在畜牧生产实践中，羔羊饲养方式对其生长发育和健康状况具有重要影响，这种影响会通过其机体生理功能间接作用于肉品屠宰品质。我国早期羔羊饲养方式以放牧为主，但随着国家开始实施草地生态恢复政策，全面推行草地禁牧、休牧、轮牧及草畜平衡制度，部分地区的羔羊养殖模式逐渐由传统天然放牧转向舍饲加高精料育肥。在高精料育肥模式下，羔羊活动范围受限、活动量减少，日粮组成也由天然牧草转变为精饲料和农作物。与传统放牧饲养方式相比，高精料育肥饲养方式虽能缩短养殖周期并提高屠宰率[1]，但长期饲喂高能量日粮易导致羔羊机体营养应激，进而引发消化与代谢系统功能障碍。当羔羊瘤胃发酵模式发生改变时，可能间接导致控制能量代谢的稳态系统失调[2]，从而使羔羊机体发生氧化应激。研究[3]发现，饲喂高能量日粮的羔羊体内脂肪、血清胆固醇、三酰甘油和氧化应激水平均有所增加。宰前动物的氧化应激状态会直接影响宰后成熟过程中肌肉的代谢进程[4]，包括肉的氧化稳定性、色泽等品质指标，最终影响肉质特性和消费者接受度。
线粒体作为氧化应激的主要发生场所，在细胞能量代谢、氧化还原平衡和细胞凋亡调控中发挥核心作用[5]。当线粒体功能受损时，异常线粒体可能在胞内积聚，进而加重功能障碍，主要表现为线粒体蛋白及氧化还原代谢相关组分的表达异常。这些病理变化通常伴随ATP耗竭和活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高[6-7]。因此，线粒体功能状态对宰后肉品成熟过程中的品质调控起着至关重要的作用，其通过调控氧气消耗、能量代谢和细胞凋亡等过程，进一步影响肌肉中脂肪和蛋白质氧化程度等关键品质参数[8]。
在后基因组学研究领域，转录组测序（RNA-Seq）作为解析基因组功能元件和探索细胞与组织分子机制的核心工具，在揭示生物表型和基因表达关联性方面具有重要作用。该技术已广泛应用于动物及畜产品生产研究领域，通过分析动物生长、繁殖和抗病性相关的海量转录组数据，成功揭示诸多重要经济性状的分子调控机制。
百里香酚（5-甲基-2-异丙基苯酚），又称麝香草酚，是一种苯酚单萜类化合物，以无色或白色晶体形式天然存在于百里香草、麝香草、牛至草等唇形科植物中。百里香酚具有抗炎、抗氧化及抗菌等多种生物活性，能够抑制炎症因子和趋化因子聚集、清除自由基并增强内源抗氧化酶活性等[9]。因此，这种天然成分在畜牧业中有望成为抗生素的理想替代品与日粮的优质添加剂。长期以来，百里香酚在畜牧业中主要以提高动物生产性能和代替抗生素为主要研究方向，但其对动物机体氧化还原系统的影响研究仍显不足。本研究拟从羔羊肌纤维线粒体入手，以日粮添加百里香酚育肥羔羊为研究对象，结合RNA-Seq技术探究百里香酚对羔羊肌纤维抗氧化能力的影响机制，以期阐明氧化应激对羔羊肌纤维线粒体功能的调控作用，寻找氧化应激对羊肉品质调控的潜在标志基因，为解释氧化应激影响宰后肉品质机制提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
6 只健康杂交公羔羊（蒙古羊×杜泊羊） 内蒙古土默特左旗成俊肉羊养殖场。
尿素、盐酸、磷酸、硝酸、盐酸胍、浓硫酸、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、无水乙醇、氢氧化钠、三氯甲烷、KH2PO4、K2HPO4、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、EDTA-2Na、2,4-二硝基苯肼（dinitrophenylhydrazine，DNPH）、2-硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、钙标准溶液（0.1 mg/mL） 国药集团化学试剂有限公司；乙酸乙酯 上海麦克林生化科技有限公司；5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、Tris-HCl、2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）、Caspase-3试剂盒（BC3830）、Caspase-9试剂盒（BC3890） 北京索莱宝科技有限公司；总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）试剂盒（A015-2-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（A001-3-2）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒（A005-1-2）、过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒（A007-1-1） 南京建成生物工程研究所；TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMIX for qPCR试剂盒、PerfectStartTM Green qPCR SuperMix试剂盒 南京德泰生物工程有限公司。
