加热时，肉中肌原纤维、肌内膜、肌束膜会发生横向、纵向和体积收缩，导致肉中水分和脂肪迁移至外部，肉的嫩度、多汁性下降，进而导致消费者接受度降低[1-2]。调控肌肉的收缩对于优化肉品加工工艺条件、提高肉品品质非常重要。在以往的研究中，国外学者更为关注牛肉在加热过程中的收缩特性，例如，Christensen等[3]研究牛半腱肌单个肌纤维、肌束膜在40～80 ℃升温过程中的收缩强度及其与肉硬度的关系，发现在低于60 ℃时，牛肉硬度的增加与肌束膜收缩强度变化相对应，而在高于60 ℃时，牛肉硬度的变化与单个肌纤维收缩强度的增加相对应，这可能与60 ℃时肌束膜中胶原蛋白明胶化相关。Barbera等[4]研究牛背最长肌在165 ℃烤制时的收缩特性，并和肌肉烤制后汁液流失率建立相关性，发现烤制后立即测定的汁液流失率和收缩率的相关系数为0.63，随着烤制后冷却时间的延长，相关系数变小。相关系数的变化可能还与烤肉中的孔隙有关，烤制过程中肉表面温度高于水沸点，会形成较多的水蒸气通道，进而增加肉的体积。Vaskoska等[5]研究成熟1 d和14 d牛半腱肌、股二头肌和腰大肌的肌纤维在25～90 ℃加热过程中的收缩情况及组织蛋白酶降解作用对肌纤维热收缩的影响，发现组织蛋白酶活性和成熟显著影响加热过程中肌纤维的收缩，成熟14 d的股二头肌体积收缩率为40%，约为成熟1 d时收缩率的2 倍。相比之下，国内学者对肉的热收缩现象关注较少，其中，Li Chao等[6]研究发现，鸭胸肉肌纤维在40～95 ℃范围内的收缩分2 个阶段，当内部温度低于50 ℃时主要为横向收缩，大于50 ℃时主要为纵向收缩。
迄今，羊肉在加热过程中的收缩特性相关研究还较少。部分研究[7-9]利用扫描电子显微镜观察不同加热温度或加热时间对羊肌肉微观结构的影响。但扫描电子显微镜制样需要将肌肉样品完全脱水，因此水分存在时肌肉的肌内膜、肌纤维热收缩数据还较为缺乏。Rao Weili等[10]研究贮藏时间对羊肉热收缩的影响，但未测定加热过程中羊肉收缩的相关数据。宰后贮藏时间、加热过程及其相互作用对羊肉肌肉热收缩特性的影响还不明确。因此，本研究首先提取不同贮藏时间羊肉肌内膜和肌纤维，观察加热后离体肌内膜和肌纤维的热收缩特性；然后采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察不同贮藏时间羊肉加热过程中肌纤维、肌内膜、肌束等的收缩情况，为优化低温慢煮羊肉（一般加热温度低于80 ℃）的原料肉贮藏、加热工艺提供基础参数。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
相同饲喂条件下的6 只小尾寒羊公羊（6 月龄、平均活体质量（53.49±2.16）kg） 河北金宏清真肉类有限公司。
多聚甲醛组织固定液（4 g/100 mL）、苏木精、加拿大树胶、L-组氨酸、天狼星红染色剂、甘露醇缓冲液北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇、二甲苯（分析纯）国药集团化学试剂有限公司；CaCl2 福晨（天津）化学试剂有限公司；氯化钠 天津北联精细化学品开发有限公司；Tris 美国Bio-Rad公司；透明指甲油 金华科维思日化有限公司。
1.2 仪器与设备
BCD-649WE海尔双开门冰箱 青岛海尔股份有限公司；TR6602数字温度仪表 埃用仪器（苏州）有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 金坛杰瑞尔电器有限公司；EMUC6超薄切片机 德国Leica公司；Eclipse Ci生物显微镜 日本Nikon公司；Eos70D数码相机 日本Canon公司；XHF-DY高速分散器 宁波新芝生物科技股份有限公司；XZ21K台式高速冷冻离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司；DH3600B II培养箱 天津泰斯特仪器有限公司；MX-S漩涡仪 大龙兴创实验仪器（北京）股份公司；JYL-C9IT数显鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.3 方法
1.3.1 样品制备
