中国的人均牛肉消费量逐年上升，目前牛肉消费总量已位居世界第2[1]。青海省作为全国五大牧区之一，也是我国最大的优质牦牛肉生产基地[2]。牦牛是生长于高寒地区的大型反刍家畜[3]，以天然牧草作为食物，生活环境无污染，因此牦牛肉被视为天然绿色食品，符合当代消费者对健康与绿色食品的追求[4]。
蒸煮是一种利用蒸汽加热使食材熟化的烹饪方式，能够最大程度保留食材的营养成分和风味，蒸煮主要包括煮制和蒸制2 种处理方式，其中煮制可分为常压煮制和高压煮制[5-7]，广泛应用于面点[8-9]、水果[10]及肉类[11]等食材加工。常压煮制尤其适用于旨在保持原汁原味的牦牛肉烹调。风味特征是影响消费者长期购买行为的重要食品品质属性[12]。肉品风味的形成主要源于加热过程中前体物质发生的美拉德反应和脂质氧化等一系列化学反应所产生的多种挥发性风味物质[13]。目前，针对牦牛肉的研究多集中于加工品质特性[14-17]和营养特性[18-21]方面，而对其风味的系统性研究仍较为有限。
挥发性代谢组学作为现代肉品科学研究中的重要工具[22]，为风味解析提供了有力支持。其中，气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）已成为解析牛肉风味的重要手段[23-25]。例如，侯婷婷等[26]采用顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）-GC-MS分析延边黄牛肉风味；宋泽等[27]采用GC-MS分析不同部位牛肉炖煮风味；朱青云等[28]采用HS-SPME-GC-MS分析青海省不同产地牦牛肉挥发性风味成分。这些研究为牛肉风味分析奠定了方法学基础。在风味形成机理层面，牦牛肉风味相关基因研究致力于识别影响牦牛肉特有风味的基因并阐明其作用机制。近年来，牛肉风味相关基因研究多集中于脂肪代谢和沉积相关基因，如湘西黄牛的H-FABP基因[29]、安格斯牛的PPARD基因[30]、肉牛×奶牛杂合子的F94L基因[31]、信阳水牛的PPARG外显子circRNA[32]、秦川牛与日本和牛杂交2代品种的ADIRF基因[33]等。目前，已有研究从天祝白牦牛中筛选出与肌内脂肪沉积相关的10 个候选基因（ADIPOQ、FABP4、PLIN1、LPL、ACSL4、STAT5A、ACACB、LPIN1、PPARδ和ADIPOR1）[34-35]。然而，目前国际上关于牦牛肉风味相关基因的研究仍较为匮乏，鲜见直接提及牦牛肉风味基因的相关报道。国内相关研究也相对有限，牦牛肉风味相关基因的鉴定和功能解析尚处于初步阶段，导致牦牛肉风味形成机制及其遗传基础尚不明确。
基于上述研究背景与方法基础，本研究采用HSSPME-GC-MS技术，基于非靶向代谢组学方法系统分析煮制加工对牦牛肉风味特征的影响，将其挥发性风味物质组成与其他市售牛肉[36-39]进行对比，旨在识别牦牛肉与其他牛肉在风味物质构成上的差异，进一步挖掘与关键风味代谢物相关的功能基因，从而揭示牦牛肉煮制加工过程中风味形成的动态基因调控网络，为牦牛肉的高值化开发利用提供科学依据，并为从基因层面改善牦牛肉品质提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牦牛肉样品采集于青海省果洛州久治县，3 岁龄，宰后1 h内取肩胛部位瘦肉、筋膜、脂肪各200 g，各等分为2 份，一份为鲜样（XY），瘦肉、筋膜、脂肪分别记为XY-1、XY-2、XY-3，另一份经沸水煮制45 min制为熟制样（SZ），瘦肉、筋膜、脂肪分别记为SZ-1、SZ-2、SZ-3。
正己烷、3-己酮（均为色谱纯） 德国Merck公司；所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
SPME Arrow SPME装置 瑞士思特斯分析仪器有限公司；120 μm DVB/CWR/PDMS萃取头、8890-7000D GC-MS仪、DB-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司；MS105DU电子天平瑞士Mettler-Toledo公司。
1.3 方法
1.3.1 样品提取
将样品用绞肉机绞碎，准确称取0.2 g置于20 mL顶空瓶中，每个样品设置3 个平行。向顶空瓶中分别加入0.2 g NaCl粉末、20 μL内标溶液（10 μg/mL 3-己酮），经HS-SPME萃取，供GC-MS分析。
1.3.2 HS-SPME萃取条件
在60 ℃恒温条件下振荡平衡5 min后，将经250 ℃预老化处理的120 μm DVB/CWR/PDMS萃取头插入样品顶空瓶的顶空部位，60 ℃吸附萃取15 min，随后将萃取头收回并迅速转移至GC-MS仪进样口，250 ℃解吸5 min，进行GC-MS分离鉴定。
1.3.3 GC-MS条件
GC条件：DB-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯氦气（纯度≥99.999%），恒流模式，流速1.2 mL/min；进样口温度250 ℃；溶剂延迟3.5 min；程序升温：40 ℃保持3.5 min，以10 ℃/min升至100 ℃，再以7 ℃/min升至180 ℃，最后以25 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。
MS条件：电子电离源，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，MS接口温度280 ℃；电子能量70 eV，扫描方式为选择离子检测模式，定性、定量离子精准扫描参考GB 23200.8—2016《食品安全国家标准 水果和蔬菜中500 种农药及相关化学品残留量的测定 气相色谱-质谱法》。
