Rapid Detection of Dog-Derived Ingredients by Real-Time Recombinase-Aided Amplification
刘明明, 颜海燕, 周朝旭, 等.实时重组酶辅助扩增技术快速检测狗源性成分[J].肉类研究, 2025, 39(4): 24-29.DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20241009-261.http://www.rlyj.net.cn
LIU Mingming, YAN Haiyan, ZHOU Zhaoxu, et al.Rapid detection of dog-derived ingredients by real-time recombinaseaided amplification[J].Meat Research, 2025, 39(4): 24-29.(in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20241009-261.http://www.rlyj.net.cn
狗肉自古有“香肉”和“白狗”等别称，在传统的医学记载中具有一定的滋补功效[1]，但作为一种存在诸多争议的食材，其在市场上的流通状况复杂多样。由于狗的养殖成本高、供应稀缺且价格居高不下，一些不法商贩为谋取高额利润，通过非法途径或养殖场弃用的毛皮动物肉掺入或替代进行销售。近年来，狗肉掺假事件屡禁不止。2023年5月曝光线上销售的桂林灵川狗肉，实则为鸭肉烹饪制成。甚至有报道称某些食品加工商户将未经检验的狐狸肉、貂肉加工成熟食，以狗肉的名义出售。狐狸、貂与狗同属犬科动物，可能携带多种病毒[2]，失去毛皮的狐肉、貂肉被低价收购冒充狗肉销售流通，不仅严重侵犯了消费者合法权益，贸然食用还会给食用者健康带来潜在的危险。尤其在新冠肺炎全球肆虐的背景下，食用野味的危险性愈发凸显。此外，对于穆斯林消费者而言，不明标签的狗肉成分掺入清真食品，无疑于严重侵犯了他们的宗教信仰[3]。为应对一系列严峻问题，2020年深圳市和珠海市相继立法禁食狗肉[4]。
随着科学技术不断发展，越来越多的分子生物学技术被应用于肉源性成分检测，主要包括基于外源蛋白和基于外源核酸的2 种检测技术。相比于蛋白质，DNA是大多数生物体的遗传物质，具有更高的稳定性和特异性。因此，基于DNA的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测技术通常作为肉类鉴定的首选方法[5-6]，其中包括传统PCR[7]、分子信标实时PCR（molecular beacon-based real-time PCR，MB-realtime PCR）[8]、实时荧光PCR[9]、限制性片段长度多态性PCR（PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）[10]及数字PCR[11]等。近年来，DNA扩增技术的推进使得物种鉴定的方法得到了快速发展。基于传统PCR检测通量低的缺点[12-13]，已构建了多种多重传统PCR检测方法用于狗与其他物种的区分检测，但仍需依赖凝胶电泳的步骤[14-15]。随着实时荧光PCR的产生，免去了此步骤的操作[16-17]，同时能对整个扩增过程进行实时监测，并在此基础上又衍生了多重实时荧光PCR和新型通用引物多重实时PCR等检测技术[18-20]，从而解决了MB-realtime PCR和PCR-RFLP背景信号低、设计复杂、特异性酶要求较高及易出现假阳性等问题，但仍需昂贵的变温分析仪器。环介导等温扩增技术的开发摆脱了对变温仪器的依赖，但检测时间仍然较长，且操作复杂[21]。基于此，构建一种恒温、快速且操作简单的检测方法非常必要。