屠宰后羊胴体4 ℃排酸12 h，切取两侧股四头肌，在-38 ℃冷冻6 h后冷藏于-18 ℃备用。实验前，将肉从-18 ℃冰箱中取出，于-0.5 ℃条件下解冻，并切成1 cm×1 cm×1 cm的肉块，4 ℃贮藏0、1、5、7 d。
1.3.2 离体肌内膜和肌纤维热收缩特性测定
1.3.2.1 肌内膜提取
参考Champion等[11]的方法并稍作修改。取1.5 g肌肉，切成小块，加入提前预冷的10 mL 0.05 mol/L CaCl2溶液，在高速分散器中均质3～5 s，使用1 mm2方孔筛子进行过滤。将未通过筛子的部分重新均质并过滤。重复该操作2 次，合并滤液，1 000×g离心15 min，形成松散的沉淀物，弃去上清液。将沉淀重悬于含有2.5 mmol/L L-组氨酸的25 mmo/L氯化钠溶液（先用1 mol/L Tris调节至pH 7.4）中，搅拌5 min，600×g离心4 min，弃去上清液。重复该操作3 次后，将沉淀在上述溶液中37 ℃孵育30 min，洗涤5 次（600×g、4 min），将沉淀重悬于蒸馏水（先用1 mol/L Tris调节至pH 7.5）中，洗涤10 min，3 000×g离心15 min，弃去上清液，保留沉淀。
1.3.2.2 肌纤维提取
参考Liao Pinchao等[12]的方法并稍作修改，取1 g肌肉，加入10 mL甘露醇缓冲液，使用高速分散器匀浆15 s。将1 mL含有悬浮纤维碎片的匀浆液置于离心管中，加入2 μL 1 g/100 mL磷钼酸溶液，室温孵育5 min，600×g离心1 min，弃去上清液，保留沉淀。
1.3.2.3 肌内膜和肌纤维染色
参照Vaskoska等[5]的方法并稍作修改。取肌内膜沉淀或肌纤维沉淀样品，加入500 μL天狼星红染色剂，37 ℃下孵育90 min，除去上清液，再加入1 mL 0.01 mol/L HCl溶液，涡旋并静置，除去上层HCl溶液。沉淀加入1 mL甘露醇缓冲液洗涤，重复3 次。天狼星红染色剂将肌内膜染为红色，肌原纤维染为黄色，带有肌内膜的肌纤维染为橙色。
1.3.2.4 肌内膜和肌纤维加热与观察
将一滴染色的肌内膜/肌纤维悬液置于带凹槽的载玻片上，用盖玻片覆盖并用透明指甲油密封。采用显微镜观察。为使结构清晰可见，所有图像均采用增强亮度（40%）。选定包含典型深红色肌内膜和橙色肌纤维的视野后，将载玻片放于烘箱中40 ℃加热20 min，冷却到室温后，在显微镜中找到选定的肌内膜和肌纤维进行拍照。拍照后将载玻片依次在50、60、70、80 ℃加热20 min后再进行拍照，放大倍数为200。每个贮藏时间的每个加热温度处理组均含有每只羊的5 个肌内膜或肌纤维数据。
1.3.2.5 肌内膜和肌纤维纵向、横向和面积收缩率计算
选择肌内膜与肌纤维较为规则处，使用ImageJ v1.8.0软件测定长度和宽度，长度取肌纤维方向，宽度取垂直于肌纤维方向，并计算其面积。收缩率（%）为加热前后长度、宽度、面积变化量分别占加热前长度、宽度、面积的比例。长度收缩率也称纵向收缩率，宽度收缩率也称横向收缩率。每只羊股四头肌的3 个肌内膜或肌纤维载玻片用于加热、观察、拍照和计算。
1.3.3 原位肌纤维、肌内膜观察和收缩特性测定
1.3.3.1 加热处理
将不同贮藏时间的羊肉块从4 ℃冰箱取出，每只羊各取5 个肉块，放入预热好的40 ℃水浴锅中加热，至中心温度达到设定温度±0.5 ℃时，继续加热20 min后，取出6 块并擦干水分，保存于组织固定液中；剩余肉块放入50 ℃水浴锅中加热20 min后，取出6 块并擦干水分，保存于组织固定液中。以此类推，再经过60 ℃和70 ℃加热处理。
1.3.3.2 微观结构观察与收缩特性测定
参考Rao Weili等[10]的方法观察解冻羊肉或加热羊肉的微观结构，并测定和计算组织的孔隙率、肌束间距、肌纤维间距及肌纤维横截面面积。
1.4 数据处理
采用SPSS Statistics 23软件，以贮藏时间与热处理温度为固定效应因子进行双因素分析、Duncan多重比较检验，探讨贮藏时间（A）、加热温度（B）及其交互作用（A×B）对肌内膜与肌纤维纵向、横向和体积收缩率的影响，以及对解冻羊肉孔隙率、肌束间距、肌纤维间距、肌纤维横截面面积的影响。结果以平均值±标准差表示，P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 加热温度和贮藏时间对离体肌内膜热收缩的影响
