近20 年来，全球羊肉产量的持续增长与世界人均GDP的上升趋势相呼应，这种增长在某种程度上反映出生活水平的普遍提升带动了羊肉消费。然而，消费者偏好呈现出对放牧来源羊肉的显著倾向。因为天然放牧条件下的羊肉通常肉质优于高精料集中育肥模式下的羊肉，表现为更佳的肉色、质地及更健康的脂肪酸组成[1]，以及更高含量的特征性鲜味脂肪酸与风味氨基酸[2]。这些品质优势主要归因于放牧环境所提供的资源，如矿物质丰富的天然水源、多样化的草本植被以及洁净的土壤[3]。但目前全球范围内过度放牧已成为严峻的生态问题，在此背景下，中国推行了以草地禁牧、休牧为核心的草畜平衡管理制度。作为中国羊肉主产区的内蒙古，其肉羊养殖主导模式已转向高精料育肥。这一模式虽能加速育肥，但易诱发绵羊营养应激，导致瘤胃代谢物谱异常[4]。绵羊瘤胃代谢紊乱已被证实与机体氧化应激水平升高密切相关[5]，有研究[6]发现，高能量日粮饲喂显著提高了羔羊的体脂沉积、血清胆固醇、三酰甘油水平及整体氧化应激状态。宰前活体动物受到的氧化应激会直接影响宰后肌肉的成熟代谢过程[7]，进而影响羊肉的氧化稳定性、色泽等品质特性，最终影响肉品价值和消费者的食用体验。
线粒体作为发生氧化应激的主要场所，在细胞能量代谢、氧化还原水平和细胞死亡中起着核心作用[8]。当线粒体周转不能得到保证时，异常线粒体可能在细胞内积聚，加剧线粒体功能障碍，主要表现为线粒体蛋白和氧化还原代谢相关组分的异常。通常，这些现象导致ATP耗竭和活性氧（reactive oxygen species，ROS）增加。而线粒体在宰后成熟过程中对肉质调控起着至关重要的作用，其会影响氧气消耗、能量代谢和细胞凋亡等过程，这些因素反过来会影响肌红蛋白水平、氧化应激和蛋白质氧化等[9]。已有研究表明放牧的羊肉比高精料育肥的羊肉具有更好的氧化稳定性[10]，而在宰后成熟过程中氧化稳定性是影响肉质和风味的因素之一。人们也越来越意识到线粒体在宰后成熟中的潜在作用，通过线粒体可能更全面地解释肉色的变化[9]。动物的线粒体也会在宰后促进肌肉蛋白的氧化，从而影响肉的质量[11]。
蛋白组学技术可以对肉中的蛋白进行全面表征，从而深入了解肌肉到肉转化过程中发生的变化，也可以与生物信息学工具相结合帮助了解肉质特性背后的潜在分子机制[12]，在研究肉品质变化机制方面具有一定优势。虽然相关报道表明，饲喂高精料能通过诱导绵羊肌纤维线粒体氧化应激影响肉品质，但其具体影响机制尚不清楚。本研究旨在通过串联质谱标签（tandem mass tag，TMT）定量蛋白组学分析比较高精料育肥与放牧饲养条件下绵羊肉品质和肌纤维线粒体状态与功能的变化，为饲养方式对绵羊肉品质的影响机制提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
本动物实验研究得到了内蒙古农业大学机构动物护理和使用委员会的批准，并符合国家动物福利法规（批准号：NND2022106）。
选取10 只健康、体质量（50.00±4.00）kg的3 月龄杂交公羔羊（蒙古羊×小尾寒羊），按组间体质量差异不显著原则随机分为天然放牧组（PF）和高精料育肥组（HC），每组5 只。其中，PF组肉羊在天然草场自由采食，不补充精料；HC组肉羊饲喂精粗比为7∶3的育肥日粮，基础日粮由粗饲料混合牧草和精补料组成，精补料配方：玉米67%、麸皮9%、豆粕12%、棉粕10%、石粉1%、食盐0.5%、微量元素0.5%。预饲期为15 d，正饲期为60 d。
尿素、盐酸、磷酸、硝酸、盐酸胍、氯化钾、乙酸乙酯、浓硫酸、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、无水乙醇、氢氧化钠、三氯甲烷、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH） 国药集团化学试剂有限公司；乙酸乙酯 上海麦克林生化科技股份有限公司；5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、Tris-HCl、二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯 北京索莱宝科技有限公司；蛋白酶抑制剂 德国Merck公司；胰蛋白酶 美国Promega公司；二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA） 美国Sigma公司；TMT试剂盒（A43073） 美国赛默飞世尔科技公司；以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