1.3.4 相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）计算
ROAV是一种结合气味阈值判定化合物风味贡献强度的方法。参考Huang Wenjing等[40]的方法，以化合物相对含量与其气味阈值的比值计算ROAV，其中ROAV≥1，表明该化合物对样品风味有直接贡献；ROAV≥100，表明此物质为特征香气化合物；ROAV≥1 000，表明该物质为最重要的关键香气成分。
1.3.5 牦牛肉风味基因分析
从美国国家生物技术中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）下载牦牛基因组序列。基于Web of Science和中国知网等数据库系统检索并整理与牛肉风味形成相关的候选基因，然后，在NCBI平台中对牦牛肉风味相关基因进行筛选。具体步骤：在NCBI首页“Resources”导航栏中选择“Nucleotide”数据库；在检索框中输入已整理出的牛肉风味相关基因名称（表1）；在“Organism”字段中限定物种为“Bos grunniens”。以H-FABP基因为例，输入“H-FABP”[All Fields] AND “Bos grunniens”[Organism]，然后点击“Search”按钮进行搜索。
表1 牛肉风味相关基因
Table 1 Genes related to beef flavor
牛肉来源风味相关基因功能牛肌肉干细胞C/EBPα脂肪组织发育，牛肉品质改良的遗传标记肉牛×奶牛杂合子F94L降低里脊牛排中与脂肪相关的风味属性秦川牛与日本和牛杂交2代品种ADIRF脂肪代谢和沉积安格斯牛PPARD对肉质具有一定的调控作用湘西黄牛H-FABP影响肌肉脂肪含量秦川牛PLIN脂肪沉积3 个黄牛品种与4 个杂交肉牛MyoD基因第2内含子对大理石花纹、肌内脂肪含量、背膘厚度具有一定影响秦川牛SIRT1和SIRT2基因合并基因型对背膘厚度、眼肌面积及肌间脂肪影响显著天祝白牦牛ADIPOQ、FABP4、PLIN1、LPL、ACSL4、STAT5A、ACACB、LPIN1、PPARδ、ADIPOR1与肌内脂肪沉积相关天祝白牦牛FABP3与细胞内脂肪酸转运和代谢有关，可作为影响家养动物肌内脂肪及嫩度的候选基因肉牛MSTN双肌性状、低脂肪、高瘦肉率牦牛LPL、ACADL、SCD和FASN，mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA与肌内脂肪含量相关信阳水牛PPARG外显子circRNA通过调节过氧化物酶体增殖物激活受体γ和激素敏感脂肪酶增强肌内脂肪沉积牛DGAT1在脂肪代谢和甘油三酯合成中起着关键作用
1.4 数据处理
采用Analyst 1.6.3软件和Mass Hunter软件处理MS数据，使用Gephi 0.9.2软件进行可视化分析，采用Microsoft Office Excel 2021软件绘制牦牛肉煮制前后的风味轮与雷达图。
利用在线工具DNA RNA Codons Translator-Amino Acid Genetic Code Online Converter将从NCBI获取的RNA序列转换为DNA序列。使用Notepad++软件编辑fasta格式文件，并借助正则表达式删除文档中全部重复行，打开“查找和替换”窗口，选择“替换”选项卡，在“查找内容”框中输入“(.+)\1+”，“替换为”框留空，勾选“正则表达式”选项后点击“全部替换”。基于MEGA 11软件完成多序列比对并构建基因进化树。使用TBtools-II v2.210软件中的基因组定位功能进行染色体定位并生成基因分布图谱。
2 结果与分析
2.1 牦牛肉代谢组学分析
2.1.1 挥发性代谢物分析
由图1a可知，HS-SPME-GC-MS从2 组牦牛肉中共检出187 种挥发性代谢物，包括酸类、醇类、醛类、胺类、酯类、酮类及芳烃化合物、含硫化合物、含氮化合物、萜类化合物、杂环化合物、烃类等。其中烃类种类最多（34 种），酮类、酯类、醇类、杂环化合物次之，分别为25、23、22、21 种；含氮化合物、苯酚、含硫化合物、其他种类较少，分别为3、3、2、1 种。由图1b可知，牦牛肉瘦肉、筋膜及脂肪鲜样中多数代谢物相对含量均高于对应熟制后样品。
图1 挥发性代谢物种类（a）与相对含量热图（b）
Fig.1 Types (a) and relative content heatmap (b) of volatile metabolites in yak meat
在检出的187 种挥发性代谢物中，相对含量≥1%的挥发性代谢物分布存在差异（表2）：鲜牦牛肉中共鉴定出10 种，包括3 种醇类（(Z)-2-辛基-1-醇、2-辛烯-1-醇、(E)-辛烯醇）、3 种杂环化合物（5-甲基-2(5H)-呋喃酮、异丁基甲氧基吡嗪、二氢-2-甲基-3(2H)-呋喃酮）、2 种酚类（2,4-二叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基苯酚）、1 种酮类（E-2-甲基-5-(呋喃-3-基)-戊-1-烯-3-酮）、1 种酸类（2-甲基庚酸），这10 种化合物共同构成牦牛肉特征性挥发性代谢物的主体框架。熟制牦牛肉中检出8 种相对含量≥1%的挥发性代谢物。值得注意的是，熟制牦牛肉脂肪组织中仅保留3 种相对含量≥1%的挥发性代谢物，表明热处理过程能够有效改变挥发性成分的组成与分布模式。
表2 不同牦牛肉组织煮制前后主要挥发性代谢物
Table 2 Main volatile metabolites of different yak meat tissues before and after boiling