由图1可知，同一贮藏时间下，随着加热温度的升高，肌内膜纵向和横向均发生收缩；但同一加热温度下，由于肌内膜直径和形态差异较大，未观察到其随贮藏时间的明显变化趋势。
图1 加热温度和贮藏时间对离体肌内膜热收缩的影响
Fig. 1 Effect of heating temperature and storage time on the shrinkage of ex vivo endomysium
由表1可知，贮藏时间、加热温度及贮藏时间与加热温度交互作用均对肌内膜纵向、横向和面积收缩率影响显著（P＜0.001）。肌内膜纵向、横向和面积收缩率随贮藏时间的延长呈先下降再上升再下降的趋势，这与古扎努尔·艾斯卡尔等[13]的研究结果相一致。加热温度越高，收缩率越大，其中，贮藏0 d羊肉肌内膜纵向收缩率在60 ℃时开始显著增加，横向收缩率、面积收缩率均在50 ℃时开始显著增加（P＜0.05）；贮藏1 d羊肉肌内膜纵向收缩率在70 ℃时开始显著增加，横向收缩率、面积收缩率均在60 ℃时开始显著增加（P＜0.05）；贮藏5 d羊肉肌内膜纵向收缩率在50 ℃时开始显著增加，横向收缩率在60 ℃时开始显著增加，面积收缩率在70 ℃时开始显著增加（P＜0.05）；贮藏7 d的羊肉肌内膜纵向收缩率、面积收缩率均在60 ℃时开始显著增加，横向收缩率在70 ℃时开始显著增加（P＜0.05）。常海军等[14]研究表明，牛半腱肌肌内膜的最大变性发生在55 ℃左右。在Champion等[11]的研究中，牛胸下颌肌的肌内膜横向和纵向收缩主要发生在50～65 ℃之间。这与本研究中羊肌内膜收缩温度接近。但Champion等[11]的研究结果表明，牛胸下颌肌的肌内膜宽度和长度可分别收缩到原来的70%和40%，远高于本研究中羊股四头肌肌内膜的收缩程度。这可能和肌内膜中胶原蛋白的性质有关，胶原纤维是肌内膜的主要成分，其在加热过程中可发生变性、收缩和降解。牛肉胶原蛋白可在60 ℃以上发生变性[15]，而羊肉肌束膜中胶原蛋白变性温度在40 ℃左右，而肌内膜中胶原蛋白的变性温度在50～56 ℃之间[16-17]。
表1 加热温度和贮藏时间对离体肌内膜纵向、横向和面积收缩率的影响
Table 1 Effect of heating temperature and storage time on longitudinal, transverse and area shrinkage rates of ex vivo endomysium
注：同行小写字母不同表示同一贮藏时间、不同加热温度之间差异显著（P＜0.05）；同列大写字母不同表示同一加热温度、不同贮藏时间之间差异显著（P＜0.05）。表2同。
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2.2 加热温度和贮藏时间对离体肌纤维热收缩的影响
由图2和表2可知，贮藏时间、加热温度及贮藏时间与加热温度交互作用均对肌纤维纵向、横向和面积收缩率影响显著（P＜0.001）。加热温度越高，肌纤维收缩率越大。其中，贮藏0 d羊肉肌纤维纵向收缩率、横向收缩率均在60 ℃时开始显著增加，面积收缩率在50 ℃时开始显著增加（P＜0.05）；贮藏1 d羊肉肌纤维纵向收缩率在60 ℃时开始显著增加，横向收缩率、面积收缩率均在50 ℃时开始显著增加（P＜0.05）；贮藏5 d羊肉肌纤维纵向收缩率、横向收缩率均在60 ℃时开始显著增加，面积收缩率在70 ℃时开始显著增加（P＜0.05）；贮藏7 d羊肉肌纤维纵向收缩率在60 ℃时开始显著增加，横向收缩率在60 ℃时开始显著增加，面积收缩率在60 ℃时开始显著增加。在加热过程中，肌纤维受热发生变性使肌纤维结构发生改变[17-18]。董晗等[17]研究发现，兔肉肌纤维直径在75～85 ℃收缩显著，高于本研究中的显著收缩温度。综合对比发现，羊股四头肌肌内膜加热时的收缩率普遍大于肌纤维，从而使肌肉纤维表现出与肌内膜类似的收缩比例和收缩温度。而在牛肉热收缩研究中，肌内膜的收缩率远大于肌纤维，导致最终肌肉整体收缩率和肌纤维的收缩率相接近。
表2 加热温度和贮藏时间对离体肌纤维纵向、横向和面积收缩率的影响
Table 2 Effect of heating temperature and storage time on the longitudinal, transverse and area shrinkage rates of ex vivo muscle fibers
