（由13.1%增加至26.8%）远超过37.5N处理组（由9.5%增加至19.4%）。
图4 肉糜贮藏期间NOMb相对含量变化
Fig. 4 Change in relative content of NOMb during minced meat storage
2.4 肉糜贮藏期间亚硝酸钠残留量变化及其降解速率
如图5、表2所示，150N处理组肉糜初始亚硝酸钠残留量高达90.05 μg/g，远超GB 5009.33—2016限值（30 μg/g），且在贮藏63 h后仅降至83.26 μg/g（降解速率0.06 μg/（h·g））。高添加量亚硝酸钠导致Mb快速氧化，造成色泽稳定性与食品安全问题并存。然而，在150N+ 2% PLF处理组中，PLF显著加速了亚硝酸钠降解，残留量从初始（0 h）的79.1 μg/g迅速降至63 h的53.3 μg/g， 降幅为32.6%，降解速率达到0.37 μg/（h·g）。 PLF一方面通过还原亚硝酸钠生成NO并与Mb结合生成NOMb，促进反应的持续正向进行；另一方面可能通过调控肉品中的微生物群落结构促进亚硝酸钠的代谢降解。Hou Xiaoyi等[20]研究发现，亚硝酸钠与PLF-Mb复合体系pH值的降低可通过调节微生物群落及相关反硝化基因表达，显著促进亚硝酸钠降解。此外，PLF可能通过群体感应机制调节微生物群落结构，强化微生物群体对亚硝酸钠的协同代谢能力[21]。中短期贮藏条件下（超过27 h），75N+2% PLF处理组0 h时溶液体系亚硝酸钠残留量（27.34 μg/g）已达到国家标准要求，且仍维持较高的护色效果（a*＞11.5），表明PLF与低添加量亚硝酸钠联用具有显著的护色与降解亚硝酸钠协同作用。
表2 肉糜贮藏期间亚硝酸钠降解速率和曲线方程相关系数（R2）
Table 2 Degradation rate of sodium nitrite during minced meat storage and correlation coefficient of curve equation
2150N 0.060.43组别降解速率/（μg/（h·g））曲线方程R 150N+2% PLF 0.370.9675N+2% PLF 0.270.8675N 0.060.4137.5N+2% PLF 0.130.8137.5N 0.050.66
图5 肉糜贮藏期间亚硝酸钠残留量变化
Fig. 5 Changes in sodium nitrite residue during minced meat storage
2.5 UV-Vis光谱分析PLF对Mb结构与发色特性的影响
如图6A所示，260 nm处出现的强吸收峰可能归因于Mb的卟啉环与NO配位后发生的π→π*跃迁或电荷转移跃迁[17]。其中亚硝酸钠+PLF处理组的峰值为1.4，而亚硝酸钠处理组的峰值为1.2，这一差异表明PLF的添加促进了NOMb的生成。随着亚硝酸钠添加量的增加，吸收峰呈现出明显红移现象，这可能是由于亚硝酸钠作为氧化剂，诱导部分Fe2+氧化为Fe3+，进而增强卟啉环共轭体系的极性所致[22]。如图6B所示，Mb在408 nm处的特征峰（γ带）对应于血红素辅基卟啉环中的π→π*电子跃迁[23]，而位于545 nm和572 nm的较弱峰（Q带）则对应于氧合肌红蛋白（oxygenated myoglobin，OxyMb，Fe2+）的吸收峰[24]。随着亚硝酸钠添加量的增加，409 nm处的Sore带和Q带吸光度逐渐降低，表明Fe2+氧化为Fe3+导致血红素辅基的π-共轭体系被破坏，而PLF的添加有效减缓了氧化损伤。
图6 亚硝酸钠与PLF-Mb体系的UV-Vis光谱
Fig. 6 UV-Vis spectra of sodium nitrite and PLF-Mb system