挥发性代谢物相对含量/%XY-1XY-2XY-3SZ-1SZ-2SZ-3(Z)-2-辛基-1-醇8.157 75.609 06.939 51.936 02.810 70.733 3 2-辛烯-1-醇7.628 74.784 27.901 52.513 51.974 51.013 4(E)-辛烯醇6.328 94.672 85.782 42.072 62.755 20.654 8 5-甲基-2(5H)-呋喃酮4.917 47.978 65.037 72.475 33.909 82.339 2异丁基甲氧基吡嗪4.666 34.701 73.543 40.529 91.206 80.103 6 2,4-二叔丁基苯酚2.927 31.733 92.383 11.357 01.317 40.796 4 3,5-二叔丁基苯酚2.927 31.733 92.383 11.357 01.317 40.796 4二氢-2-甲基-3(2H)-呋喃酮2.775 32.731 73.052 42.451 32.663 01.001 3 2-甲基庚酸1.755 11.543 61.712 40.416 30.559 70.334 0(E)-2-甲基-5-(呋喃-3-基)-戊-1-烯-3-酮 1.274 50.730 11.235 40.240 70.277 90.163 7
2.1.2 风味特征分析
风味特征的差异主要体现在感官属性的动态变化上。在鲜牦牛肉中，根据感官注释频次筛选出的前10 位特征风味依次为甜香、花香、草香、果香、蔬菜味、草药味、蜂蜜味、油脂味、蜡味、玫瑰味。其中，甜香、花香、草香、果香作为主导特征香气，各由3 种关键挥发性化合物贡献（图2a）。煮制加工后，油脂香、甜香、柑橘味、花香和果香减弱或消失，同时塑料味和草药味增强（图2b）。
图2 牦牛肉煮制前后风味特征
Fig.2 Flavor characteristics of yak meat before and after cooking
a.鲜牦牛肉风味轮，内圈为注释频次最高的10 种感官风味；b.风味雷达图。
2.1.3 牦牛肉特征风味成分分析
由表3可知，从鲜牦牛肉中共鉴定出34 种对风味具有直接贡献的挥发性风味化合物，其中醇类6 种、酮类4 种、醛类8 种、酯类6 种、酚类2 种、萜类1 种、杂环化合物4 种及烃类、含氮化合物、含硫化合物各1 种。值得注意的是，己酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醛并未被确定为鲜样筋膜组织中的关键风味化合物。
表3 鲜牦牛肉中风味活性化合物ROAV
Table 3 ROAVs of flavor-active compounds in raw yak meat
化合物XY-1XY-2XY-3醇类(E)-辛烯醇407.886 6280.449 2346.974 6(Z)-2-辛基-1-醇326.309 3224.359 3277.579 7 2-辛烯-1-醇163.154 6112.179 7138.789 8香叶醇4.933 24.190 94.516 2癸醇4.812 93.930 64.406 6 2-甲基-3-戊醇1.402 01.431 71.447 8酮类5-甲基-2-(1-甲基乙基)-环己酮22.097 816.779 529.840 0 2,2,6-三甲基-环己酮4 858.776 03 962.382 04 407.598 0 6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮4.775 14.391 54.690 8十一烷酮1.636 21.012 41.120 6醛类(E)-2-己醛308.792 1270.939 1306.649 0正壬醛116.225 7101.452 6106.881 5(Z)-癸-2-烯醛2.135 91.649 92.415 6 2-壬烯醛56.587 353.311 171.336 7 2-己醛56.309 249.406 555.918 4(E)-2-十一烯醛41.182 023.919 817.794 4(E)-2-反-2-癸烯醛10.153 810.006 89.774 2苯乙醛1.332 70.616 51.298 3酯类γ-十内酯86.531 049.597 462.878 9 γ-八内酯15.651 813.415 713.904 1己酸乙酯9.529 40.297 526.017 6庚酸乙酯9.218 34.079 315.104 0辛酸乙酯1.491 50.034 93.670 9丁酸丁酯1.211 51.626 51.669 1烃类正丁基苯1.255 11.182 71.288 5酚类2,4-二叔丁基苯酚5.854 53.467 84.766 1愈创木酚124.546 2112.840 2124.448 8含氮化合物十二烯腈184.873 0130.498 0129.281 2含硫化合物二烯丙基硫9.142 814.229 09.290 8杂环化合物5-甲基-2(5H)-呋喃酮24.587 139.893 225.188 6异丁基甲氧基吡嗪2 333 135.000 0 235 086.000 0 1 771 712.000 0四氢-6-甲基-2H-吡喃-2-酮2.571 02.465 52.543 2二氢-2-甲基-3(2H)-呋喃酮555 058.700 0 546 349.600 0 610 472.100 0萜类芳樟醇119.792 1116.129 6109.620 3
