黑鱼学名乌鳢（Channa argus），又名乌鱼、财鱼[1]，是我国常见的淡水经济鱼类。黑鱼味道鲜美，营养成分丰富，富含蛋白质、多种氨基酸和多不饱和脂肪酸，享有“鱼中珍品”之称[2]。据统计[3]，2022年黑鱼养殖总产量达55.3万 t，2018—2022年的年均增长率达5.2%，其中，冷冻调理鱼片占黑鱼加工产品的50%以上[4]。目前市场上销售的冷冻调理黑鱼片经长时间冻藏后，常出现水分流失、色泽变差、蛋白质变性、脂肪氧化及质构特性改变等问题[5-7]。这些品质的劣化与鱼肉的持水性密切相关。因此，在改善冷冻对鱼肉制品的不良影响方面，提高鱼肉产品的持水性尤为关键。多聚磷酸盐是目前应用最为广泛的保水剂，但其通常会增加产品的金属涩味，且易在人体内形成磷酸钙，阻碍人体对钙的吸收[8-10]，故采用无磷保水剂取代传统的磷酸盐保水剂已成为相关研究的重点。
研究表明，不同类型的无磷保水剂复配不仅能产生增效作用，且能降低用量、节省成本。海藻糖是一种非还原性二糖，它可以发生玻璃态转变，形成新的连续相，阻碍水分子运动，从而提高保水性[11-13]。黄建联[14]研究海藻糖对冻藏鲢鱼滑品质特性的影响，得出海藻糖对保持鱼糜的持水性和Ca2+-ATPase活性、抑制蛋白变性有较好的效果。碱性盐能够通过提升水产品的pH值进一步稳定蛋白质的空间结构，从而改善其保水性[15]。李桂敏等[16]的研究表明，使用含柠檬酸钠和碳酸氢钠的复合无磷保水剂能够有效降低鲟鱼片的解冻损失率和蒸煮损失率，延缓鲟鱼片在冻藏过程中的水分流失，并对保持产品的色泽及质构特性具有显著作用。刘小莉等[17]采用精氨酸对冷冻加州鲈鱼进行浸渍处理，结果表明，精氨酸能显著提高鲈鱼出品率，同时降低解冻损失率和蒸煮损失率，维持蛋白质的稳定性。
本研究分别对海藻糖、柠檬酸钠、碳酸氢钠和L-精氨酸4 种无磷保水剂在黑鱼片中的保水效果进行探究，确定每种保水剂的最佳添加量范围后进行正交复配试验，并研究复合无磷保水剂对冻藏条件下黑鱼片保水性、质构特性、pH值、总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量等理化指标的影响，旨在寻找一种绿色、安全的复合无磷保水剂，为冷冻调理黑鱼片产品加工和贮藏保鲜方法的改进提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜黑鱼（（2 000±100）g） 市购。
复合磷酸盐（焦磷酸钠60%（m/m，下同）、三聚磷酸钠39%、六偏磷酸钠1%） 广东华馨香料有限公司；酵母抽提物KA66、白砂糖 安琪酵母股份有限公司；食盐 湖南盐业集团有限公司；海藻糖（食品级）南宁中诺生物工程有限责任公司；柠檬酸钠（食品级）江苏久佳生物科技有限公司；碳酸氢钠（食品级） 广东恒大科技新材料有限公司；L-精氨酸（食品级） 河南思进生物科技有限公司；超微量ATP酶（Ca2+-ATPase）测定试剂盒 北京百奥莱博科技有限公司。
1.2 仪器与设备
GR-10L真空滚揉机 瑞恒食品机械有限公司；PHS-3DW pH计 合肥桥斯仪器设备有限公司；TA.XT Plus质构分析仪 上海保圣实业发展有限公司；XHFDY高速分散器 宁波新芝生物科技股份有限公司；FC5718R冷冻离心机 美国Ohaus公司；NMI20-040V-I低场核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）分析仪 苏州纽迈分析仪器股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 工艺流程及操作要点
工艺流程：活黑鱼宰杀→取鱼柳→清洗→鱼柳切片→调味去腥→保水处理（无磷保水剂）→称质量→装袋→冻藏→检测分析。