HS 4磁力搅拌器 德国IKA公司；TGL-20B离心机 上海安亭科学仪器厂；Allegrax-30R高速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司；U-2910紫外-可见分光光度计 日本Hitachi公司；XHF-DY高速分散器 宁波新芝生物科技股份有限公司；VORTEX 2旋涡振荡器、All basic研磨杯 德国IKA公司；PHS-3C数字式pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；CR-20色差仪 日本Konica Minolta公司；KDY-9830凯氏定氮仪 北京市通润源机电技术有限责任公司；SOX606脂肪测定仪山东海能科学仪器有限公司；SX2-4-10马弗炉 上海一恒科技有限公司；SYNERGY H1火焰原子分光光度计美国耶拿分析仪器股份公司；ZEEnit 700P酶标仪 雷康 恒泰（北京）商贸有限公司；EXPEC 5210高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪 诺普科技发展（北京）有限公司；Ascentis C18色谱柱（25 cm×4.6 mm，5 μm） 德国Merck公司。
1.3 方法
1.3.1 饲养管理
实验前将羊舍进行彻底消毒，实验期间，羊舍定期打扫和消毒，自然通风。实验羊只每天8:00和18:00进行2 次饲喂，安装独立食槽和饮水装置，保证羊只自由采食和饮水。
1.3.2 样品采集与测定
实验结束后，实验用羔羊现场屠宰，宰前禁食24 h，屠宰时，每个处理组屠宰5 只肉羊，平均活体质量分别为（51.57±3.90）kg（PF）和（49.91±3.80）kg（HC），胴体质量分别为（25.27±1.91）kg（PF）和（24.46±1.86）kg（HC），取相同部位背最长肌进行现场检测，对于不能现场检测的指标立即在液氮中快速冷冻，待测。
1.3.3 宰后绵羊肉常规营养成分含量及肉色测定
水分含量、灰分含量、粗蛋白含量及粗脂肪含量的测定分别参照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》、GB 5009.4—2016《食品中灰分的测定》、GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》和GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》。肉色的测定使用经自检及白板、零点校准后的色差仪，随机选择肉样，沿垂直肌纤维的方向切取3 cm×3 cm×2 cm的肉块，测定亮度值（L*）、红度值（a*）和黄度值（b*）。
1.3.4 宰后绵羊肉羰基含量测定
将1 g切碎的样品与10 mL 0.15 mol/L KCl溶液匀浆（10 000 r/min，10 s/次，3 次），吸取0.1 mL匀浆物至2 mL离心管中，向其中加入1 mL 10 g/100 mL TCA溶液，离心（2 000×g、10 min），并除去上清液。一管添加1 mL 0.2 g/100 mL DNPH溶液（溶于2 mol/L HCl），一管添加1 mL 2 mol/L HCl溶液作为对照组。室温静置1 h（每20 min涡旋1 次）后，加入1 mL 10 g/100 mL TCA溶液，将样品涡旋并再次离心（2 000×g、10 min）。除去上清液，将沉淀用1.5 mL乙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）洗涤，混匀，并在15 000×g下离心5 min，重复2 次。然后将沉淀溶于1.5 mL 6 mol/L盐酸胍溶液（溶于pH 6.5的20 mmol/L磷酸钾缓冲液）中，涡旋混匀，离心（4 000×g、3 min）取上清液，分别在370、280 nm处测定吸光度（A370 nm、A280 nm）。羰基含量按式（1）、（2）计算：
式中：22 000为摩尔吸光系数/（L/（mol·cm））。
1.3.5 宰后绵羊肉巯基含量测定