1.2 仪器与设备
HS 4磁力搅拌器、VORTEX 2旋涡振荡器、All basic研磨杯 德国IKA公司；TGL-20B离心机 上海安亭科学仪器厂；Allegrax-30R高速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司；U-2910紫外-可见分光光度计 日本 Hitachi公司；XHF-DY高速分散器 宁波新芝生物科技股份有限公司；PHS-3C数字式pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；CR-20色差仪 日本Konica Minolta 公司；KDY-9830凯氏定氮仪 北京通润源机电技术有限责任公司；SOX606脂肪测定仪 山东海能科学仪器有限公司；SX2-4-10马弗炉 上海一恒科技有限公司；SYNERGY H1火焰原子分光光度计 美国耶拿分析仪器股份公司；ZEEnit700P酶标仪 雷康恒泰（北京）商贸有限公司；6890N气相色谱仪 安捷伦科技（中国）有限公司；NanoDrop 2000分光光度计 美国Thermo Fisher Scientific公司；LightCycler® 480 II实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR）仪 瑞士罗氏公司。
1.3 方法
1.3.1 分组与饲养
将6 只健康杂交公羔羊按组间体质量差异不显著原则随机分为高精料育肥组（HC）和添加0.3‰百里香酚（以日粮质量计）的百里香酚组（TG），每组3 只。其中，HC组羔羊饲喂育肥基础日粮，由粗饲料混合牧草和精补料（玉米67%、麸皮9%、豆粕12%、棉粕10%、石粉1%、食盐0.5%、微量元素0.5%）按质量比3∶7组成；TG组在育肥日粮基础上添加0.3‰百里香酚。预饲期15 d，正饲期60 d。
实验前将羊舍进行彻底消毒，期间定期打扫与消毒，并保持自然通风。每日于8:00和18:00进行2 次饲喂，采用独立食槽和自由饮水装置，确保羔羊自由采食和饮水。
1.3.2 样品采集与测定
实验结束后，按标准程序现场屠宰，宰前禁食24 h，屠宰时采集相同部位背最长肌，部分指标进行现场检测，其余样品迅速置于液氮中快速冷冻保存，以备后续分析。
1.3.3 总酚含量测定
准确称取2.00 g肉样置于含有15 mL甲醇溶液的50 mL离心管中，采用高速分散器以10 000 r/min匀浆3 次（10 s/次）。匀浆液超声（200 W）提取60 min后，于3 000×g、4 ℃离心5 min。取1.00 mL上清液于25 mL具刻度试管中，加入6.00 mL去离子水和1.00 mL 1.0 mol/L Folin-Ciocalteu试剂，混匀后静置6 min，再加入4.00 mL 10.6%（m/m）碳酸钠溶液，摇匀，室温避光静置60 min，用去离子水定容，摇匀后于760 nm波长处测定吸光度。根据标准曲线方程（y＝0.019 3x+0.079 4，R2＝0.999 1，其中，y为总酚质量浓度/（μg/mL），x为吸光度）计算待测液总酚含量。
1.3.4 蛋白质氧化测定
羰基含量测定：将1 g切碎羊肉样品与10 mL 0.15 mol/L KCl溶液混合并匀浆（10 000 r/min、10 s/次、3 次），取0.1 mL匀浆物至2 mL离心管中，加入1 mL 10%（m/m）TCA溶液，2 000×g离心10 min，弃去上清液。实验组加入1 mL 0.2%（m/m）DNPH溶液（溶于2 mol/L HCl溶液），对照组加入1 mL 2 mol/L HCl溶液。室温避光静置1 h（每20 min涡旋一次）后，加入1 mL 10%（m/m）TCA溶液，涡旋并再次离心（2 000×g、10 min），弃去上清液，将沉淀用1.5 mL乙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）洗涤，15 000×g离心5 min，重复2 次。将沉淀溶于1.5 mL 6 mol/L盐酸胍溶液（溶于20 mmol/L磷酸钾缓冲液，pH 6.5）中，涡旋混匀，4 000×g离心3 min，取上清液分别于370 nm和280 nm波长处测定吸光度。羰基含量按式（1）计算：
式中：22 000为羰基衍生产物的摩尔吸光系数/（L/（mol·cm））；ρ1为样品中蛋白质量浓度/（mg/mL），由A280 nm通过线性校准方程（ρ1＝0.563 5× A280 nm+0.004 7，R2＝0.999 5）计算得到。
总巯基含量测定：将1 g切碎羊肉样品与9 mL 0.6 mol/L KCl溶液混合并匀浆（10 000 r/min、10 s/次、3 次），使用脱脂棉纱布过滤，取0.1 mL滤液，加入2.5 mL磷酸缓冲液（0.1 mol/L KH2PO4/K2HPO4、1 mmol/L EDTA，pH 8.0，含8 mol/L尿素），再加入0.05 mL 10 mmol/L DTNB溶液，混匀后避光放置15 min（黑纸或锡箔纸包住），4 500×g离心5 min，取上清液于412 nm与595 nm波长处测定吸光度。总巯基含量按式（2）计算：