操作要点：将鲜活黑鱼宰杀后去除内脏、头、尾和表皮，处理成鱼柳，将鱼柳用蒸馏水清洗干净后，切成40 mm×20 mm×10 mm规格的鱼片，放入腌制液（1.5%食盐、1%酵母抽提物和0.6%蔗糖，均以鱼肉质量计）中进行30 min的调味去腥。腌制结束后沥干，随机分组并称质量；每组称取40%（m/m，以鱼肉质量计）蒸馏水与一定量保水剂（以鱼肉质量计）混合溶解后，与鱼片一起投入真空滚揉机，在20 ℃室温和0.08 MPa真空条件下，以12 r/min的转速滚揉20 min[18]，称质量并装袋后，在-80 ℃冰箱冷冻至中心温度为-18 ℃，并于-18 ℃条件下冷冻贮藏。
1.3.2 无磷保水剂单因素试验设计
以出品率和解冻损失率为指标，根据预实验结果，以海藻糖、柠檬酸钠、碳酸氢钠和L-精氨酸4 种保水剂添加量为因素设计单因素试验（表1）。
表1 无磷保水剂单因素试验因素与水平
Table 1 Code and level of independent variables used for one-factorat-a-time experiments
水平A海藻糖添加量/%D L-精氨酸添加量/%1 0.00.00.00.0 2 0.20.20.50.2 3 0.40.41.00.4 4 0.60.61.50.6 5 0.80.82.00.8 6 1.01.02.51.0 B柠檬酸钠添加量/%C碳酸氢钠添加量/%
1.3.3 无磷保水剂正交试验设计
根据单因素试验选出最佳的添加量范围，选用L16（44）正交表设计正交试验（表2）。
表2 无磷保水剂正交试验因素与水平
Table 2 Code and level of independent variables used for orthogonal array design
水平A海藻糖添加量/%D L-精氨酸添加量/%1 0.00.00.00.0 2 0.40.40.50.4 3 0.60.61.00.6 4 0.80.81.50.8 B柠檬酸钠添加量/%C碳酸氢钠添加量/%
1.3.4 最优配方冻藏实验
以未添加保水剂的鱼片作为空白组，添加0.3%复合磷酸盐（以鱼肉质量计）的鱼片作为对照组，验证正交试验得出的复合无磷保水剂最佳配方的保水效果。以鱼片出品率、解冻损失率和蒸煮损失率为保水性指标，结合质构特性、pH值、TVB-N含量和硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值等指标，分析调理黑鱼片在冻藏100 d内的品质变化（每隔20 d取样）。
1.3.5 保水性指标测定
1.3.5.1 出品率测定
将鱼片用筛网沥干至无液体滴下，擦除残留水分后称质量并记录，出品率按式（1）计算：
式中：m1为保水处理前鱼片质量/g；m2为保水处理后鱼片质量/g。
1.3.5.2 解冻损失率测定
将有防水包装的冷冻鱼片样品全部浸泡在温度低于25 ℃的水中，直至鱼片中心冰晶完全融化。从包装中取出，并用滤纸吸去鱼片表面残留的水分，称质量并记录，解冻损失率按式（2）计算：
式中：m3为冷冻鱼片质量/g；m4为解冻后鱼片质量/g。
1.3.5.3 蒸煮损失率测定
参考张晨芳等[19]的方法并稍作修改。在测定鱼片样品的解冻损失率后，将其放置于铝箔袋中，并置于65 ℃水浴锅中蒸煮15 min。随后取出样品，使其冷却至室温，并用滤纸去除表面残留的水分，称其质量并记录，蒸煮损失率按式（3）计算：
式中：m5为蒸煮后鱼片质量/g。
1.3.6 质构特性测定
参考李桂敏等[16]的方法并稍作修改。在室温下选择P/50圆柱形探头对切成15 mm×15 mm×10 mm规格的鱼片进行全质构测试。测试参数：测前速率2 mm/s，测中、测后速率均为1 mm/s，触发力5 g，鱼肉压缩百分比50%，间隔时间5 s，每组样品平行测定3 次。
1.3.7 水分分布测定
参考曾璐瑶等[20]的方法并稍作修改。将冷冻鱼片解冻后，用滤纸擦干其表面水分，切成20 mm×20 mm×10 mm规格，用干燥的保鲜膜将鱼肉包裹铺平，最后将制备样本规范装样于预处理的核磁共振检测管中，采用Q-CPMG（quantitative-Carr-Purcell-Meiboom-Gill）序列测定鱼肉的横向弛豫时间（T2）。