取1 g切碎至小米粒大小的肉样加入9 mL 0.6 mol/L 氯化钾溶液，匀浆3 次（10 000 r/min，10 s/次，3 次），之后使用脱脂棉纱布过滤匀浆液，取0.1 mL滤液，加入2.5 mL磷酸缓冲液（含0.1 mol/L KH2PO4/K2HPO4、1 mmol/L EDTA、8 mol/L尿素，pH 8.0）、0.05 mL 10 mmol/L DTNB溶液，混匀后避光（黑纸或锡箔纸包裹）放置15 min，离心（4 500×g、5 min）取上清液，分别在412、595 nm处测定吸光度（A412 nm、A595 nm）。巯基含量按式（3）、（4）计算：
式中：13 600为摩尔吸光系数/（L/（mol·cm））。
1.3.6 宰后绵羊肌纤维线粒体状态与功能测定
线粒体蛋白的分离、细胞内ROS含量测定参照Zhang Jiaying等[13]的方法。采用酶标仪测定孵育后荧光强度（激发波长488 nm、发射波长525 nm），ROS水平以荧光强度表示。线粒体脂质过氧化水平测定参照Zhang Jiaying等[14]的方法，结果以组织中的丙二醛含量表示。线粒体Ca2+含量和线粒体膜通透性测定参照Wang Linlin等[15]的方法。细胞色素c（cytochrome c，Cytc）氧化还原状态测定参照Zhang Jiaying等[13]的方法。Cytc还原水平以每毫克蛋白质在550 nm与535 nm处的吸光度差值表示。
1.3.7 TMT蛋白提取、酶解、标记和高效液相色谱-质谱测定
样品经液氮研磨后，加入4 倍体积裂解缓冲液（8 mol/L尿素、1 g/100 mL蛋白酶抑制剂、2 mmol/L EDTA）超声（功率120 W）处理，12 000×g离心10 min取上清。采用BCA法测定蛋白浓度后，蛋白经20 g/100 mL TCA溶液沉淀，丙酮洗涤，使用50 µL 200 mmol/L三乙基碳酸氢铵（triethylammonium bicarbonate，TEAB）溶液溶解。加入胰蛋白酶（1∶50，m/m）37 ℃酶解过夜，依次加入DTT（5 mmol/L，56 ℃、30 min）和IAA（11 mmol/L， 室温避光15 min）进行还原烷基化。得到的肽段经C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）除盐后，按TMT试剂盒说明书标记（0.5 mol/L TEAB溶液溶解，乙腈孵育2 h）。高pH值反相高效液相色谱（Agilent 300Extend C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm）分级。对肽段进行分离，流动相A（含0.1%甲酸的2%乙腈溶液）和B（含0.1%甲酸的90%乙腈溶液）梯度洗脱（0～26 min，7%～26% B；26～34 min，26%～38% B；34～37 min，38%～80% B；37～40 min，80% B），流速450 nL/min。 肽段经由高效液相色谱系统分离后被注入纳升电喷雾电离离子源中进行电离，然后进质谱仪进行分析。离子源电压设置为2.1 kV，肽段母离子及其二级碎片均使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为m/z 350～1 600，扫描分辨率设置为120 000；二级质谱扫描范围则固定起点为m/z 100，扫描分辨率设置为30 000。数据采集模式使用数据依赖型扫描程序，即在一级质谱扫描后选择信号强度最高的前20 个肽段母离子依次进入高能C阱裂解碰撞池，使用28%的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。为提高质谱的有效利用率，自动增益控制设置为1×105，信号阈值设置为8.3×104 ions/s，最大注入时间设置为50 ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为30 s，避免母离子的重复扫描。
1.3.8 蛋白组学分析