由表4可知，从熟制牦牛肉中仅鉴定出28 种对风味具有直接贡献的挥发性风味化合物，其中2,3-二甲基癸烷和萘为筋膜组织所特有。与鲜牦牛肉相比，熟制牦牛肉关键风味化合物有所减少，但四氢-6-甲基-2H-吡喃-2-酮（奶油、果香、巧克力）、丁酸丁酯（果香）、(Z)-癸-2-烯醛这3 种化合物是3 种牦牛肉组织鲜样和熟制样品所共有。
表4 熟制牦牛肉中风味活性化合物ROAV
Table 4 ROAVs of flavor-active compounds in cooked yak meat
化合物SZ-1SZ-2SZ-3酮类1-(3-羟苯基)-乙酮490 252.100 0532 606.200 0200 264.500 0 6,7-十二烷二酮96.799 8140.534 536.663 5 2-辛酮25.962 136.698 621.893 5 2-壬基酮1.334 81.799 10.957 0 7-甲基-5-辛烯-4-酮1.948 17.252 63.928 8烃类间二甲苯264 954.700 0603 402.700 051 798.570 0 3-乙烯基-环辛烯238.310 6264.070 695.105 8 2,8-二甲基十一烷1.585 17.189 41.325 4(Z)-4-甲基-4-十一碳烯1.321 25.725 41.049 0 2,3-二甲基癸烷0.424 13.962 70.466 9萘0.416 02.102 80.345 9杂环化合物1,2,5-三甲基吡咯77.439 9112.427 629.330 8 2-(4-溴丁基)-呋喃5.483 340.214 53.355 4异丁基甲氧基吡嗪1.217 11.686 80.990 7 5-乙基-5-(丙-2-基)咪唑烷-2,4-二酮16.974 831.688 113.403 7四氢-6-甲基-2H-吡喃-2-酮631.763 5893.471 7511.924 1酯类丁酸丁酯72.374 1112.527 170.159 1(Z)-3-己基丙酸酯43.456 648.154 017.342 8亚硫酸丁基戊酯2.173 52.976 51.746 1环己烷羧酸-3-氟苯基酯0.861 61.233 70.886 0胺类5H-四唑-5-胺38.719 956.213 814.665 4邻甲苯胺5.481 45.645 34.348 1萜类α-姜黄素27.742 144.367 421.203 6酸类4-甲基辛酸24.953 744.971 221.163 3醇类Z-2-十二烯醇12.376 619.548 911.695 8醛类(Z)-癸-2-烯醛10.420 511.937 08.263 6苯乙醛4.550 37.197 24.361 3含硫化合物2-甲基硫烷-S,S-二氧化物2.713 92.634 91.592 7
鲜牦牛肉中ROAV≥100的化合物有11 种，其中醇类3 种、酚类1 种、含氮化合物1 种、醛类2 种、萜类1 种、酮类1 种、杂环化合物2 种，分别为(E)-辛烯醇（青香）、(Z)-2-辛基-1-醇（甜香）、2-辛烯-1-醇（青香）、愈创木酚（坚果味）、十二烯腈（柑橘味）、(E)-2-己醛（青香）、正壬醛（柑橘味）、芳樟醇（花香）、2,2,6-三甲基-环己酮（腊肠味）、异丁基甲氧基吡嗪（青椒味）、二氢-2-甲基-3(2H)-呋喃酮（甜香），确定为特征香气化合物。熟制牦牛肉中ROAV≥100的化合物有4 种，分别为1-(3-羟苯基)-乙酮、间二甲苯（塑料）、四氢-6-甲基-2H-吡喃-2-酮（奶油）、3-乙烯基-环辛烯。将ROAV≥1 000的化合物确定为最重要的关键香气成分，鲜牦牛肉中共有3 种，分别为异丁基甲氧基吡嗪、二氢-2-甲基-3(2H)-呋喃酮、2,2,6-三甲基-环己酮；熟制牦牛肉中共有2 种，分别为1-(3-羟苯基)-乙酮、间二甲苯。对比可知，鲜样比熟制样含有更丰富的关键风味物质。
2.2 牦牛肉风味基因分析
2.2.1 牦牛肉风味相关基因鉴定
以文献检索的35 条候选序列作为查询序列，基于NCBI核苷酸数据库的BLAST序列比对分析，共鉴定出14 个牦牛肉风味相关基因，分别为H-FABP、MyoD、ADIPOQ、FABP4、PLIN1、STAT5A、LPIN1、FABP3、MSTN、LPL、SCD、FASN、DGAT1、HSPB1，详细信息如表5所示。从序列类型来看，其中8 个为DNA序列、6 个为mRNA序列。值得注意的是，MyoD基因的序列长度明显大于其他鉴定基因，这一结构特征可能与其在肌肉发育和风味前体物质代谢中的调控功能密切相关。
表5 牦牛肉风味基因相关信息
Table 5 Information of yak meat flavor-related genes
基因登录号类型长度/bp H-FABPHM776515mRNA632 MyoDJH881191DNA2 855 658 ADIPOQKF494226mRNA839 FABP4KP759352DNA404 PLIN1PP904443mRNA1 783 STAT5AON100514DNA1 143 LPIN1MH588442DNA890 FABP3HQ231766mRNA119 MSTNJN642606DNA385 LPLHQ231771mRNA104 SCDON100500DNA394 FASNGU228778DNA293 DGAT1MN012935DNA426 HSPB1MW413333mRNA785
2.2.2 牦牛肉风味相关基因进化树构建