式中：13 600为总巯基衍生产物的摩尔吸光系数/（L/（mol·cm））；11为反应体系校正系数；ρ2为样品中蛋白质量浓度/（mg/mL），由A595 nm通过线性校准方程（ρ2＝0.856 7×A595 nm+0.005 0，R2＝0.999 0）计算得到。
1.3.5 脂质氧化测定
取适量羊肉样品，采用研磨杯研磨20 s后，准确称取5.0 g，加入25 mL 7.5%（m/m）TCA溶液（含0.01%（m/m）EDTA），磁力搅拌（放入转子后用封口膜封口）30 min，混合液经双层定性滤纸过滤2 次，取5 mL上清液，加入5 mL 0.02 mol/L TBA溶液，沸水浴保温40 min（无菌封口膜封口）后取出，室温冷却1 h，转移至离心管中，加入5 mL三氯甲烷，摇匀，静置15 min分层后吸取上清液，于532 nm和600 nm波长处测定吸光度。TBARS值按式（3）计算：
1.3.6 肌纤维ROS水平测定
取0.5 g剪碎羊肉样品，加入4.5 mL Tris-HCl缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L蔗糖、0.1 mmol/L EDTA-2Na、0.008 g/mL NaCl，pH 7.4），冰浴条件下10 000×g匀浆20 s，重复3 次，4 ℃、3 000×g离心15 min，收集上清液，采用双缩脲法测定蛋白质量浓度。将100 μL上清液与100 μL反应缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L蔗糖、0.1 mmol/L EDTA-2Na、0.008 g/mL NaCl、10 μmol/L DCFH-DA，pH 7.4）在37 ℃条件下避光孵育15 min，采用酶标仪测定孵育后荧光强度（激发波长488 nm、发射波长525 nm），以荧光强度表征ROS水平。
1.3.7 肌纤维抗氧化能力测定
采用0.9%（m/m）生理盐水漂洗羊肉样品，准确称取1.0 g，加入9 倍体积生理盐水，冰水浴条件下8 000 r/min匀浆制成10 g/100 mL组织匀浆液，3 000 r/min离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明书测定T-AOC、GSH-Px活性、CAT活性、SOD活性。
1.3.8 肌纤维线粒体提取
取约1 g羊肉样品，剪碎并用生理盐水漂洗，滤纸吸干水分后，置于8 mL预冷均质缓冲液（1 mmol/L EDTA、15 mmol/L Tris、300 mmol/L蔗糖、5 mg/mL牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），pH 7.2）中，采用高速分散器以10 000×g均质10 s，重复3 次。匀浆在4 ℃、1 000×g离心15 min，重复2 次，然后在4 ℃、8 000×g离心15 min。将沉淀重悬于悬浮缓冲液（300 mmol/L蔗糖、15 mmol/L Tris、1 mmol/L EDTA，pH 7.2），4 ℃、8 000×g离心10 min，将沉淀重悬于悬浮缓冲液，冰上保存备用。
1.3.9 肌纤维线粒体相关指标测定
1.3.9.1 膜通透性
将线粒体质量浓度稀释至2 mg/mL。在室温下，将线粒体与4 倍体积的含10 mmol/L Tris-HCl和250 mmol/L蔗糖（pH 7.4）的4 ℃预冷测试培养基于25 ℃孵育3 min，采用紫外-可见分光光度计于540 nm波长处测定吸光度（A540 nm）。
1.3.9.2 脂质过氧化水平
将线粒体质量浓度稀释至0.5 mg/mL。取1 mL，加入2 mL 20 mmol/L TBA+20%（m/m）TCA溶液，80 ℃水浴加热40 min后，室温冷却30 min，于531 nm与600 nm波长处测定吸光度。线粒体脂质过氧化水平以组织中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量表示，按式（4）计算：
1.3.9.3 Ca2+含量
取约1 mL线粒体样品（含2.0 mg蛋白质），加入10 mL硝酸和0.5 mL高氯酸，220 ℃电炉消化3 h，待消化液变为无色透明，取出消化管，冷却后定容至25 mL，加入20 g/L氧化镧溶液，通过火焰原子分光光度计于422.7 nm波长处测定吸光度。通过标准曲线方程y＝0.009 4x+0.000 9（R2＝0.998 3；x为Ca2+质量浓度/（μg/mL），y为吸光度）计算Ca2+含量。
1.3.9.4 细胞色素c（cytochrome c，Cyt c）还原水平
取约2 g切碎样品，加入6 mL预冷分离缓冲液（0.01 mol/L Tris-HCl、0.3 mol/L蔗糖、1 mmol/L EDTA、5 mg/mL BSA，pH 7.4），匀浆，1 000×g离心10 min，重复1 次，再以8 000×g离心15 min，取上清液于550、535、280 nm波长处测定吸光度。由A280 nm通过ρ1＝0.563 5×A280 nm+0.004 7（R2＝0.999 5）计算蛋白含量，Cyt c还原水平以每毫克蛋白质在550 nm与535 nm处的吸光度差值表示。