利用景杰生物云平台进行数据分析。采用R语言中的t-test函数计算组间差异显著性P值和差异倍数（fold change，FC），显著性检验P＜0.05，同时|log2FC|≥1.2的蛋白为差异表达蛋白（differentially expressed proteins，DEPs）。采用基因本体论（gene ontology，GO）数据库（http://geneontology.org/）对所有的DEPs从生物过程、细胞组分和分子功能3 个方面进行注释、功能聚类，采用京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）（http://www.genome.jp/kegg//）通路数据库对DEPs进行分析，所有蛋白名称均来自UniProt数据库。
1.4 数据处理
实验数据以平均值±标准差表示，使用描述性统计方法进行显著性分析，通过Microsoft Excel与Origin软件进行数据处理和作图，采用SPSS 25.0软件的独立样本t检验进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 饲养方式对宰后绵羊肉品质的影响
如图1A所示，HC组绵羊肉的水分和灰分含量均低于PF组且灰分含量差异具有显著性（P＜0.05），由于放牧期间羔羊摄入了土壤中的矿物质等金属元素，可能是导致PF组灰分含量高于HC组的原因。而HC组的粗蛋白和粗脂肪含量均高于PF组，其中粗脂肪含量差异具有显著性（P＜0.05）。羊肉中脂肪和脂肪酸的含量受饲养系统的影响，与高精料育肥羊相比，通常以放牧饲养为主的羔羊脂肪含量更低。肉色对消费者的购买有重大影响，消费者更喜欢颜色鲜红的羊肉，因为它与新鲜度和更好的肉品质联系在一起[16]。如图1B所示，PF组绵羊肉比HC组具有更高的a*，这可能是PF组绵羊肉中肌纤维的细胞色素和肌红蛋白含量较高导致的[17]。PF组绵羊肉的L*与b*均高于HC组。
图1 饲养方式对宰后绵羊肉品质的影响
Fig. 1 Influence of feeding methods on the quality of post-slaughter lamb meat
HC组的羰基含量极显著高于PF组（P＜0.01）（图1C），而巯基含量极显著低于PF组（P＜0.01）（图1D）。肌原纤维蛋白骨架侧链上带有NH-或
的氨基对ROS很敏感，在氧化过程中，这些基团易被氧化成羰基基团，所以羰基含量越高，表明蛋白质氧化程度越高[18]。而当受到氧化应激时，肌原纤维蛋白中巯基易被ROS攻击，转化为二硫键、磺酸、亚磺酸及次磺酸，所以巯基含量越低，表明蛋白质氧化程度越高[19]。这2 个实验结果均表明HC组的蛋白氧化程度比PF组更严重。
2.2 饲养方式对绵羊宰后肌纤维线粒体状态与功能的影响
由图2A可知，HC组绵羊宰后肌纤维ROS含量极显著高于PF组（P＜0.05），表明饲喂高精料使羊肉的ROS含量升高。有研究[20]表明，ROS造成线粒体膜氧化损伤和线粒体通透性失调，导致凋亡诱导因子从线粒体释放到胞浆中，诱导细胞发生线粒体依赖性凋亡，进而对绵羊肉品质产生影响。本研究结果表明，HC组绵羊肌纤维氧化应激水平高于PF组，这可能会对线粒体的功能产生影响。
图2 饲养方式对绵羊宰后肌纤维线粒体状态与功能的影响
Fig. 2 Influence of feeding methods on the mitochondrial status and function of post-slaughter lamb muscle fibers
线粒体发生脂质过氧化是导致线粒体损伤的主要原因[21]，可以通过线粒体脂质过氧化程度反映线粒体损伤情况。由图2B可知，HC组绵羊宰后肌纤维线粒体脂质过氧化水平极显著高于PF组（P＜0.01），表明HC组由于氧化应激导致线粒体受损伤程度更高。
当线粒体因氧化应激受到损伤时，Ca2+在线粒体中不断累积导致线粒体内Ca2+超载，引起线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）开放，改变膜通透性，从而诱导线粒体凋亡途径的发生。本研究发现，HC组线粒体Ca2+含量升高但与PF组差异不显著（图2C），此过程可能通过线粒体膜流动性增加破坏线粒体功能，进一步调控细胞凋亡。Donnarumma等[22]实验发现，Ca2+超载通过诱导线粒体分裂蛋白1缺失，使心肌线粒体mPTP开放程度增加，这一发现与本研究结果相吻合。