如图7所示，二阶导数光谱在280～300 nm区域的特征变化进一步阐明了蛋白质三级结构的动态变化。287 nm处出现约1.2 nm的显著红移与色氨酸残基微环境变化密切相关，PLF可能通过形成氢键网络固定色氨酸侧链取向，从而提高蛋白质结构稳定性[25]。此外，290 nm处的红移则可能源于PLF与酪氨酸残基之间发生的π-π堆积相互作用，形成空间位阻并降低氧分子的渗透效率。这种分子间的相互作用机制可有效抑制血红素中Fe2+的氧化[26]。
图7 亚硝酸钠与PLF-Mb体系的UV-Vis光谱二阶导数
Fig. 7 Second-order derivative UV-Vis spectra of sodium nitrite and PLF-Mb system
2.6 FTIR光谱分析PLF对Mb二级结构稳定性的调控作用
FTIR光谱分析进一步揭示了不同添加量亚硝酸钠与PLF对Mb二级结构的影响。如图8所示，酰胺I带（1 600～1 700 cm-1）峰拟合分析表明，Mb主要由α-螺旋（51.1%）结构组成，β-折叠相对含量较低（11.6%）。当亚硝酸钠添加量从37.5 mg/kg增加至150 mg/kg时，α-螺旋相对含量明显下降（从35.4%降至23.3%），而β-折叠（从22.7%增至29.6%）和无规卷曲结构（达到32.8%）相对含量则明显增加，这一趋势表明高添加量亚硝酸钠可能通过氧化作用破坏蛋白质中的氢键网络及疏水堆积，诱导α-螺旋向β-折叠与无规卷曲结构转化[27]。然而，PLF的添加显著抑制了这种结构转化趋势，在150N+2% PLF处理组中，α-螺旋结构相对含量达到32.3%，而β-折叠结构相对含量则相应降低至25.7%。这些结果证实PLF能够有效增强Mb的构象稳定性，并可能通过适度减少的β-折叠结构形成局部疏水屏障，限制水分子的渗透，协同减缓Fe2+氧化[28]。
图8 亚硝酸钠与PLF-Mb体系的FTIR光谱（A）及二级结构相对含量（B）
Fig. 8 FTIR spectra (A) of sodium nitrite and PLF-Mb system and relative content of secondary structures (B)
2.7 SERS分析PLF对Mb-NO配位及护色机理的影响
溶液状态下的Mb通常表现出微弱的拉曼信号，采用AgNPs辅助的SERS技术可显著增强其信号强度，从而获得更为详细的拉曼指纹信息。图9为不同添加量亚硝酸钠与PLF共同作用于Mb溶液时的SERS谱图。在429、828、878、1 125、1 230、1 350～1 480 cm-1波数区域均观察到与Mb相关的特征峰，分别代表Fe—S（半胱氨酸）振动、Fe—NO伸缩振动、Fe2+—C—O弯曲振动、血红素基团中C-β-甲基的伸缩振动、吡咯半环的反对称伸缩振动、Fe氧化态与配位[14,27]。其中，429 cm-1处增强峰主要对应半胱氨酸硫醇基团与血红素铁的配位振动，表明PLF与亚硝酸钠协同诱导血红素口袋硫醇基团构象重排；828 cm-1 处Fe—NO伸缩振动峰值随亚硝酸钠添加量升高而增强，证实PLF通过还原亚硝酸钠生成NO，促进NOMb生成[29]；878 cm-1处峰的强度增加代表了OxyMb中Fe2+还原态的特征信号，揭示PLF有效抑制了Fe2+向Fe3+的氧化[30]；1 125 cm-1（C-β-甲基伸缩振动）与1 230 cm-1（吡咯半环反对称伸缩振动）[28]特征峰的出现表明，PLF有助于维持血红素的平面构象稳定，降低Fe2+脱离血红素的风险；1 350～1 480 cm-1区域内，1 359 cm-1（NOMb）峰占主导。SERS结果表明，PLF通过增强NOMb、维持Fe2+还原态及稳定血红素结构，最终提高护色的整体稳定性。
图9 亚硝酸钠与PLF-Mb体系的SERS
Fig. 9 SERS spectra of sodium nitrite and PLF-Mb system
2.8 内源荧光光谱分析亚硝酸钠与PLF-Mb体系相互作用及其猝灭机制