基于邻接法构建基因进化树，可有效反映牦牛肉相关风味基因之间的进化关系，解析牦牛肉特征性风味形成的分子进化机制。如图3所示，基因进化树揭示了14 个牦牛肉风味相关基因序列在进化中的亲疏远近关系。从进化树分支结构来看，这些基因可划分为若干具有显著聚类特征的分支群。其中，PP904443.1（PLIN1）和MW413333.1（HSPB1）较为接近，两者与KF494226.1（ADIPOQ）距离相对较近；HM776515.1（H-FABP）、HQ231766.1（FABP3）和HQ231771.1（LPL）存在一定的聚类关系，它们与JH881191.1（MyoD）、KP759352.1（FABP4）共同构成一个较大的分支群；JN642606.1（MSTN）和ON100500.1（SCD）构成一个分支群；ON100514.1（STAT5A）、GU228778.1（FASN）、MH588442.1（LPIN1）和MN012935.1（DGAT1）形成另一个分支群。
图3 牦牛肉风味基因的基因进化树
Fig.3 Phylogenetic tree of yak meat flavor-related genes
分支（节点）处为Bootstrap值（自展值），值越高，表明该分支在多次抽样中越稳定，可靠性越强；分支上的数值表示进化距离，数值越大，基因间的差异越大，进化关系越远。
进化距离分析表明，PP904443.1（PLIN1）与MW413333.1（HSPB1）的遗传距离较小，表明两者基因序列相似度较高；而PP904443.1（PLIN1）与KP759352.1（FABP4）的遗传距离较大，这可能源于它们在牦牛驯化过程中经历了不同的选择压力，导致其核苷酸序列变异程度存在显著分化。
2.2.3 牦牛肉风味相关基因染色体定位图谱分析
如图4所示，风味相关基因在染色体上呈现分散分布模式，基因排列分散，未观察到明显的基因簇现象。
图4 牦牛肉风味基因的染色体物理定位分布
Fig.4 Physical mapping of chromosomal localization of yak meat flavor-related genes
CM050811.1等为染色体编号，纵轴表示基因在染色体上的物理位置，反映基因在染色体上的排列顺序和距离。
在CM050811.1染色体片段上，基因JN642606.1（MSTN）定位于0.0～13.3 Mb；在CM050820.1染色体片段上，基因MH588442.1（LPIN1）定位于0.0～13.3 Mb；在CM050823.1染色体片段上，基因KP759352.1（FABP4）定位于39.8～53.1 Mb，基因MN012935.1（DGAT1）位于76.9～92.9 Mb；在CM050828.1染色体片段上，基因ON100514.1（STAT5A）定位于39.8～53.1 Mb，基因GU228778.1（FASN）定位于53.1～66.3 Mb；在CM050835.1染色体片段上，基因ON100500.1（SCD）定位于26.5～39.8 Mb，这种分散但功能关联的分布模式可能反映牦牛肉风味性状的多基因调控特征。
3 讨 论
3.1 煮制前后牦牛肉风味变化
鲜牦牛肉中烃类化合物的ROAV普遍较低，未鉴定出特征香气化合物，表明其对整体风味的贡献作用有限；然而在熟制牦牛肉中，尤其是熟制筋膜组织中，烃类化合物的风味贡献突出。酮类化合物作为重要的风味物质，主要由氨基酸降解、美拉德反应及脂质热氧化等途径产生[41]，其中2,2,6-三甲基-环己酮表现出较高的ROAV，对风味具有较大贡献。醛类化合物和醇类化合物一般由脂肪氧化产生，鲜牦牛肉中醛类化合物和醇类化合物含量丰富且其ROAV较高，是构成牦牛肉特征性风味的主要成分。酯类化合物主要通过含羟基脂肪酸的水解及其后续的加热脱水、环化等一系列反应生成，其中γ-八内酯、γ-十内酯作为典型的香气特征化合物，以及丁酸丁酯、庚酸乙酯均对鲜牦牛肉风味具有直接贡献。值得注意的是，含硫、含氮、杂环化合物感官阈值一般较低，是影响肉类风味的关键物质[42]。本研究中，杂环化合物异丁基甲氧基吡嗪与二氢-2-甲基-3(2H)-呋喃酮、含氮化合物十二烯腈与萜类化合物芳樟醇均表现出较高的ROAV，为鲜牦牛肉提供了独特的风味特征，而熟制牦牛肉的特征性风味则主要来源于1-(3-羟苯基)-乙酮、四氢-6-甲基-2H-吡喃-2-酮及间二甲苯。
不同品种和产地的牛肉因其挥发性风味物质组成差异而呈现独特的风味特征。侯婷婷等[26]研究表明，延边黄牛肉中主要挥发性风味物质为醇类、醛类化合物，其中酮类化合物可能对其个体香气特征具有较大贡献，烃类化合物对整体风味影响较小，而酯类化合物中除含硫酯外，对风味的贡献亦不显著。与延边黄牛肉相比，牦牛肉中酯类化合物（γ-八内酯、γ-十内酯、丁酸丁酯、庚酸乙酯）、酮类化合物（2,2,6-三甲基-环己酮）对风味的贡献更为显著，杂环化合物（二氢-2-甲基-3(2H)-呋喃酮与异丁基甲氧基吡嗪）、含氮化合物（十二烯腈）、萜类（芳樟醇）ROAV较高，可能为牦牛肉提供独特风味；周景瑞等[37]在贵州关岭黄牛肉中鉴定出9 类挥发性化合物，其中萜烯类、烷烃类、醇类及酯类化合物在不同部位中含量均较高，对关岭黄牛肉风味形成具有重要贡献。与关岭黄牛肉相比，鲜牦牛肉中还检出胺类、芳烃、含硫、含氮、萜类及杂环化合物，但未检出烯类化合物，表明牦牛肉挥发性风味物质种类更丰富。除共有的萜烯类、醇类、酯类化合物外，醛类、部分酮类（2,2,6-三甲基-环己酮）、杂环化合物（二氢-2-甲基-3(2H)-呋喃酮、异丁基甲氧基吡嗪）、含氮化合物（十二烯腈）对鲜牦牛肉风味贡献尤为突出，而烃类物质对风味贡献较小。Chen Dong等[38]在湘西黄牛背最长肌中共检出44 种挥发性风味化合物，以醇类（辛醇、1-辛烯-3-醇和2-辛基-1-癸醇）、醛类（十三烯醛、十四醛、五醛、十六醛、七醛和八醛）、酮类（2-十一酮）和烃类化合物（十二烷）为主。与湘西黄牛肉相比，牦牛肉中还检出胺类、芳烃、含硫、含氮、萜类及芳香族化合物，挥发性风味化合物类型更丰富。张岩峰[33]在秦川×和牛杂交牛中检出55 种挥发性化合物，其整体风味主要受醛类和醇类物质共同影响。与杂交牛相比，鲜牦牛肉中除未检出烯类化合物外，还检出胺类、酯类、芳烃、含硫、含氮、萜类、杂环及芳香族化合物，且烃类化合物种类最为丰富。Wan Junwen等[39]在西藏犏牛中共鉴定出67 种挥发性化合物，其中包括3 种噻唑，牦牛肉中虽未检出噻唑类物质，但其整体挥发性化合物种类更为丰富。