为进一步探究Ca2+超载对肌纤维线粒体的影响，测定线粒体膜通透性。mPTP是一种跨越线粒体内外膜的非选择性、高导电性复合通道，允许任何分子质量低于1.5 kDa[23]的分子通过。本研究在540 nm处测定Tris-HCl混合溶液的吸光度，根据紫外分光光度计原理，较低的吸光度说明能被检测到的透过mPTP的光越多，表明线粒体膜通透性较高[24]。实验结果显示，HC组线粒体膜通透性极显著高于PF组（P＜0.05）（图2D），mPTP的过度开放导致线粒体扩张，外膜破裂，线粒体形态被破坏[25]。同时也使线粒体膜电位降低，离子流选择性丧失，从而引起大量Cytc释放，进而加剧线粒体ROS的积累，最终导致细胞死亡[26]。因此研究结果表明，HC组由于氧化应激导致线粒体损伤更严重。
HC组线粒体Cytc还原水平极显著低于PF组（P＜0.01）（图2E），表明饲喂高精料使羊肉的Cytc还原水平降低。有研究表明，只有氧化型Cytc能够激活Caspase家族，还原型Cytc没有启动细胞凋亡的作用[27]，所以氧化型Cytc含量越多，越容易发生细胞凋亡。在本实验中，HC组相比于PF组Cytc还原水平低，这表明HC组更容易发生细胞凋亡。
2.3 饲养方式对绵羊肌肉影响的蛋白组学分析
样本产生了足够的二级谱图，并映射到16 724 条特异性肽段。如图3A所示，在HC组和PF组之间总共鉴定出303 个DEPs。相较于PF组，HC组中205 个蛋白显著过表达，而98 个蛋白的表达显著下调。
图3 饲养方式对绵羊肌纤维影响的蛋白组学分析
Fig. 3 Proteomic analysis of the effects of feeding methods on lamb muscle fibers
通过对DEPs进行GO富集分析，发现了关键调控节点，根据注释术语的富集程度，揭示了相关的生物学过程或细胞定位。如图3B所示，最丰富的生物学过程有线粒体呼吸链复合物、线粒体内膜蛋白复合物、NADH脱氢酶复合物、NADH脱氢酶复合物及活性、过氧化氢代谢等，这些过程主要发生在线粒体的氧化磷酸化途径中。
为进一步揭示关键调控通路，进行KEGG功能富集分析，可以根据富集的生物调控过程对蛋白进行分类。筛选了富集后P值在前20 位的KEGG途径，如图3C所示，KEGG途径中产热过程、非酒精性脂肪性肝病、帕金森病、氧化磷酸化、同种异体排斥反应、自身免疫性甲状腺疾病等生物学过程显著富集（P＜0.05），其中注释到产热过程、非酒精性脂肪性肝病、帕金森病中的DEPs主要是由氧化磷酸化途径提供的。氧化磷酸化共富集25 个DEPs，如表1所示。
表1 HC组富集到氧化磷酸化途径中的25 个DEPs
Table 1 Twenty-five DEPs enriched in the oxidative phosphorylation pathway in the HC group
注：-.未查询到该蛋白对应的基因名称。
蛋白ID基因名称表达类型W5PI58NDUFA9上调W5PWF1NDUFB11上调W5NQT7NDUFAB1上调W5P473-上调W5PYA5NDUFA8上调W5QBF5NDUFA10上调W5Q341NDUFA12上调W5PVD7NDUFB2上调W5QF73NDUFB4上调W5QHN8NDUFB5上调W5P8R0NDUFA4上调W5PL66PPA2上调W5QC06NDUFA6上调W5PZE3NDUFB6上调W5PNX7NDUFA5上调W5PF18LOC101102454上调W5NRY1NDUFV2上调W5PGA3NDUFB9上调W5QG39-上调W5PXG3-上调O78751MT-ATP8上调O78748MT-ND2上调O78753MT-ND3上调O78747MT-ND1上调O78752MT-ATP6上调
此外，由于蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）在生理过程中的关键作用，许多生理生化现象都是PPI异常的结果[28]。将得到的全部DEPs通过STRING数据库和Cytoscape构建DEPs的PPI网络（图4A），以置信程度为高置信度（0.7）和度值筛选出18 个核心DEPs，发现其中有15 个参与了氧化磷酸化通路。
图4 饲养方式对绵羊肌纤维影响的PPI网络图与皮尔逊相关性分析
Fig. 4 Protein-protein interaction network and Pearson’s correlation analysis for the effects of feeding methods on lamb muscle fibers