1.3.9.5 膜电位
线粒体膜电位测定时，将线粒体质量浓度调至100 μg/mL，取0.1 mL线粒体与0.9 mL JC-1染色工作液避光孵育30 min，立即用酶标仪测定530 nm和590 nm波长处荧光强度，线粒体膜电位以荧光强度比值（F590 nm/F530 nm）表示。
1.3.9.6 线粒体凋亡酶活性
精确称取0.1 g肉样，用研磨杵磨碎后，按照Caspase-3和Caspase-9试剂盒说明书进行操作。
1.3.10 RNA-Seq测序
采用Illumina NovaSeq 6000测序平台对文库进行测序，并生成150 bp双端reads。每个样本约获得16 000原始reads。采用fastp软件对fastq格式原始reads进行处理，去除低质量reads后获得高质量Clean reads用于后续数据分析。通过HISAT2软件进行参考基因组比对，利用HTSeq-count 统计每个基因的reads计数，并基于每百万映射片段中每千碱基外显子长度的片段数（fragments per kilobase of exon per million mapped fragments，FPKM）值计算基因表达量。使用R语言对基因表达矩阵（counts）进行主成分分析（principal component analysis，PCA）并绘图，以评估样本生物学重复的可靠性。在此基础上，以TG组为处理组、HC组为对照组，以差异倍数（fold change，FC）≥1.5或≤0.667且P＜0.05为条件筛选差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。
1.3.11 real-time PCR检测
基于RNA-Seq测序数据富集分析结果，将筛选出的调控羔羊肌纤维氧化应激水平的候选基因进行realtime PCR验证，采用Primer 5.0软件设计引物（表1）。提取总RNA并采用分光光度计测定RNA浓度及OD260 nm/OD280 nm，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，采用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMIX for qPCR试剂盒将待测RNA逆转录为cDNA。引物由上海欧易生物医学科技有限公司设计并由北京擎科新业生物技术有限公司合成。
表1 目标基因real-time PCR引物序列信息
Table 1 Information on primer sequences used for real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction analysis of target genes
基因正向引物序列（5’→3’）反向引物序列（5’→3’）产物长度/bpGAPDH（山羊）TGACCTTCACTACATGGTCTACTTGATGTTGGCAGGAT 146 FOXO1（重设2）TCTGACTTCTGTTGACCTAGCTCTGTGTTCTTGTTAAACGTGG 103 HMOX1（重设2）ACCAAGTTCAAGCAGCTGTACTGGATGTTGAGCAGGAAG 111 IFI6TCATTGATGAGCTGGTCGGGACTTGCTTGTGGACAGTATAG 150 MCL1（重设1）GCTGGCGATGAGGGTTTAGCACGTATGTAGTCAGCACTTA 100 PDGFB（重设2）ATTGGAAGACGTGGACTCCCACCTACATCCACCTTCAA 109 PDK4GAGCATTTCTCGCGCTACTAGCCTCACAGGCAACTC 123
按照试剂盒说明书，采用PerfectStartTM Green qPCR SuperMix试剂盒在real-time PCR仪上进行real-time PCR反应，程序：94 ℃、30 s；45 个循环（94 ℃、5 s，60 ℃、30 s）。循环结束后利用熔解曲线检测产物特异性，由60 ℃缓慢升至97 ℃，1 ℃采集5 次荧光信号。基因相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。
1.4 数据处理
所有数据均重复测定3 次，结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 25.0软件进行独立样本t检验，分析组间差异显著性，以P＜0.05表示差异显著。采用Origin 2022软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 日粮添加百里香酚对羔羊肌纤维抗氧化状态的影响