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图2 加热温度和贮藏时间对离体肌纤维收缩的影响
Fig. 2 Effect of heating temperature and storage time on the shrinkage of ex vivo muscle fibers
2.3 加热温度和贮藏时间对原位羊肉块收缩的影响
由图3可知，贮藏时间和加热处理可引起肌肉中孔隙，包括肌细胞间孔隙和肌束间孔隙的变化。孔隙的大小是由加热过程中肌纤维、肌内膜和肌束膜收缩不同步造成的。当肌纤维收缩率大于肌内膜收缩率时，肌纤维间孔隙直径增加。当肌纤维收缩率大于肌束膜收缩率时，肌束间孔隙直径增加。
图3 不同贮藏时间和加热处理羊肉的HE染色图
Fig. 3 HE staining of lamb meat with different storage times and different heating treatments
由表3可知，贮藏时间、加热温度及贮藏时间与加热温度交互作用均对羊肉孔隙率影响显著（P＜0.001）。随着贮藏时间的增加，解冻羊肉的孔隙率显著升高（P＜0.05）。与解冻羊肉相比，除贮藏1、5 d、加热温度50 ℃处理羊肉外，其余羊肉孔隙率均显著降低（P＜0.05），其中，加热温度40 ℃时，羊肉在整个贮藏期内的孔隙率均显著低于解冻羊肉，表明羊肉肌内膜和肌束膜在40 ℃加热时便已发生显著热收缩。与李海等[19]的研究结果相同，相比于生肉，40 ℃加热处理后肌束间隙显著缩小。由表4、5可知，当加热温度升至50～60 ℃时，肌束间距和肌纤维间距显著增加（P＜0.05），这可能是因为肌内膜和肌束膜纵向收缩导致肌内膜横向尺寸变大。Astruc等[20]的研究也发现，65 ℃以下加热时，肉的肌纤维会发生明显收缩，并出现与肌内膜和肌束膜分离现象。
表3 加热温度和贮藏时间对解冻羊肉孔隙率的影响
Table 3 Effect of heating temperature and storage time on the porosity of thawed lamb
注：同列小写字母不同表示同一贮藏时间、不同加热温度之间差异显著（P＜0.05）；同行大写字母不同表示同一加热温度、不同贮藏时间之间差异显著（P＜0.05）。表4～6同。
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表4 加热温度和贮藏时间对解冻羊肉肌束间距的影响
Table 4 Effect of heating temperature and storage time on the distance between muscle fiber bundles in thawed lamb
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由表3可知，除贮藏0 d、处理温度为50 ℃和60 ℃时孔隙率无显著差异（P＞0.05），整个贮藏期相邻加热温度之间孔隙率均存在显著差异（P＜0.05），且随加热温度增加呈先增加后降低的趋势。当加热温度低于60 ℃时，羊肉孔隙率随贮藏时间延长而增加。在贮藏0 d，40～50 ℃和50～60 ℃ 2 个温区的孔隙率变化差值均小于贮藏1、5、7 d后的相应差值。一般认为，加热时肌肉蛋白变性导致肌肉收缩与结构变化[21]。当加热温度为50～60 ℃时，肌球蛋白发生变性，肌纤维收缩以横向收缩为主；当加热温度为60～70 ℃时，结缔组织胶原蛋白发生变性导致肌肉收缩与肌纤维收缩相互协同，此时的肌纤维收缩以纵向收缩为主[22-24]，进而导致横截面变大。值得注意的是，贮藏1、5、7 d，与加热温度50 ℃相比，加热温度60 ℃下的孔隙率发生显著降低（P＜0.05），这可能与贮藏过程中某些连接细胞与结缔组织蛋白有关，当肌细胞开始收缩时，上述蛋白的存在可能导致肌细胞收缩所产生的力作用于肌内膜上，牵引肌内膜向细胞方向收缩，从而导致孔隙率变化差异相对较小，而随着贮藏时间的延长，连接性蛋白逐渐降解，结构发生变化，肌细胞对肌内膜的影响减小，导致孔隙率发生显著变化。加热温度60～70 ℃下孔隙率减小还可能与热溶性胶原蛋白的溶解有关，在对鸡肉的研究[25]中发现，当加热温度升至65 ℃时，部分胶原蛋白发生变性而溶出，不仅如此，随着加热温度的升高和加热时间的延长，结缔组织变性所形成的凝胶会填补原本的孔隙[26]，而不溶性胶原蛋白则会挤压热变性的肌原纤维，导致肌纤维间隙减小[27-28]，因此在扫描电子显微镜下可发现肌纤维之间填充了许多颗粒状物质，并伴随着孔隙率的下降。