煮制加工过程可显著改变牦牛肉的风味特征，表现为青香、甜香、柑橘味、花香、坚果味、清新香气逐渐减弱或消失，塑料味、奶油味熟制特征香气增强。异丁基甲氧基吡嗪、二氢-2-甲基-3(2H)-呋喃酮和2,2,6-三甲基-环己酮被确定为鲜牦牛肉的关键香气成分，而1-(3-羟苯基)-乙酮和间二甲苯则是反映煮制前后牦牛肉香气变化的关键成分。
3.2 牦牛肉风味相关基因
本研究共鉴定出14 个牦牛肉风味相关基因。其中，H-FABP基因[29]在肌肉脂肪代谢过程中起关键作用，能够影响肌肉脂肪含量，对牛肉质嫩度存在显著影响。该基因通过参与脂肪酸代谢、甘油酯代谢及过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路等多个代谢途径，调控肌肉脂肪沉积和风味物质形成。MyoD基因[43]的第2内含子区域与肉牛多个重要生产性能性状存在显著相关，如宰前活体质量、胴体质量等。该基因可能通过调控FASN等基因的表达影响肌肉中脂肪酸的组成与含量，而脂肪酸作为风味物质形成的重要前体，其种类和含量变化将直接影响风味物质的种类和含量。ADIPOQ、FABP4、PLIN1、LPL、STAT5A、LPIN1参与多个肌肉发育和脂质代谢相关生物过程和信号通路，FABP3、HSPB1则涉及磷脂分解、脂质储存、脂肪酸代谢等相关生物过程和信号通路[34]。MSTN基因[44]是骨骼肌发育的主要调节因子，也是转化生长因子β超家族成员之一，其突变型“双肌牛”具有肌肉发达、肌纤维细、嫩度高、脂肪含量低及蛋白含量高等特征。SCD、FASN基因[35]参与脂酰基辅酶A的生物合成过程，并在脂肪酸生物合成中发挥催化作用。DGAT1基因[45]在改善肉牛肉质与胴体脂肪品质方面具有积极作用，其通过催化二酰甘油与脂肪酸反应生成三酰甘油，直接影响脂肪酸组成，进而调控肌肉组织中风味前体物质的种类和含量。上述基因均与脂质代谢密切相关，而脂质代谢与肉品风味形成机制密切相关。脂肪代谢可产生醛类、醇类、酮类、酸类及酯类等挥发性风味物质，赋予肉品特有香气；不饱和脂肪酸是风味化合物形成的重要前体物质，其氧化分解可生成多种气味活性物质；适量肌内脂肪能改善肉品风味、多汁性和嫩度。因此，这14 个基因对牦牛肉风味的形成具有重要贡献。
进化树分支结构反映牦牛肉相关风味基因在进化过程中的演化路径。亲缘关系较近的基因可能源自共同的祖先序列，在进化过程中变异较小，保留了一定的共同功能特征，这些功能可能与牦牛肉风味形成机制有关。例如，PP904443.1（PLIN1）、MW413333.1（HSPB1）和KF494226.1（ADIPOQ）形成一个小分支群，表明它们可能在牦牛肉风味形成过程中具有相似的作用机制或编码相似的蛋白质，这些蛋白质可能参与牦牛肉某些特定风味物质的合成或代谢过程。不同分支群间的进化距离则反映其经历不同的选择压力，导致基因序列发生较大变异，提示这些基因可能在牦牛肉风味形成中具有不同的功能或作用机制。例如，JH881191.1（MyoD）和MN012935.1（DGAT1）可能编码具有特殊功能的酶或蛋白质，分别参与牦牛肉中特有挥发性或非挥发性风味物质的生物合成，从而增强风味的多样性和复杂性。
通过NCBI获得的牦牛基因组大小约为2.6 Gb，包含30 条染色体。染色体定位结果显示，7 个风味基因分布于5 条染色体片段上，且呈分散分布状态，各染色体片段携带基因数量不一。CM050823.1和CM050828.1上各定位2 个基因，而CM050811.1、CM050820.1和CM050835.1上则各定位1 个基因。这种分布特征一方面可能与所选基因数量有限有关，另一方面也可能与染色体的功能区域、进化历史及基因的协同作用等因素相关。某些基因组区域可能更易于风味基因聚集，以协同调控牦牛肉风味形成。该定位图以Mb为单位精确标注基因范围信息，可为后续研究提供精准的基因组坐标，有助于解析基因间位置关系、互作网络及其在风味形成中的系统调控机制。
随着代谢组学技术在肉类风味研究中的广泛应用，风味物质鉴定数量显著增加，本研究检出187 种挥发性物质，有效克服了传统检测技术检出风味物质较少（如蒸馏萃取结合GC-MS仅鉴定出98 种挥发性成分[27]）的局限。随着风味组学研究的逐渐深入，其结果将为定向优化蒸煮工艺、精准保留关键风味物质提供理论依据与调控策略。同时，本研究系统解析了已报道牦牛肉风味相关基因在染色体上的分布，并讨论了其对风味演变的重要调控作用，为定向调控肉品风味品质的基因编辑或营养干预策略奠定基础。
4 结 论
本研究从牦牛肉中共检出187 种挥发性代谢物。与其他牛种相比，牦牛肉挥发性风味物质种类更丰富。鲜牦牛肉关键风味物质较熟制牦牛肉更多。异丁基甲氧基吡嗪、二氢-2-甲基-3(2H)-呋喃酮、2,2,6-三甲基-环己酮为鲜牦牛肉中最重要的关键香气成分，而1-(3-羟苯基)-乙酮、间二甲苯为熟制牦牛肉中最重要的关键香气成分。牦牛肉不同组织煮制后的整体香气成分含量与组成变化较大，熟制后，牦牛肉油脂味、甜香、柑橘味、花香和果香减弱或消失，塑料味与草药味增强。通过NCBI共鉴定出14 个牦牛肉风味相关基因，根据进化树结构，被分为3 个主要分支，同时牦牛肉相关风味基因在染色体片段上呈分散分布且数量不一。
[1] 曹兵海, 李俊雅, 王之盛, 等.2019年度肉牛牦牛产业技术发展报告[J].中国畜牧杂志, 2020, 56(3): 173-178.DOI:10.19556/j.0258-7033.20200211-03.