如图1A所示，TG组羔羊肉总酚含量极显著高于HC组（P＜0.01）表明日粮中添加的百里香酚被羔羊摄入后经代谢吸收并有效沉积于肌肉组织中，与Álvarez-Rodríguez等[10]的研究结果一致。羊肉总酚含量对肉品风味、抗氧化性能和营养价值等具有积极影响[11]。Sharafati-Chaleshtori等[12]研究也证实，在羊肉中添加多酚可有效改善羊肉风味、抗氧化特性，并能够提高整体接受度，同时延长保质期。
图1 日粮添加百里香酚对羔羊肌纤维抗氧化状态的影响
Fig. 1 Effect of dietary thymol supplementation on the antioxidant status of lamb muscle fibers
如图1B、C所示，TG组羰基含量显著低于HC组（P＜0.05），而总巯基含量极显著高于HC组（P＜0.01）。肌原纤维蛋白骨架侧链上的NH-或
对ROS极为敏感，易被氧化为羰基，因此羰基含量越高表明蛋白质氧化程度越高[13]。此外，氧化应激条件下肌原纤维蛋白中的巯基易受ROS攻击而转化为二硫键、磺酸、亚磺酸及次磺酸，因此总巯基含量越低表明蛋白质氧化程度越高[14]。由此可知，HC组羔羊肌肉蛋白氧化程度较TG组更严重。一方面，高精料可能导致羔羊瘤胃酸性物质积累过多，引发酸中毒并破坏机体氧化应激平衡，从而加剧肌原纤维蛋白氧化，这在Zeng Jianlin等[15]的研究中也得到证实。另一方面，TG组日粮中添加的百里香酚作为抗氧化剂，可有效增强肌原纤维蛋白的抗氧化能力。综上，百里香酚的添加能有效抵消由高精料日粮饲喂诱导的氧化应激。
由图1D所示，TG组TBARS值极显著低于HC组 （P＜0.01）。脂质氧化过程中产生的丙二醛是反映脂质氧化程度的重要标志物[16]。MDA可与TBA发生缩合反应生成红色MDA-TBA加合物，因此TBARS值可准确反映脂质氧化酸败程度[17]。由此可知，HC组脂质氧化程度较TG组更严重。肌肉脂质氧化主要由血红素蛋白介导，当血红素蛋白结合氧时会释放促氧化剂，诱发脂质氧化，而多酚类物质可与血红素蛋白的活性基团反应，使氧化型血红素蛋白转化为还原型血红素蛋白，进而丧失促氧化活性[18]。这可能是日粮添加百里香酚能够提高羔羊肉脂肪抗氧化能力的关键原因之一。
由图1E可知，HC组ROS水平显著高于TG组（P＜0.05），表明日粮添加百里香酚可有效降低羔羊肌纤维ROS水平。过量ROS可导致线粒体膜氧化损伤和通透性改变，促使凋亡诱导因子释放到胞浆中，诱导细胞发生线粒体依赖性凋亡[19]，进而对羔羊肉品质产生影响。HC组细胞氧化应激水平比TG组高，这可能会对线粒体功能产生影响。CAT、SOD、GSH-Px活性和T-AOC是评估肉类抗氧化能力的重要指标[20]。CAT、SOD和GSH-Px活性直接反映肉品内源性抗氧化酶系的活性水平与功能状态，它们可通过协同清除ROS抵抗机体氧化应激。由图1F～I可知，TG组CAT、SOD、GSH-Px活性和T-AOC均显著高于HC组（P＜0.05、P＜0.01），进一步证实日粮添加百里香酚可有效增强肌肉的抗氧化能力。
由图2可知，在抗氧化相关指标中，羰基含量与总巯基含量呈显著负相关（P＜0.05）；羰基含量与TBARS值、ROS水平呈显著正相关（P＜0.05），而总巯基含量则与之呈显著负相关（P＜0.05）。ROS水平与SOD、CAT及GSH-Px活性呈显著负相关（P＜0.05），TBARS值也与之呈负相关；T-AOC与各抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性均呈正相关，提示各氧化与抗氧化指标间存在密切的协同或拮抗关联。
图2 羔羊肌纤维抗氧化指标间的相关性热图
Fig. 2 Correlation heatmap of antioxidant indexes in lamb muscle fibers
2.2 日粮添加百里香酚对羔羊肌纤维线粒体功能的影响
线粒体脂质过氧化是导致线粒体损伤的主要原因[21]，线粒体脂质过氧化的程度可反映线粒体损伤情况。如图3A所示，HC组线粒体脂质过氧化水平显著高于TG组（P＜0.05），表明HC组因氧化应激导致的线粒体损伤更为严重，而TG组可能因日粮中添加百里香酚而缓解了肌纤维线粒体损伤程度，这与Wu Tianshu等[22]的研究结果一致。当肌纤维线粒体因氧化应激受到损伤时，Ca2+在线粒体内过度累积将导致Ca2+超载。如图3B所示，HC组线粒体Ca2+含量显著高于TG组（P＜0.05），此过程可能通过增加线粒体膜流动性破坏线粒体功能，进而调控细胞凋亡。
图3 日粮添加百里香酚对羔羊肌纤维线粒体功能的影响
Fig. 3 Effect of dietary thymol supplementation on mitochondrial function in lamb muscle fibers