1.3.8 pH值测定
参照GB 5009.237—2016《食品pH值的测定》中的方法对鱼片pH值进行测定。取解冻后的鱼片绞碎，称取绞碎后的样品2 g（精确到0.01），加入20 mL蒸馏水，5 000 r/min均质1 min，用校正后的pH计进行测定，待读数稳定后记录数据，读数准确至0.01。
1.3.9 TVB-N含量测定
按GB 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》中的半微量定氮法对鱼肉中的TVB-N含量进行测定。
1.3.10 TBARS值测定
参考GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的测定》中的方法进行，TBARS值用丙二醛含量（mg/100 g）表示。
1.3.11 肌原纤维蛋白含量测定
肌原纤维蛋白的提取参照Lu Han等[21]的方法进行。蛋白质的质量浓度采用双缩脲法进行测定，以牛血清蛋白作为标准对照。
1.3.12 Ca2+-ATPase活性测定
参考超微量ATP酶（Ca2+-ATPase）测定试剂盒说明书进行测定，结果表示为U/mg。
1.4 数据处理
所有实验均重复3 次，所得数据采用SPSS Statistics 26软件进行分析，结果以平均值±标准差表示。采用Origin 2022软件作图。
2 结果与分析
2.1 无磷保水剂的单因素试验结果与分析
2.1.1 不同无磷保水剂及其添加量对冷冻调理黑鱼片出品率的影响
由图1可知，冷冻黑鱼片经不同无磷保水剂滚揉腌制后的出品率均有显著增加（P＜0.05），说明这4 类无磷保水剂对黑鱼片均有较好的保水性能，其中随着海藻糖添加量增加，黑鱼片出品率呈不断增加趋势，因为海藻糖是一种非还原性二糖，可以通过与蛋白质结合阻止其变性和聚集，从而使水分不易流失[22-23]；添加柠檬酸钠和碳酸氢钠的鱼片出品率均显著提高（P＜0.05），因为这2 种保水剂溶液均呈碱性，可通过提高离子强度和pH值提高肌肉自身的保水性[24]。经添加L-精氨酸滚揉腌制的鱼片出品率达最大值，为131.04%，推测精氨酸作为一种带正电荷的碱性氨基酸，因其含有较多的羧基、氨基等官能团，能够与肌肉中的蛋白质产生亲水性结合，从而有效提升肌肉的保水能力。这与刘小莉等[17]的研究结果相似。
图1 不同无磷保水剂及其添加量对冷冻调理黑鱼片出品率的影响
Fig. 1 Effect of type and concentration of non-phosphate water-retaining agent on the yield of frozen prepared snakehead fillets
小写字母不同表示同种无磷保水剂的不同添加水平间差异显著（P＜0.05）。图2同。
2.1.2 不同无磷保水剂及其添加量对冷冻调理黑鱼片解冻损失率的影响
由图2可知，当海藻糖、柠檬酸钠、碳酸氢钠和L-精氨酸的质量分数分别为0.2%～0.8%、0.6%～1.0%、0.5%～2.5%和0.2%～1.0%时，鱼片解冻损失率显著低于未处理组（P＜0.05），说明这4 种保水剂能较好地提升鱼肉的保水性，使其肌肉中的自由水转化为不易流动水，从而使鱼片冻藏期间水分不易流失[25]。添加柠檬酸钠进行保水的黑鱼片，在柠檬酸钠添加量为0.2%时的解冻损失率相比于未处理组显著提高（P＜0.05），可能是由于低添加量的柠檬酸钠不能较好地提升鱼片的抗冻保水能力，使其解冻后的水分流失加剧。由此可见，添加一定量的保水剂能提高黑鱼片的出品率，同时也能降低解冻损失率。因此综合评价4 种无磷保水剂在黑鱼片中的保水性能，当海藻糖、柠檬酸钠、碳酸氢钠和L-精氨酸的添加量分别在0.4%～0.8%、0.4%～0.8%、0.5%～1.5%和0.4%～0.8%时最适宜进行正交复配试验。
图2 不同无磷保水剂及其添加量对冷冻调理黑鱼片解冻损失率的影响