实时重组酶辅助扩增（real-time recombinase aided amplification，Rt-RAA）是近年来新兴的一种PCR衍生检测方法，广泛应用于分子诊断、微生物检测、病原体鉴定和食品安全检测等领域[22-24]。该方法在37～42 ℃恒温条件下，主要通过UvsX重组酶、单链DNA结合蛋白（single-stranded DNA-binding protein，SSB）和Bsu DNA聚合酶3 种酶20 min内即可实现扩增产物的快速积累[25]，无需热循环仪。扩增过程的实时监测取决于DNA聚合酶外切酶的活性，可以识别和剪切无碱基位点四氢呋喃（tetrahydrofuran，THF）。此外，Rt-RAA试剂存在冻干粉形式，便于运输到服务点，无需冷链贮藏。并且，可以使用各种检测仪器查看扩增产生的产物或将其集成在不同平台上，从而为资源匮乏环境中的广泛运用提供了灵活性[26]。
本研究针对细胞色素B（cytochrome B，cytb）基因序列的保守区域建立用于狗源性成分的Rt-RAA检测方法，对该方法的实验条件进行优化，并评估其特异性和灵敏度。此外，利用Rt-RAA检测方法对实际样品和模拟样品进行检测，并将结果与国标方法进行对比。
鼠活体购自广东省医学实验动物中心；狗肉、猫肉、狐狸肉和貂肉的鲜肉质控样品由东莞元佳实验科技有限公司提供；牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、马肉、鹅肉、驴肉、骆驼肉为本实验室日常肉品质检测所用的质控样品；兔肉、马鹿肉、梅花鹿肉为线上购买，并通过GB/T 38164—2019《常见畜禽动物源性成分检测方法 实时荧光PCR法》进行真实性鉴定，结果均符合要求；核酸扩增试剂盒（内含水化缓冲液、MgAc缓冲溶液）由众测（杭州）生物科技有限公司提供；核酸提取试剂盒由成都TaKaRa公司提供。
CFX96 Touch荧光定量PCR仪 美国Bio-Rad公司；GR85DA高压灭菌锅 致微（厦门）仪器有限公司；ME403千分之一电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；Nanodrop ONEc超微量分光光度计 美国Thermo Scientific公司。
1.3.1 样品预处理
由于狐狸和貂与狗同属于犬类动物，检测通常易受干扰，本研究为了保证所建立Rt-RAA方法在检测中的可实用性，将狐狸肉和貂肉粉碎，并等质量混合后作为本次实验所用的基底肉。将狗肉与基底肉混合，其中狗肉质量分数分别为100%、50%、25%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0%，以确定狗源性成分检出限。
1.3.2 样本DNA提取
按照提取DNA试剂盒说明书，取约50 mg新鲜狗肉样本，与裂解液充分研磨混合，为提高所提取的DNA质量，加入20 µL蛋白酶（20 mg/mL）和10 µL RNA酶（10 mg/mL）反应2 h，后续通过吸附柱进行吸附和过滤，即可得到目的DNA。通过超微量分光光度计对其进行评价，将吸光度A260 nm和A280 nm比值在1.7～1.9的目的DNA稀释至10 ng/μL，于-20 ℃保存，以备后续实验使用。
1.3.3 Rt-RAA引物、探针设计与合成
基于GenBank数据库公布的狗基因序列，通过BLAST进行对应序列同源性分析，确定cytb基因（基因ID：804486）中的保守序列。根据该序列，通过Rt-RAA工作原理和探针引物设计规则，使用Snap Gene软件设计3 对狗特异性引物和1 条核酸外切酶（exonuclease，exo）探针，相关序列如表1所示。设计的引物和探针序列均送至生工生物工程（武汉）股份有限公司进行合成。
表1 用于Rt-RAA分析的引物和exo探针序列
Table 1 Primer and exo probe sequences used in the Rt-RAA assay
引物和探针名称引物和探针序列（5’→3’）RAA-cytb-F1TATATGCACGCAAATGGCGCTTCCATATTC RAA-cytb-R1ATGGCAGAGAGAAGATTAGTGATTACAGTTG RAA-cytb-F2AACTACGGCTGAATTATCCGCTATATGCAC RAA-cytb-R2ACAGTTGCTCCTCAAAATGATATTTGTCCTC RAA-cytb-F3ACATCTGCCGAGACGTTAACTACGGCTGAA RAA-cytb-R3CTCTGCCATCCCTTATATCGGAACTGACTTA RAA-cytb-P TAGGACGAGGCCTATATTACGGATCCTATGFAMdT-THF-T-BHQ1dTCATAGAAACATGAAAC-C3 Spacer