线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）是一种跨越线粒体内外膜的非选择性、高导电性复合通道，允许分子质量＜1.5 kDa的分子通过[23]。Tris-HCl混合溶液在540 nm波长处的吸收度可反映线粒体膜通透性，较低吸光度表明透过mPTP的光信号越强，线粒体膜通透性越高[24]。如图3C所示，HC组A540 nm显著低于TG组（P＜0.05），表明其线粒体膜通透性更高。mPTP过度开放将导致线粒体膨胀、外膜破裂和形态学损伤[25]，同时引起线粒体膜电位降低和离子选择性丧失，进而引发大量Cyt c释放。线粒体膜电位作为影响线粒体功能和细胞健康的关键因素，不仅参与ATP合成的调控，还介导金属阳离子转运和ROS调节等生物学过程[26]。如图3D所示，TG组膜电位显著高于HC组（P＜0.05），表明日粮添加百里香酚可有效缓解高精料育肥导致的线粒体膜电位异常。近期一项关于多酚化学动力学疗法联合策略研究[27]证实了多酚在调节ROS生成和线粒体膜电位方面的潜在作用，可为本研究结果提供理论依据。
如图3E所示，HC组线粒体Cyt c还原水平显著低于TG组（P＜0.05），表明日粮添加百里香酚可显著提升羔羊肉Cyt c还原水平。已有研究证实，仅氧化型Cyt c能够激活Caspase家族并启动凋亡程序，而还原型Cyt c不具备促细胞凋亡作用[28]。因此，氧化型Cyt c含量越高越易引发细胞凋亡，也即较低的Cyt c还原水平（更高的氧化水平）意味着更强的凋亡倾向。TG组表现出更高的Cyt c还原水平，表明该组羔羊肌纤维更不易发生细胞凋亡。Caspase-3和Caspase-9在细胞凋亡途径中起关键作用，Caspase-9为启动剂，Caspase-3在程序性细胞死亡过程中充当执行者[29]。如图3F所示，TG组Caspase-3和Caspase-9活性均极显著低于HC组（P＜0.01）。当细胞受到内部凋亡信号刺激时，线粒体膜通透性发生改变，Cyt c释放至细胞质并与凋亡酶激活因子结合。随后，该复合物招募并同源活化Caspase-9酶原，活化的Caspase-9进一步切割并激活Caspase-3和Caspase-7酶原，从而引发细胞凋亡[30]。综上，百里香酚通过抑制凋亡酶活性，有效阻断肌纤维线粒体依赖性凋亡途径。
2.3 日粮添加百里香酚羔羊肉转录组学分析
如图4A所示，基于FPKM值共筛选出948 个DEGs，其中上调基因653 个、下调基因295 个。如图4B所示，TG组与HC组在mRNA表达上存在明显差异，表明日粮添加百里香酚对羔羊肉基因表达模式产生系统性影响。如图4C所示，前10 位基因本体论（gene ontology，GO）条目均呈现显著富集，其中8 个基因（CCN2、IFI6、PDK4、LOC101117112、LOC114108759、DDIT4、PDGFB和PMAIP1）与ROS代谢过程相关。如图4D所示，京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分类筛选出20 条显著富集通路，通过STRING数据库和Cytoscape将氧化应激和细胞凋亡相关通路DEGs构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。如图4E所示，以置信度≥0.4和度值为筛选条件，共鉴定出35 个核心差异基因，其中，IL6、MCL1、HMOX1和FOXO1与氧化应激密切相关。
图4 日粮添加百里香酚对羔羊肌肉抗氧化能力影响的转录组学分析
Fig. 4 Transcriptomic analysis of the effect of dietary thymol supplementation on the antioxidant capacity of lamb muscle fibers
IFI6作为干扰素刺激基因，其过度表达可降低HCT116和SW620细胞对奥沙利铂的敏感性[31]。相较于HC组，TG组IFI6基因表达上调，这与TG组ROS水平下降、凋亡酶Caspase-3与Caspase-9活性降低现象相一致，表明IFI6可能是调控羔羊肌纤维氧化应激水平的潜在标志基因。
丙酮酸脱氢酶激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 4，PDK4）作为丙酮酸脱氢酶激酶同工酶，在不同生物学背景下通过多种机制调控细胞内ROS水平方面发挥关键作用，Gao Xuan等[32]在蛛网膜下腔出血后早期脑损伤模型中发现，PDK4过表达可通过促进丙酮酸脱氢酶磷酸化抑制其活性，进而通过减弱ROS-凋亡信号调节激酶1/p38信号通路降低氧化应激和神经元细胞凋亡，表明PDK4可能具有降低ROS水平和抵抗氧化应激的潜力。此外，在卵母细胞研究中[33]也观察到，ROS积累会抑制沉寂信息调节因子1表达并加剧氧化应激，而PDK4则通过抑制三羧酸循环降低ROS水平，从而改善线粒体功能并延缓卵母细胞衰老。本研究中，日粮添加百里香酚能够显著上调羔羊肌纤维中PDK4表达水平，且该变化与肌纤维ROS水平降低存在关联，表明PDK4可作为调节羔羊肌纤维氧化应激水平的候选基因。