[2] 骆正杰, 马进寿, 保广才, 等.青海省牦牛种业发展现状、存在问题及应对策略[J].中国畜牧杂志, 2021, 57(2): 231-234.DOI:10.19556/j.0258-7033.20200429-02.
[3] 杨柏高, 郝海生, 杜卫华, 等.牦牛高原适应研究进展[J].畜牧兽医学报, 2023, 54(1): 12-23.DOI:10.11843/j.issn.0366-6964.2023.01.002.
[4] 刘晓畅, 张寿, 孙宝忠, 等.牦牛肉品质特性研究进展[J].肉类研究,2020, 34(11): 78-83.DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20200917-230.
[5] 赵俊杰, 王燕.烘烤葵瓜子工艺优化及品质分析[J].食品与发酵工业, 2023, 49(10): 237-244.DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031986.
[6] 刘薇, 赵赵, 朱文政, 等.超声波辅助煮制对畜禽肉制品品质影响研究进展[J].食品工业科技, 2023, 44(7): 419-427.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022050059.
[7] 魏星, 李小平, 王晓龙, 等.加压煮制对干面条煮制品质的影响[J].中国粮油学报, 2024, 39(5): 156-164.DOI:10.20048/j.cnki.issn.1003-0174.000734.
[8] SEKINE M, HARADA K.Changes in properties and microstructure of noodles during boiling process[J].Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi,1990, 37(6): 454-457.DOI:10.3136/nskkk1962.37.6_454.
[9] TIAN Y, LI M, TANG A X, et al.RS content and eGI value of cooked noodles (I): effect of cooking methods[J].Foods, 2020, 9(3): 328.DOI:10.3390/foods9030328.
[10] WU Y Y, LIU Y N, JIA Y Q, et al.Effects of thermal processing on natural antioxidants in fruits and vegetables[J].Food Research International, 2024, 192: 114797.DOI:10.1016/j.foodres.2024.114797.
[11] GUO C Y, WANG S Y, JIA X L, et al.Changes in novel biomarkers for protein oxidation in pork patties under different cooking methods[J].Foods, 2024, 13(7): 1034.DOI:10.3390/foods13071034.
[12] 李敬, 杨媛媛, 赵青余, 等.肉风味前体物质与风味品质的关系研究进展[J].中国畜牧杂志, 2019, 55(11): 1-7.DOI:10.19556/j.0258-7033.20190330-05.
[13] 余力, 贺稚非, 王兆明, 等.不同解冻方式对伊拉兔肉挥发性风味物质的影响[J].食品科学, 2015, 36(22): 95-101.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201522017.
[14] 刘嘉慧, 谢鹏, 刘晓畅, 等.不同部位牦牛肉涮制加工的适宜性[J].食品工业科技, 2024, 45(22): 244-253.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2024010059.
[15] 牟燕, 赖茂佳, 易宇文, 等.微生物发酵剂对川味牦牛肉香肠品质的影响[J].中国酿造, 2024, 43(2): 188-193.DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2024.02.028.
[16] 索朗多吉, 张群英, 张强, 等.西藏阿里地区改则县野血牦牛屠宰性能及其肉品质特性研究[J].中国畜牧兽医, 2024, 51(4): 1603-1612.DOI:10.16431/j.cnki.1671-7236.2024.04.028.
[17] 张生秀, 王琳琳, 王立娜, 等.一种杂粮牦牛肉酱产品配方优化及贮藏品质研究[J].中国调味品, 2024, 49(3): 74-80.DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.2024.03.012.
[18] 伏慧慧, 潘丽, 王庆玲.干腌牛肉加工过程中蛋白质结构变化[J].食品工业, 2023, 44(5): 11-14.
[19] 陈腊梅.丙二醛氧化对牦牛肉肌浆蛋白结构与功能特性的影响[D].成都: 西南民族大学, 2023: 17-20.DOI:10.27417/d.cnki.gxnmc.2023.000166.
[20] 侯成立, 李欣, 王振宇, 等.不同部位牦牛肉氨基酸、脂肪酸含量分析与营养价值评价[J].肉类研究, 2019, 33(2): 52-57.DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20190121-016.
[21] 席斌, 王莉蓉, 郭天芬, 等.大通牦牛肉与高原牦牛肉营养品质比较分析[J].黑龙江畜牧兽医, 2018(23): 198-201.DOI:10.13881/j.cnki.hljxmsy.2018.01.0572.
[22] 陈雪, 罗欣, 梁荣蓉, 等.代谢组学在肉及肉制品品质监测中的应用[J].农业工程学报, 2020, 36(17): 291-300.DOI:10.11975/j.issn.1002-6819.2020.17.034.