Fig. 2 Effect of type and concentration of non-phosphate water-retaining agent on the thawing loss rate of frozen prepared snakehead fillets
2.2 无磷保水剂正交试验结果与分析
黑鱼片无磷保水正交试验结果如表3～5所示。由表4可知，4 种无磷保水剂对黑鱼片的出品率均有显著影响（P＜0.05），且对黑鱼片出品率影响最大的因素是L-精氨酸添加量，其次是碳酸氢钠、柠檬酸钠、海藻糖添加量。由表5可知，当海藻糖、柠檬酸钠、碳酸氢钠和L-精氨酸的添加量依次为0.6%、0.8%、1.5%、0.8%时，鱼片的出品率最高。海藻糖、柠檬酸钠、碳酸氢钠和L-精氨酸添加量对黑鱼片的解冻损失率影响极显著（P＜0.01），影响程度依次为L-精氨酸、碳酸氢钠、海藻糖、柠檬酸钠添加量。当海藻糖添加量为0.4%或0.8%时，鱼片的出品率和解冻损失率无显著差异，因此从成本考虑，将海藻糖添加量定为0.4%，柠檬酸钠、碳酸氢钠和L-精氨酸添加量依次为0.8%、1.5%、0.8%时，鱼片的解冻损失率最低。综合考虑，复合无磷保水剂最佳配比为：0.4%海藻糖、0.8%柠檬酸钠、1.5%碳酸氢钠、0.8% L-精氨酸。验证正交试验所得复合无磷保水剂最佳配比结果，得到鱼片的出品率为139.23%，解冻损失率为0.77%，保水效果优于上述实验组。
表3 正交试验结果
Table 3 Orthogonal array design with experimental results
试验号A海藻糖添加量B柠檬酸钠添加量C碳酸氢钠添加量D L-精氨酸添加量出品率/%解冻损失率/%11111105.20±0.348.94±0.15 21222120.20±1.512.62±0.23 31333128.97±0.971.82±0.57 41444136.21±1.121.48±0.31 52123120.45±0.791.84±0.21 62214127.62±0.892.86±0.14 72341127.21±2.203.24±0.10 82432132.17±0.591.15±0.48 93134135.78±1.101.64±0.05 103243137.18±1.180.82±0.19 113312120.91±2.293.92±0.39 123421120.21±0.723.89±0.27 134142129.62±0.811.41±0.19 144231121.80±1.193.44±0.72 154324134.48±1.391.10±0.09 164413124.53±0.742.83±0.17
表4 正交试验结果方差分析
Table 4 Analysis of variance for the orthogonal array design results
注：P＜0.05.影响显著；P＜0.01.影响极显著。
指标方差来源（F值、P值）A B C D出品率3.8、＜0.014.4、＜0.0529.2、＜0.0132.7、＜0.01解冻损失率10.1、＜0.015.5、＜0.0135.7、＜0.0144.4、＜0.01
表5 正交试验结果平均值
Table 5 Mean analysis of orthogonal array design results
注：同列小写字母不同表示同种无磷保水剂的不同添加量间差异显著（P＜0.05）。
无磷保水剂添加量/%出品率/%解冻损失率/%海藻糖0.0122.65b3.72a 0.4126.86a2.27c 0.6128.52a2.57b 0.8127.61a2.20c柠檬酸钠0.0122.76c3.46a 0.4126.70b2.44a 0.6127.89a2.52a 0.8128.28a2.34a碳酸氢钠0.0119.57c4.64a 0.5123.84ab2.36ab 1.0129.68ab2.01ab 1.5132.56a1.74b 0.0118.61b4.88a 0.4125.73ab2.28b 0.6127.78ab1.83b 0.8133.52a1.77b L-精氨酸