血小板衍生生长因子B（platelet-derived growth factor B， PDGFB）是血小板源性生长因子家族成员。Cabezas等[34] 研究证实，PDGFB可通过调控细胞骨架蛋白和增强神经红蛋白表达降低鱼藤酮诱导的星形胶质细胞内ROS水平，从而发挥细胞保护作用并维持线粒体超微结构完整性。另一项针对PDGFB神经保护机制的研究[35]进一步揭示，PDGFB能够有效抑制神经元内Ca2+过载和钙蛋白酶活化，提示其可能通过调节钙泵通路增强线粒体抗氧化应激能力。本研究结果显示，日粮添加百里香酚可显著上调羔羊肌纤维PDGFB基因表达，这可能是TG组线粒体Ca2+含量降低的关键原因。综上所述，PDGFB在调控羔羊肌纤维氧化应激过程中可能发挥着关键作用，可被视为潜在的候选基因。
白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）作为一种功能广泛的多效性细胞因子，在细胞生长分化、免疫调节及造血功能等方面发挥重要作用。IL6表达上调可通过多种机制增强不同细胞类型的抗氧化能力。Brown等[36]研究发现，IL-6可通过上调Mn-SOD表达水平抵消多发性骨髓瘤治疗引起的细胞氧化应激。此外，IL6可通过诱导SOD表达增加中介肿瘤细胞对氧化应激的抵抗力。以上研究均表明IL6可通过提高SOD活性增强细胞抗氧化能力。另一项研究[37]表明，IL6上调能通过诱导B细胞淋巴瘤/白血病2 （B-cell lymphoma 2，Bcl-2）表达防止ROS引起的线粒体损伤，并通过调控Bcl-2同源拮抗剂/杀伤蛋白（Bcl-2 homologous antagonist/killer，Bak）与线粒体相互作用增强抗细胞氧化能力。本研究中，日粮添加百里香酚可通过上调IL6表达增强肌纤维的抗氧化能力，因此IL6可作为调节羔羊肌纤维氧化应激水平的候选基因。
髓系细胞白血病 1（myeloid cell leukemia 1，MCL1）蛋白是Bcl-2家族重要的抗凋亡蛋白成员之一，作为线粒体凋亡途径的关键调因子，其通过定位于线粒体外膜抑制Bcl-2相关X蛋白和Bak活化，从而发挥抗凋亡作用[38]。本研究发现，MCL1表达上调且与其他差异基因存在密切相互作用，MCL1通过阻止烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4表达抑制线粒体ROS产生[39]，这与本研究中TG组肌纤维ROS水平降低的结果相吻合，表明MCL1可作为调节羔羊肌纤维氧化应激水平的候选基因。
血红素氧合酶1（heme oxygenase 1，HMOX1）作为血红素分解代谢的限速酶，在抗氧化防御中发挥重要作用。Attucks等[40]研究表明，通过调节剂诱导HMOX1表达上调可显著增强细胞抗氧化能力，其机制涉及通过调节BTB和CNC同源体1活性激活核因子红细胞2相关因子2信号通路。本研究发现百里香酚可能通过上调羔羊肌纤维HMOX1基因表达增强细胞的抗氧化能力，因此HMOX1同样可视为调节羔羊肌纤维氧化应激水平的候选基因。
叉头框蛋白O1（forkhead box protein O1，FOXO1）是一种多功能转录因子，在调节细胞氧化应激反应、增殖、凋亡、自噬、代谢和免疫应答等多种生理过程中发挥重要作用，其功能主要通过调控生长因子和细胞因子信号通路的转录活性实现[41]。FOXO1在细胞抗氧化防御系统中具有关键作用。一项关于疱疹病毒细胞增殖与转化研究[42]发现，FOXO1表达上调可通过增强CAT活性平衡ROS水平，从而促进细胞增殖和转化，表明FOXO1可提高细胞抗氧化能力。此外，Huang Xiaojun等[42]进一步证实，FOXO1过表达可改善肿瘤坏死因子α诱导的氧化损伤，并通过增强抗氧化防御系统促进人牙周膜干细胞成骨分化。本研究中，相较于HC组，TG组FOXO1基因表达上调，这进一步解释了TG组ROS水平下降的现象，表明FOXO1可能是调控羔羊肌纤维氧化应激水平的潜在标志基因。此外，虽然CCN2[43]、LOC101117112、LOC114108759和PMAIP1[44]也可能参与肌纤维氧化应激调控，但目前尚未发现其与ROS水平变化的直接证据。
为验证RNA-Seq数据的准确性，将所筛选出的调控羔羊肌纤维氧化应激水平的候选基因进行real-time PCR验证（图4F）。结果显示，除IL6经重设引物时预实验失败外，其他基因的熔解曲线均呈现单一峰，表明real-time PCR扩增特异性良好，所选DEGs相对表达量与测序结果高度一致，表明RNA-Seq测序真实可靠。
3 讨 论
3.1 百里香酚对羔羊肌纤维抗氧化防御系统的调控机制