为进一步探究影响机体氧化应激的因素，分析氧化磷酸化通路中DEPs与线粒体功能的相关性，发现线粒体的状态和功能与氧化磷酸化通路中25 个DEPs均有不同程度的相关性（图4B），表明从氧化磷酸化通路探究绵羊机体发生氧化应激的机制有一定意义。
3 讨 论
ROS过量产生时会作用于多种细胞过程，如胞质钙超载、脂质的直接氧化损伤、凋亡、坏死和炎症等[29]。这一观点在本研究中得以证实，HC组产生含量远高于PF组的ROS，同时线粒体脂质过氧化水平、Ca2+含量、线粒体膜通透性和Cytc还原水平的检测结果也均表明HC组线粒体受到的氧化应激损伤高于PF组。
此外，ROS过量产生的原因也值得探究，有研究[30]指出，线粒体是最主要的ROS来源，肌纤维内近90%的ROS由线粒体产生。因此本研究通过TMT蛋白组学及相关分析手段发现，HC组与PF组的DEPs主要发生在氧化磷酸化通路中。氧化磷酸化通路是发生在线粒体中的一个主要细胞过程，由线粒体电子传递链（electron transport chain，ETC）与ATP合酶一起构成，ETC由4 个多亚基蛋白质复合体（CI、CII、CIII、CIV）组成[31]。由于ETC的功能涉及电子传递和氧化还原反应，意外的电子逃逸可以诱导形成超氧阴离子和其他下游与ROS相关的分子[32]，所以ROS的产生取决于许多因素，包括线粒体底物、O2浓度、ATP合成速率和ETC复合体水平等[33]。
CI又称NADH脱氢酶，由45 个亚基组成，是已知最大的多亚基膜蛋白复合物之一，图5显示了已被证实的38 个亚基的相对位置分布，其余7 个亚基的信息尚不清楚[34]。本研究HC组处理导致的25 个上调DEPs中有19 个位于CI，其中NDUF基因家族的16 个蛋白上调，ND基因家族的3 个蛋白上调（图5）。NDUF基因属于核基因组，主要形成CI的基质臂，作为NADH和电子传递途径的电子受体[35]。因此，NDUF家族的基因表达发生变化可能会影响CI的结构和功能，导致更多的电子从ETC逃逸，形成超氧化物。而ND基因属于线粒体基因组，形成CI的臂膜，在传递质子方面起作用[36]。ND基因的上调可能提示有更多质子从线粒体基质转移到膜间隙，导致膜电位升高。而高膜电位环境下更有利于线粒体产生超氧化物[37]。
图5 饲养方式对绵羊肌纤维影响的DEPs在CI上的分布情况
Fig. 5 Effect of feeding methods on CI distribution of DEPs that affect sheep muscle fibers
NDUFV2是CI的一个核心亚基，位于NADH结合区域。Chella Krishnan等[38]发现，NDUFV2过表达时通过修饰CIII的二聚复合物和超复合物之间的分布导致ROS生成，这一发现与本研究中HC组NDUFV2表达上调的同时ROS含量极显著高于PF组的结果相吻合。在Xu Weihong等[39]的实验中，发现抑制NDUFA4的表达能抑制胃癌细胞ROS水平，促进线粒体膜电位水平升高。本研究中相较于HC组，PF组NDUFA4表达被抑制，意味着PF组ROS含量被抑制，这也印证了本研究中ROS含量的测定结果。
NDUFA6是存在于CI中成脂分化的关键调控因子，氧化磷酸化途径对正常成脂分化至关重要[40]，在成脂分化过程中，细胞保持高水平的代谢活性，底物消耗增加，线粒体含量显著增加，β-氧化水平较高[41]。Zhang Jingwei等[42]的研究结果表明，NDUFA6的上调显著促进成脂分化，这一结论可能揭示了本研究中HC组粗脂肪含量显著高于PF组的内在机制，NDUFA6通过硬脂酰辅酶A和去饱和酶的介导调控干细胞进行成脂分化。
4 结 论
高精料育肥诱导绵羊肌纤维线粒体CI的核心亚基（如NDUFV2、NDUFA4、NDUFA6等）表达异常，破坏ETC完整性，引发电子泄漏并增加ROS含量。过量ROS攻击线粒体膜脂质，造成脂质过氧化程度加剧并诱发Ca2+超载，进而激活mPTP开放，导致线粒体膜通透性增加，促使Cytc释放至胞质的同时由ROS氧化修饰Cytc使其还原型比例降低，而氧化型Cytc通过激活Caspase凋亡途径进一步加剧线粒体损伤和ROS生成，形成“氧化应激-线粒体损伤”的正反馈循环。累积的ROS持续攻击肌原纤维蛋白，导致羊肉色泽劣变、氧化稳定性下降及营养成分改变。
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