2.3 复合无磷保水剂处理对冷冻调理黑鱼片保水性的影响
解冻损失率和蒸煮损失率均能直观反映鱼肉在冻藏后的保水能力。如表6所示，当冻藏时间为60 d时，3 组样品的解冻损失率差异显著（P＜0.05）。在冻藏100 d后，3 组处理鱼片的解冻损失率分别为14.68%、8.43%和6.04%，研究结果表明，复合无磷保水剂显著降低了黑鱼片的解冻损失率，从而有效减少了水分的流失。3 组样品的蒸煮损失率均随冻藏时间延长不断增加，原因可能是细胞结构被冰晶破坏，使组织中的不易流动水转化为自由水，这部分水在解冻和蒸煮过程中容易流失[26]。此外，冻藏80、100 d时，空白组与复合磷酸盐组的蒸煮损失率显著高于复合无磷保水剂组（P＜0.05）。这种现象的综合原因可能是复合无磷保水剂中包含的不同保水机理保水剂之间的交互作用，既能减缓蛋白质变性和聚集，也能提高离子强度，使pH值偏离等电点，增强肉的保水性[27-28]。结果表明，在鱼片冻藏过程中，复合无磷保水剂具有更优的保水效果。
表6 复合无磷保水剂对冻藏期间调理黑鱼片保水性的影响
Table 6 Effect of combination of non-phosphate water-retaining agents on the water-retention capacity of prepared snakehead fillets during frozen storage
注：同行小写字母不同表示组内差异显著（P＜0.05）；同列大写字母不同表示组间差异显著（P＜0.05）。表7同。
指标组别冻藏时间/d 020406080100解冻损失率/%空白组9.91±0.92Ac10.56±0.54Abc11.23±0.67Ab13.65±0.59Aa14.03±0.75Aa14.68±0.47Aa复合磷酸盐组1.37±0.23Bd1.92±0.38Bd3.86±0.72Bc6.96±0.24Bb8.15±0.59Ba8.43±0.51Ba复合无磷保水剂组0.77±0.05Bd2.69±0.63Bc3.21±0.42Bc4.97±0.65Cb5.38±0.51Cab6.04±0.37Ca蒸煮损失率/%空白组17.28±1.27Ac17.86±1.17Ac17.98±0.81Ab18.13±0.57Aab19.72±0.80Aa20.94±0.68Aa复合磷酸盐组6.78±0.36Be7.92±0.68Bd10.02±0.30Bc10.82±0.77Bc12.15±0.43Bb13.61±0.68Ba复合无磷保水剂组6.25±0.22Be7.41±0.29Bd8.93±0.60Bc9.62±0.61Bbc10.44±0.55Cb11.83±0.81Ca
2.4 复合无磷保水剂对冷冻调理黑鱼片质构特性的影响
黑鱼片质构的测定指标包括硬度、弹性和咀嚼性，通常数值越大说明鱼肉的品质越好。由表7可知，冻藏时间越长，3 组鱼片的质构指标下降越明显，这可能与蛋白质变性和冻藏凝结的冰晶破坏了鱼体组织结构有关。随着冻藏时间延长，3 组不同方式处理的黑鱼片的硬度、弹性和咀嚼性均有显著差异（P＜0.05），且使用复合无磷保水剂处理的黑鱼片硬度、弹性最大，可能是复合无磷保水剂能更好地延缓脂肪氧化，降低水分流失对鱼肉蛋白质和肌肉纤维组织的破坏。与冻藏0 d相比，冻藏100 d时，空白组的硬度降低47.8%，弹性降低48.4%，咀嚼性降低49.3%；复合磷酸盐组的硬度降低34.9%，弹性降低21.6%，咀嚼性降低19.4%；复合无磷保水剂组的硬度降低26.1%，弹性降低16.9%，咀嚼性降低18.5%。上述分析表明，复合无磷保水剂在维持冷冻鱼肉的硬度、弹性和咀嚼性方面优于其余2 组。
表7 复合无磷保水剂对冻藏期间调理黑鱼片质构特性的影响