1.3.4 Rt-RAA检测条件
为研究Rt-RAA最适反应条件，分别对不同的引物对进行筛选，并探究其探针浓度，最终将筛选确定的反应终浓度200 nmol/L的RAA-cytb-F2、R1引物和反应终浓度160 nmol/L的RAA-cytb-P作为后续实验反应物。此外，反应体系还包括：25 μL水化缓冲液、2.5 μL 280 mmol/L MgAc缓冲溶液和1 μL目标DNA，最终用ddH2O补齐至50 μL。在本体系下，探究在33～43 ℃梯度范围内最佳反应温度，每一反应温度条件下进行的实验均设置3 个平行。所有实验运行程序均为30 s/循环，40 个循环。
1.3.5 Rt-RAA特异性实验
按照上述确定的Rt-RAA检测条件，对提取的鼠肉、猫肉、狐狸肉、貂肉、牛肉、鹅肉、羊肉、骆驼肉、猪肉、兔肉、鸡肉、梅花鹿肉、马肉、驴肉、马鹿肉和鸭肉DNA进行扩增，并以狗肉的DNA和ddH2O分别作为阳性对照和空白对照作为参照，以确定检测方法的特异性。
1.3.6 Rt-RAA灵敏度和稳定性实验
将狗肉与基底肉充分混合，制成狗肉质量分数分别为100%、50%、25%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0%的模拟样品，并提取DNA进行恒温扩增，以确定所建立的方法对狗肉的检测灵敏度，并与GB/T 38164—2019中实时荧光PCR法检测灵敏度进行对比。
选取狗肉质量分数分别为1%、0.5%、0.2%的模拟样品DNA，进行重复性扩增反应，每组设置10 个平行样，以确定Rt-RAA检测方法的稳定性。每组平行样均按照1.3.2节方法进行DNA提取，将A260 nm/A280 nm在1.7～1.9范围内的DNA质量浓度均稀释至10 ng/μL。
1.3.7 市售样品和模拟样品检测
在狗肉店、烧烤店和小商店随机购买15 份样品，并制作市售模拟样品（将狗肉与基底肉混合，制成狗肉质量分数分别为0.5%和1%的样品，通过高压灭菌锅121 ℃、20 min蒸熟），利用所建立的Rt-RAA方法和GB/T 38164—2019中的实时荧光PCR法进行狗源性成分检测，对实验结果进行对比分析并评价。
采用PowerPoint软件作图。采用Exce1软件进行数据处理，实验结果以±s表示。
根据NCBI公布的基因序列，按照Rt-RAA工作原理，合成用于目的片段扩增的引物和探针。为达到最优的扩增效果，本研究鉴定并筛选9 对引物-探针组合与狗源DNA反应性。如图1A所示，所有组合均得到有效扩增，并且呈现典型的“S”型曲线。然而，只有5 对引物组合在相对较低的循环阈值（cycle threshold，Ct值）下快速达到扩增平台期，其中引物组合F2R1（RAAcytb-F2和RAA-cytb-R1）扩增起点早于其他组合。因此，将F2R1引物组合用于实验的进一步优化和验证。在固定200 nmol/L引物终浓度条件下，在40～280 nmol/L浓度范围探究不同浓度探针对Rt-RAA信号响应的影响。如图1B所示，荧光强度和反应效率随着探针浓度的增加而逐渐增加，160 nmol/L时反应起始点明显早于其他探针浓度扩增曲线，且荧光强度最强。因此，选择160 nmol/L作为所有后续实验的探针浓度。
图1 不同引物组合和探针浓度筛选
Fig.1 Screening of different primer combinations and probe concentrations
A.F1R1～F3R3引物组合扩增狗DNA的荧光曲线；B.不同探针浓度扩增狗DNA的荧光曲线。