[23] 肖智超, 葛长荣, 周光宏, 等.肉的风味物质及其检测技术研究进展[J].食品工业科技, 2019, 40(4): 325-330.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2019.04.054.
[24] 刁小琴, 孙薇婷, 徐筱君, 等.肉制品风味物质分析及其在加工中变化的研究进展[J].食品安全质量检测学报, 2021, 12(8): 2991-2999.DOI:10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2021.08.005.
[25] 罗建玲, 罗玉芳, 程秀云.食品风味分析技术研究进展[J].食品安全导刊, 2021(3): 154; 156.DOI:10.16043/j.cnki.cfs.2021.03.087.
[26] 侯婷婷, 南京煕, 林墨, 等.延边黄牛肉挥发性风味物质[J].食品与机械, 2018, 34(8): 45-47.DOI:10.13652/j.issn.1003-5788.2018.08.010.
[27] 宋泽, 徐晓东, 许锐, 等.不同部位牛肉炖煮风味特征分析[J].食品科学, 2019, 40(4): 206-214.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180104-050.
[28] 朱青云, 李玉林, 谭亮, 等.顶空固相微萃取-气质联用技术分析青海省不同产地牦牛肉中挥发性风味成分[J].动物营养学报, 2020,32(6): 2831-2849.DOI:10.3969/j.issn.1006-267x.2020.06.044.
[29] 李志才, 易康乐.湘西黄牛的H-FABP基因对大理石花纹和肌内脂肪含量相关性分析[J].中国牛业科学, 2010, 36(1): 1-4.DOI:10.3969/j.issn.1001-9111.2010.01.001.
[30] 马正旭.安格斯牛肉质性状相关差异表达基因的筛选及PPARD基因功能分析[D].银川: 宁夏大学, 2020: 20-27.DOI:10.27257/d.cnki.gnxhc.2020.000887.
[31] WALLER B E, WHITEWOOD T A, WOERNER D R, et al.Effects of the F94L myostatin gene mutation in beef × dairy crossed cattle on strip loin steak dimensionality, shear force, and sensory attributes[J].Journal of Animal Science, 2023, 101: skad325.DOI:10.1093/jas/skad325.
[32] ZHU R R, FENG Y, YANG X T, et al.Functionally conserved PPARG exonic circRNAs enhance intramuscular fat deposition by regulating PPARG and HSL[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2024, 257: 128613.DOI:10.1016/j.ijbiomac.2023.128613.
[33] 张岩峰.牛肉等级相关风味物质特征及其差异表达基因分析[D].银川: 宁夏大学, 2023.DOI:10.27257/d.cnki.gnxhc.2023.000970.
[34] 石斌刚.天祝白牦牛肌肉生长和肌内脂肪沉积相关基因筛选与鉴定[D].兰州: 甘肃农业大学, 2020: 66-72.DOI:10.27025/d.cnki.ggsnu.2020.000075.
[35] WANG H, ZHONG J C, ZHANG C F, et al.The whole-transcriptome landscape of muscle and adipose tissues reveals the ceRNA regulation network related to intramuscular fat deposition in yak[J].BMC Genomics, 2020, 21(1): 347.DOI:10.1186/s12864-020-6757-z..
[36] 孙斌, 崔岩, 盛万里, 等.顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用分析延边牛不同肌肉组织的挥发性风味物质[J].肉类研究, 2022, 36(4):35-40.DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20210823-207.
[37] 周景瑞, 罗文菊, 许浩翔, 等.贵州省关岭牛不同部位牛肉挥发性风味物质和脂肪酸差异比较[J].湖北农业科学, 2024, 63(4): 148-154.DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.04.027.
[38] CHEN D, WANG X Y, GUO Q, et al.Muscle fatty acids, meat flavor compounds and sensory characteristics of Xiangxi yellow cattle in comparison to Aberdeen Angus[J].Animals, 2022, 12(9): 1161.DOI:10.3390/ani12091161.
[39] WAN J W, LIU Q, MA C Z, et al.Characteristic flavor fingerprint disclosure of dzo beef in Tibet by applying SAFE-GC-O-MS and HS-GC-IMS technology[J].Food Research International, 2023, 166:112581.DOI:10.1016/j.foodres.2023.112581.
[40] HUANG W J, FANG S M, WANG J, et al.Sensomics analysis of the effect of the withering method on the aroma components of Keemun black tea[J].Food Chemistry, 2022, 395: 133549.DOI:10.1016/j.foodchem.2022.133549.
[41] XUE J J, LIU P P, YIN J F, et al.Dynamic changes in volatile compounds of shaken black tea during itsmanufacture by GC × GCTOFMS and multivariate data analysis[J].Foods, 2022, 11(9): 1228.DOI:10.3390/foods11091228.
[42] 张浩, 易宇文, 张振宇, 等.基于固相微萃取-气相色谱-质谱法结合相对气味活度值分析影响牦牛肉风味的关键化合物[J].食品安全质量检测学报, 2023, 14(15): 195-205.DOI:10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2023.15.044.
[43] 田璐, 许尚忠, 岳文斌, 等.MyoD基因对肉牛胴体性状影响的分析[J].遗传, 2007, 29(3): 313-318.DOI:10.16288/j.yczz.2007.03.012.
[44] 蔡树东, 李文, 周斐然, 等.肉牛肌肉生长抑制素基因研究进展[J].中国草食动物科学, 2023, 43(4): 59-63.DOI:10.3969/j.issn.2095-3887.2023.04.012.
[45] KHAN M Z, MA Y L, MA J Y, et al.Association of DGAT1 with cattle, buffalo, goat, and sheep milk and meat production traits[J].Frontiers in Veterinary Science, 2021, 8: 712470.DOI:10.3389/fvets.2021.712470.