Table 7 Effect of combination of non-phosphate water-retaining agents on texture characteristics of prepared snakehead fillets during frozen storage
指标组别冻藏时间/d 0 20406080100硬度/g空白组2 145.29±90.01Ca1 954.28±75.99Cb1 845.67±43.20Cb1 643.26±65.98Cc1 311.26±66.34Cd1 119.27±76.62Ce复合磷酸盐组2 394.33±54.85Ba2 206.72±88.67Bb2 145.88±122.32Bb1 935.46±130.94Bc1 745.82±47.55Bd1 558.34±55.88Be复合无磷保水剂组2 628.41±110.77Aa2 533.45±101.67Aab2 437.18±69.26Ab2 251.32±142.38Ac2 036.18±79.76Ad1 944.57±59.90Ad弹性空白组0.62±0.02Ca0.58±0.03Ca0.57±0.05Ca0.48±0.01Cb0.44±0.02Cb0.32±0.01Cc复合磷酸盐组0.74±0.03Ba0.71±0.05Ba0.70±0.03Ba0.67±0.03Bab0.61±0.05Bbc0.58±0.03Bc复合无磷保水剂组0.83±0.03Aa0.81±0.02Aab0.78±0.01Ab0.73±0.03Ac0.71±0.01Ac0.69±0.03Ac咀嚼性/g空白组793.54±7.36Aa721.52±42.97Ab651.63±43.37Ac589.12±36.94Ad501.46±32.54ABe402.63±31.35Bf复合磷酸盐组521.78±23.49Ca509.28±41.04Ca487.93±25.74Bab469.92±17.11Babc443.91±41.74Bbc420.46±31.19Bc复合无磷保水剂组632.29±23.00Ba618.29±17.01Bab602.44±24.20Aab579.46±27.28Abc539.61±38.36Acd515.38±16.85Ad
2.5 复合无磷保水剂对冷冻调理黑鱼片水分分布的影响
3 组不同方式处理黑鱼片的T2（0.01～10 000 ms）均分布有4 个峰，分别对应3 种水分存在状态，其中T21a、T21b、T22和T23分别代表鱼肉中的强结合水、弱结合水、不易流动水和自由水[29]。如图3所示，复合磷酸盐组和复合无磷保水剂组样品在冻藏期间的强结合水相对含量无显著变化，但空白组的强结合水相对含量显著降低（P＜0.05），当冻藏100 d时，空白组的强结合水显著低于其他组（P＜0.05）。3 组鱼肉样品的弱结合水相对含量均呈下降趋势，当冻藏100 d时，复合无磷保水剂组的弱结合水相对含量显著高于其他2 组（P＜0.05），可能是由于冰晶在冻藏期间不断生成，鱼肉内部肌肉纤维组织受到了破坏，导致水分流失，而复合保水剂能更好地将水分截留在鱼体肌肉组织内部[21]。3 组鱼肉样品的不易流动水相对含量均呈现不同程度的下降，当冻藏100 d时，复合磷酸盐组和复合无磷保水剂组的不易流动水相对含量均显著高于空白组（P＜0.05），可能是随着冻藏时间的延长，肌肉组织被破坏，导致不易流动水向自由水转化，说明保水剂对鱼体中的不易流动水具有较好的保护作用。3 组鱼肉样品的自由水相对含量在冻藏期间均显著增加（P＜0.05），但复合无磷保水剂组的自由水相对含量显著低于其他2 组（P＜0.05），说明复合无磷保水剂的保水性能相对更优。
图3 复合无磷保水剂对冻藏期间调理黑鱼片中不同状态水分相对含量的影响
Fig. 3 Effect of combination of non-phosphate water-retaining agents on the relative contents of four types of water in prepared snakehead fillets during frozen storage