温度是Rt-RAA反应过程中的关键参数，如图2所示，在33～43 ℃温度区间内均能有效扩增出目的序列。在33～39 ℃范围内，随着扩增温度的升高，Ct值逐渐降低。在41 ℃时，扩增起始点开始出现延迟。尽管在43 ℃下进行Rt-RAA反应效率有所提高，但Ct值仍高于39 ℃扩增Ct值。因此，将39 ℃作为实验反应温度，以实现Rt-RAA方法效果达到最佳。
图2 Rt-RAA反应温度的优化
Fig.2 Optimization of Rt-RAA reaction temperature
A～F.33、35、37、39、41、43 ℃下扩增反应曲线；G.温度与Ct值的相关性。
特异性是Rt-RAA作为检测方法使用之前需评估的重要指标。如图3所示，只有狗肉样品DNA呈现出典型的“S”型扩增曲线，其他肉类和空白对照均未检测出荧光强度变化。表明Rt-RAA检测方法具有较高的特异性，可以将目的基因与日常其他肉类基因进行区分，有效避免假阳性的出现。
图3 Rt-RAA方法特异性验证
Fig.3 Specificity verification of Rt-RAA
如图4所示，随着狗肉质量分数降低，所检测的Ct值逐渐减小。其中，Rt-RAA方法可检测狗肉质量分数低至0.2%，且在Ct值20以内即可检测到扩增荧光强度。GB/T 38164—2019中实时荧光PCR法检测狗肉最低质量分数则为0.5%，且扩增荧光在Ct值30以上才可被仪器所捕获。表明本研究创建的Rt-RAA方法检测狗源性成分灵敏度明显优于传统的实时荧光PCR检测方法，并为检测更低质量分数狗源性成分提供了更加灵敏、快捷的新方法。
图4 狗肉源性成分Rt-RAA方法检测灵敏度
Fig.4 Sensitivity of Rt-RAA for detection of dog-derived ingredients
A.Rt-RAA方法检测不同质量分数狗肉；B.实时荧光PCR法检测不同质量分数狗肉。
如图5所示，不同质量分数的狗源性成分在重复实验中均能出现扩增曲线，但重复样本之间稍有不同，其中质量分数为0.2%时的检测结果差异最大。随着质量分数降低，所测的平均Ct值逐渐升高。狗肉质量分数为1%、0.5%和0.2%时所测得的10 次重复性实验的相对标准偏差分别为7.68%、8.26%和10.90%。表明本研究构建的Rt-RAA检测方法具有可接受的稳定性。
图5 Rt-RAA方法的重复性
Fig.5 Repeatability of Rt-RAA
A～C.狗肉质量分数分别为1%、0.5%、0.2%时的Rt-RAA结果；D.不同狗肉质量分数样品的10 次重复实验平均Ct值。
为进一步验证所构建的Rt-RAA方法的实用性，本研究增加了模拟样品进行对比检测。如表2所示，2 种方法对模拟样品检测结果符合率达100%。
表2 狗源性成分的Rt-RAA和实时荧光PCR方法检测结果
Table 2 Results of detection of dog-derived ingredients by Rt-RAA and real-time fluorescent PCR
狗源性成分检出样本数Rt-RAA方法实时荧光PCR方法狗肉555羊肉串300牛肉馅料肉饼411羊肉卷311狗肉模拟样品（质量分数0.5%）333狗肉模拟样品（质量分数1%）333样品类型样品数量
本研究以狗的多拷贝线粒体基因组中cytb基因保守序列为靶标，设计了3 对RAA引物和1 条exo探针。通过引物的筛选、探针浓度和反应温度的优化，构建了用于狗源性成分的Rt-RAA检测方法。该方法的建立有效缩短和简化了掺假鉴定过程，从而提高了检测效率。此外，构建的Rt-RAA检测方法具有较高的特异性和较低的检出限，对于16 种非靶标物种无交叉反应，可检测出质量分数低至0.2%的狗源性成分，并且结果稳定。针对市售样品和模拟样品的检测，结果与实时荧光PCR法一致。为确保在日常中能够检出较低质量分数的狗肉样品，本研究将循环数设定为40。在此循环数下，Rt-RAA检测方法在30 min内即可完成扩增。综上所述，本研究开发的Rt-RAA反应体系是一种有效的检测方法，可用于市场上狗源性成分鉴定，为打击非法狗肉掺假提供了有力的技术支撑。
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