SOD是细胞抵抗ROS介导损伤的第1道防线。当肌纤维因氧化应激而受损导致线粒体复合体功能失常和ROS过量产生时，SOD被激活并将超氧阴离子自由基歧化为H2O2和O2[45]。多酚类物质可通过2 种途径调节SOD活性：一是直接与SOD结合增强其活性[46]；二是通过改变SOD微环境或调控抗氧化相关基因表达间接影响其活性[47]。本研究中，日粮添加百里香酚可有效提高SOD活性，表明其能增强ROS清除效率，从而有效缓解羔羊肌纤维氧化应激损伤。GSH-Px是一种广泛存在于动物体内的重要过氧化物分解酶，在保护细胞免受ROS氧化损伤中发挥关键作用[48]。当SOD启动第1道防线将ROS转化为H2O2后，H2O2的强氧化性仍会持续破坏肌纤维线粒体。此时，GSH-Px通过催化还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）与H2O2反应，将其还原为H2O[49]。同时，GSH被氧化为氧化型谷胱甘肽。因此，GSH-Px活性水平可反映机体的抗氧化能力。本研究中，高精料饲喂导致的氧化应激降低了羔羊肉的抗氧化能力，而日粮添加百里香酚有效增强了肌纤维对氧化应激的抵抗能力。CAT是存在于细胞质和过氧化物酶体中的高效H2O2降解酶。然而，由于多数细胞线粒体缺乏CAT，导致线粒体内H2O2清除效率低下，特别是在氧化应激条件下，H2O2过量产生时更为显著[50]。这使GSH-Px-GSH系统在降解线粒体H2O2时易受到GSH水平的限制。当线粒体无法有效清除过量H2O2时，H2O2会透过受损的线粒体膜进入细胞质，此时肌纤维内的CAT活性增强以应对增加的H2O2负荷[51]。多酚类物质可有效提高CAT活性[52]，本研究中TG组CAT活性维持在较高水平也印证了这一发现。T-AOC是反映体内酶类和非酶类抗氧化剂协同作用的综合指标[53]。本研究中，HC组T-AOC显著低于TG组（P＜0.05），表明日粮添加百里香酚能够有效提高羔羊肉整体抗氧化能力。在高精料育肥过程中，随着ROS水平和氧化应激程度加剧，羔羊机体抗氧化酶系统逐渐受损，导致肌肉氧化稳定性失衡。这一过程不仅造成蛋白质巯基结构氧化损失，还将产生MDA和羰基等氧化产物。皮尔逊相关分析显示（图2），CAT、SOD、GSH-Px活性和T-AOC分别与羰基含量、TBARS值、ROS水平呈不同程度负相关，与总巯基含量呈正相关，进一步证实高精料饲喂诱导的氧化应激降低了羔羊肉的氧化稳定性，而百里香酚的添加有效缓解了这一过程。
值得一提的是，本研究中，TG组PDGFB表达上调，该基因具有抑制Ca2+过载和钙蛋白酶激活作用，表明日粮添加百里香酚增强羔羊肌纤维线粒体抗氧化能力可能从调控肌纤维相关基因表达开始。当肌纤维遭受氧化应激时，线粒体电子传递链功能紊乱导致ROS过量生成，此时SOD作为第1道抗氧化防线被激活，催化超氧阴离子自由基歧化为H2O2和O2[45]。转录组分析表明，日粮中的百里香酚通过上调IL6表达增强SOD活性。同样，TG组FOXO1表达上调也与其CAT活性增加密切相关。这些结果充分证明，TG组羔羊肉氧化稳定性的提升主要源于百里香酚对机体基因表达谱的调控作用，而非其直接的抗氧化特性。这一发现为理解植物源性添加剂通过表观遗传调控改善肌肉氧化稳定性提供了新的理论依据。
3.2 百里香酚改善线粒体功能及抗凋亡作用的分子机制
高精料育肥诱导的氧化应激会导致肌纤维线粒体功能障碍。ROS介导的钙蛋白酶失活可破坏线粒体Ca2+稳态调节[54]。线粒体Ca2+超载会激活mPTP，该孔道是线粒体内膜的高电导通道，其持续开放将导致线粒体膜电位崩溃并抑制ATP合成[55]。这一过程引发线粒体去极化，一方面促进Cyt c从线粒体基质释放至细胞质，另一方面导致过量ROS通过受损的线粒体膜进入基质，诱发脂质过氧化并加重线粒体损伤[56]。释放至细胞质的Cyt c与凋亡蛋白酶激活因子1结合形成凋亡复合体，进而招募细胞质中的Caspase-9酶原，Caspase-9酶原在凋亡复合体中发生同源活化后切割并激活Caspase-3酶原，进而引发细胞凋亡[30]。本研究证实，日粮添加百里香酚可有效降低肌纤维ROS水平并增强线粒体功能，具体表现为：有效缓解线粒体Ca2+超载现象，减少mPTP开放数量，同时提升线粒体膜电位与Cyt c还原水平。此外，线粒体膜脂质过氧化程度明显减轻，内源性线粒体凋亡通路中关键酶Caspase-3和Caspase-9活性也显著降低（P＜0.01）。以上结果表明，日粮中添加百里香酚可通过多靶点调控机制有效改善高精料育肥诱导的羔羊肌纤维线粒体氧化应激状态。
此外，TG组IFI6、PDL4、MCL1和HMOX1表达上调也可通过不同机制抑制ROS产生保护线粒体免受氧化应激损伤。另外，本研究还发现CCN2、LOC101117112、LOC114108759和PMAIP1 4 种抗氧化和细胞凋亡相关基因，但并无直接证据表明其参与氧化应激调控，其可能通过各种机制间接调控细胞ROS，这仍需进一步验证。
4 结 论
本研究发现，日粮添加百里香酚通过多途径改善羔羊肌纤维氧化还原状态：抑制肌原纤维蛋白与脂肪氧化、降低ROS水平、缓解Ca2+超载和线粒体脂质过氧化程度、减少mPTP开放数量、提高Cyt c还原水平及降低线粒体凋亡通路关键酶Caspase-3和Caspase-9活性。通过抗氧化相关指标测定和RNA-Seq分析发现，百里香酚通过上调PDGFB表达抑制Ca2+过载；通过上调IL6和FOXO1表达增强SOD和CAT活性，从而提升T-AOC，进而有效控制肌纤维ROS水平。综上，日粮添加百里香酚增强羔羊肌纤维抗氧化能力的作用机制始于对基因表达的调控。此外，通过富集分析筛选出7 个潜在调控羔羊肌纤维氧化应激的关键候选基因。
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