由表4可知，随贮藏时间延长，解冻羊肉的肌束间距逐渐缩小。在羊肉肌束膜厚度研究[29]中有相类似的结果，4 ℃贮藏时，羊背最长肌肌束膜厚度呈先上升后下降的变化趋势，在贮藏3 d达到最大值，表明在贮藏3 d后结缔组织结构发生弱化。部分学者认为肌束膜和肌内膜中胶原纤维在65～80 ℃下收缩将会引起肌肉块整体结构收缩，并促使肌纤维聚集、孔隙率减小，进而导致肉质变硬[15,30-32]。由表5可知，在加热温度由40 ℃升至50 ℃时，羊肉肌纤维间距显著增加，之后随处理温度增加而显著缩短（P＜0.05），这与陈春梅等[9]的研究结果相类似，该研究表明加热温度对羊肉微观结构存在影响，随着加热温度的增加，羊肉肌纤维间隙逐渐增大，肌纤维间距离在70 ℃时达到最大，之后随加热温度的升高逐渐缩短。
表5 加热温度和贮藏时间对解冻羊肉肌纤维间距的影响
Table 5 Effect of heating temperature and storage time on the distance between muscle fibers in thawed lamb
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如表6所示，贮藏时间、加热温度及贮藏时间与加热温度交互作用均对羊肉肌纤维横截面面积影响显著（P＜0.001）。贮藏0、1 d时，在加热温度40～70 ℃下，羊肉肌纤维横截面面积未发生显著变化（P＞0.05）。贮藏5、7 d时，羊肉肌纤维横截面面积随温度的增加而显著减小（P＜0.05）。相比于贮藏7 d羊肉在加热温度40 ℃时已显著减小，贮藏5 d羊肉在加热温度50 ℃时才开始显著减小，并在70 ℃时发生第2次显著减小。加热温度70 ℃时，贮藏0、1 d羊肉的肌纤维横截面面积有增加的趋势，这可能与受热过程中肌球蛋白与肌动蛋白发生的变性吸水溶胀以及结缔组织膜结构破损有关[33-34]，这一现象与吴兵[35]对鸡肉的研究结果相类似，该研究表明鸡肉肌纤维在55～60 ℃有减小的趋势，说明在此温度下鸡肉发生了一定程度的热收缩，而在75～85 ℃下肌纤维因肌原纤维蛋白热变性引发显著溶胀，导致其横截面直径增大。贮藏5、7 d羊肉肌纤维横截面面积随着处理温度的增加显著减小，这可能与贮藏过程中肌球蛋白与肌动蛋白的降解以及结缔组织的弱化有关，较高温度下肌纤维的吸水溶胀能力降低，肌纤维横截面面积持续减小。
表6 加热温度和贮藏时间对解冻羊肉肌纤维横截面面积的影响
Table 6 Effect of heating temperature and storage time on the cross-sectional area of muscle fibers in thawed lamb
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3 结 论
贮藏时间、加热温度及贮藏时间与加热温度交互作用对羊肉离体肌纤维和肌内膜的横向、纵向和面积收缩影响显著，对原位羊肉孔隙率、肌束间距、肌纤维间距、肌纤维横截面面积影响显著（P＜0.001）。加热温度越高，羊肉肌纤维与肌内膜的横向、纵向和面积收缩率越大。加热过程中，肌束膜、肌内膜和肌纤维收缩温度不同步造成羊肉中孔隙的变化。原位实验结果表明，贮藏时间的延长使生鲜羊肉肌纤维横截面面积显著增加（P＜0.05），加热后羊肉收缩率更高。在加工过程中，避免过高的加热温度可以有效减少肌肉纤维的热收缩现象，保持羊肉的嫩度和多汁性。宰后贮藏过程中肌肉蛋白会发生降解，这与肌肉热收缩的关系及相关机制还不明确。在以后的研究中利用不同蛋白酶将加热前肌肉蛋白进行降解，然后分析肌肉加热收缩特性，进而明确肌肉热收缩相关的蛋白及其收缩位点，可为进一步揭示肌肉热收缩机制提供理论依据。
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