同一贮藏时间从左到右分别为空白组、复合磷酸盐组、复合无磷保水剂组。大写字母不同表示组间差异显著（P＜0.05）；小写字母不同表示组内差异显著（P＜0.05）；图4～8同。
2.6 复合无磷保水剂对冷冻调理黑鱼片pH值的影响
如图4所示，3 组不同方式处理黑鱼片的pH值在冻藏初期呈不断下降的趋势，空白组在冻藏40 d期间，pH值呈显著降低（P＜0.05），可能的原因是鱼肉中糖原酵解、脂肪分解及ATP降解等反应产生乳酸、脂肪酸等酸性物质；当冻藏时间达到60 d后，复合磷酸盐组和复合无磷保水剂组的pH值缓慢增加，而空白组在冻藏40 d后pH值显著提高（P＜0.05），因为长期冻藏过程中，鱼体内的蛋白质在蛋白酶的作用下逐步分解，形成氨基酸及其他碱性化合物。此外，微生物亦会利用这些氨基酸及其他含氮的小分子，进而生成氨和胺类物质，这些过程共同导致了pH值的提高[30]。同时，复合无磷保水剂组在冻藏期间pH值变化幅度最小，说明无磷保水剂能很好地提升黑鱼片冻藏品质，维持鱼肉的稳定性。
图4 复合无磷保水剂对冷冻期间调理黑鱼片pH值的影响
Fig. 4 Effect of combination of non-phosphate water-retaining agents on the pH of prepared snakehead fillets during frozen storage
2.7 复合无磷保水剂对冷冻调理黑鱼片TVB-N含量的影响
如图5所示，冻藏期间，3 组黑鱼片的TVB-N含量均不断提高，可能是随着冻藏时间的延长，微生物生长导致肌肉组织及腌制料中含蛋白组分的分解，氨类物质增多[31]，但3 组样品的TVB-N含量均符合GB 2733—2015《鲜、冻动物性水产品》中规定的淡水鱼TVB-N含量限值（≤20 mg/100 g），说明低温可以有效防止水产品变质。空白组样品TVB-N含量上升速率最快，在样品冻藏100 d后，不同组样品的TVB-N含量差异显著（P＜0.05），分别为8.32、7.13、6.59 mg/100 g。结果表明，复合无磷保水剂组更能有效地抑制冻藏黑鱼片品质的劣变。
图5 复合无磷保水剂对冻藏期间调理黑鱼片TVB-N含量的影响
Fig. 5 Effect of combination of non-phosphate water-retaining agents on the TVB-N content of prepared snakehead fillets during frozen storage
2.8 复合无磷保水剂对冷冻调理黑鱼片TBARS值的影响
如图6所示，随着冻藏时间的延长，3 组不同方式处理鱼片样品的TBARS值均不断增加，且3 组样品间的TBARS值差异显著（P＜0.05），虽然低温能通过降低酶活性抑制微生物生长，但在长时间的冻藏过程中，脂肪的进一步氧化导致以丙二醛为主的醛类化合物含量提高[32]，这可能是导致3 组鱼片TBARS值不断增加的主要原因。在冻藏0～100 d期间，空白组、复合磷酸盐组和复合无磷保水剂组的TBARS值由初始值0.21、0.16、0.15 mg/100 g分别增长至0.67、0.44、0.39 mg/100 g，分别是初始值的3.19 倍、2.75 倍和2.60 倍，经保水剂处理的黑鱼片TBARS值显著低于空白组（P＜0.05），且经复合无磷保水剂处理的黑鱼片TBARS值最低，说明复合无磷保水剂能有效抑制黑鱼片在冻藏期间的腐败变质，与卞欢等[24]的研究结果相似，这可能与复合无磷保水剂中的成分能够螯合肌肉中的金属离子，延缓不饱和脂肪酸氧化有关[16]。
图6 复合无磷保水剂对冻藏期间调理黑鱼片TBARS值的影响
Fig. 6 Effect of combination of non-phosphate water-retaining agents on the TBARS value of prepared snakehead fillet during frozen storage