蛋白质的内源性荧光主要由色氨酸、酪氨酸与苯丙氨酸的微环境极性决定，因此可用于蛋白质-配体相互作用的动态分析。如图10所示，由峰位红移与峰强增强判断，PLF通过增强结合亲和力、改变作用机制为更稳定的静态复合并主要以疏水相互作用为驱动，不仅提高了反应效率，在更低亚硝酸钠添加量下达到同等的发色效果，延长了色泽的持久性。随着亚硝酸钠添加量的增加，位于356 nm处的峰荧光强度逐渐降低，Ksv随着温度的升高明显下降（298 K时为3.1×102 L/mol，318 K时降至1.1×102 L/mol），表明亚硝酸钠与PLF-Mb的结合可能遵循静态猝灭机制。如表3所示，体系的Ka随温度升高而增加（298 K时为1.75×102 L/mol，318 K时达2.85×103 L/mol），n接近于1（范围0.89～1.34），表明PLF-Mb与亚硝酸钠结合以单一主导位点为主。PLF通过以疏水相互作用为主要驱动力，与Mb自发形成一个结构稳定的复合物（PLF-Mb）。该复合物以一个主导性位点，并以更高的亲和力与亚硝酸钠结合。结合反应的热力学参数分析显示，ΔG均为负值，表明结合过程为自发进行，同时ΔH为正值（110 kJ/mol），表明结合过程为吸热，ΔS为正值（410 J/（mol·K）），则表明结合导致体系混乱度增加，这是疏水相互作用的典型热力学特征，综合以上数据表明，疏水相互作用是驱动该结合过程的主要作用力，同时伴随静电作用、范德华力及氢键等多种分子间作用力[31]。
表3 298、308、318 K时亚硝酸钠与PLF-Mb的相互作用常数和热力学参数
Table 3 Interaction constants and thermodynamic parameters of sodium nitrite with PLF-Mb system at 298, 308, and 318 K
/（L/mol）（mol·s））（L/mol）n（kJ/mol）（kJ/mol）（mol·K））3181.1×1021.12.85×1031.34-20Kq/（1010 L/Ka/ΔG/ΔH/ΔS/（J/T/KKsv 2983.1×1023.11.75×1020.89-123082.1×1022.15.6×1021.13-16110410
图10 亚硝酸钠与PLF-Mb体系在不同温度下的荧光猝灭行为
Fig. 10 Fluorescence quenching behavior of sodium nitrite with PLF-Mb system at different temperatures
3 结 论
本研究以生鲜猪肉糜为模型体系，分析PLF与亚硝酸钠的协同护色作用。结果表明，添加2% PLF可使亚硝酸钠使用量降低约50%，150N+2% PLF处理组a*峰值达到13.14±0.21，较150N处理组明显提升。通过实验验证，PLF与亚硝酸钠的协同护色作用主要体现在3 个层面：在反应效率上，PLF的加入能协同促进亚硝酸钠还原为NO，并显著加速NOMb的生成，150N+2% PLF处理组中NOMb在9 h内的生成速率达到150N组的2.1 倍；在安全性上，PLF协同加速了亚硝酸钠降解，使150N+2% PLF组在贮藏63 h后的亚硝酸钠残留量较150N组降低32.6%，降解速率提升至0.37 μg/（h·g）；在分子机制上，光谱分析表明，PLF通过稳定Mb的二级结构、增强卟啉环电子离域性与分子间疏水相互作用，并调节色氨酸与酪氨酸微环境形成氢键网络与π-π*堆积，协同稳定了Mb结构，从而有效维持了其中Fe2+的还原状态，减缓了其氧化损伤；SERS进一步证实，PLF协同促进了Fe—NO 配位，使NOMb居于主导；荧光猝灭实验则表明，PLF与Mb以疏水相互作用为主结合，为上述协同效应提供了热力学依据。综上所述，PLF从促进发色反应、加速有害物降解与稳定发色蛋白结构三方面，与亚硝酸钠发挥了显著的协同护色作用。本研究为乳酸菌后生元在生鲜猪肉糜中替代亚硝酸盐提供了理论支持，并为天然、安全护色剂的开发提供了新方向。
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