2.9 复合无磷保水剂对冷冻调理黑鱼片肌原纤维蛋白含量的影响
如图7所示，3 组样品的肌原纤维蛋白含量均随冻藏时间的延长呈下降趋势，在冻藏40 d后，空白组鱼片的肌原纤维蛋白含量与其他2 组差异显著（P＜0.05）。冻藏100 d时，空白组、复合磷酸盐组和复合无磷保水剂组的肌原纤维蛋白含量较冻藏0 d时分别降低28.91%、19.73%和16.75%，原因可能是肌原纤维蛋白分子变性[33]，导致一些不溶性蛋白被释放，最终引起蛋白质溶解性和凝胶特性下降[34-35]；其次是黑鱼片在冻藏过程中，由于肌肉的氧化作用导致鱼肉中的蛋白质变性。其中复合无磷保水剂组黑鱼片冻藏100 d的肌原纤维蛋白含量分别比空白组和复合磷酸盐组高14.61%和3.58%。在不同处理组中，空白组的肌原纤维蛋白变性最为严重，其次是复合磷酸盐组和复合无磷保水剂组。因此可以得出，复合无磷保水剂在减少黑鱼片冻藏过程中肌原纤维蛋白损失方面具有更优的效果。
图7 复合无磷保水剂对冻藏期间调理黑鱼片肌原纤维蛋白含量的影响
Fig. 7 Effect of combination of non-phosphate water-retaining agents on the myofibrillar protein content in prepared snakehead fillets during frozen storage
2.10 复合无磷保水剂对冷冻调理黑鱼片Ca2+-ATPase活性的影响
如图8所示，随着冻藏时间的延长，3 组冻藏黑鱼片的Ca2+-ATPase活性显著降低（P＜0.05），主要原因可能是肌原纤维蛋白氧化变性所致[36]。然而，不同处理方式对Ca2+-ATPase活性的影响差异显著。空白组样品在冻藏初期活性下降最快，冻藏20 d时活性降低超过57%，之后活性下降速率减缓，冻藏100 d时活性仅约0.031 U/mg。而其他2 组黑鱼片的Ca2+-ATPase活性在冻藏初期和后期显著高于空白组（P＜0.05），且2 组之间无显著差异，相较于空白组，其活性变化更为平缓。在冻藏100 d时，复合磷酸盐处理样品的Ca2+-ATPase活性为0.064 U/mg，复合无磷保水剂处理样品的Ca2+-ATPase活性为0.083 U/mg，均显著高于未保水处理样品（P＜0.05）。这一结果与肌原纤维蛋白含量结果一致。因此可以推断，复合无磷保水剂可以更有效地抑制调理黑鱼片肌原纤维蛋白的氧化变性，提高冻藏黑鱼片的品质稳定性。
图8 复合无磷保水剂对冻藏期间调理黑鱼片Ca2+-ATPase活性的影响
Fig. 8 Effect of combination of non-phosphate water-retaining agents on the Ca2+-ATPase activity of prepared snakehead fillets during frozen storage
3 结论
本研究以出品率和解冻损失率为指标，通过单因素试验和正交试验优化筛选得到复合无磷保水剂最优配比：0.4%海藻糖、0.8%柠檬酸钠、1.5%碳酸氢钠和0.8% L-精氨酸。经过长时间冷冻贮藏，3 组黑鱼片的解冻损失率、蒸煮损失率和自由水相对含量均显著上升（P＜0.05），各组鱼片pH值均呈先下降后上升的趋势，质构特性、肌原纤维蛋白含量和Ca2+-ATPase活性显著降低（P＜0.05），与空白组和复合磷酸盐组对比结果表明，复合无磷保水剂能更好地延缓调理黑鱼片长时间冻藏带来的水分损失和质构特性变化，且对保持鱼片pH值稳定、抑制TVB-N含量和TBARS值增加、减缓肌原纤维蛋白含量和Ca2+-ATPase活性降低效果更佳。因此，复合无磷保水剂可替代复合磷酸盐应用于冷冻调理黑鱼片的保水性和品质稳定性改善，其在水产品加工领域具有重要的实践指导意义。
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