抗冻肽（antifreeze peptides，AFP）是来源于耐寒地区动植物体内的一类特异的多肽或糖肽，能够以非依数的形式降低溶液的冰点而不改变其熔点[1]。近几年研究证实，畜源胶原蛋白中含有多个-Gly-Pro(Hyp)-Hyp-的AFP重复序列，可以酶解获得胶原AFP[2-3]。AFP作用于细胞表面，在温度降低至冰点附近时，可以吸附并包裹细胞内外形成的冰核，有效抑制冰晶生长和重结晶[4]，从而减少冰晶对细胞膜的破坏[5]。AFP既无毒性，其功能特性也与任何毒性蛋白液没有关联[6]，因此其作为绿色抗冻剂在冷冻食品加工中的应用较早。Liu Mei等[7]将AFP用于冷冻面团加工中，加速二氧化碳的产生，以提高冷冻面团的口感；Li Fangfei等[8]将其添加到冷冻猪肉饼中，发现冷冻180 d后猪肉饼表面粗糙度下降9.7%。
肉品加工行业所用商业保鲜剂一般有2 种类型：抑菌型和抗氧化型[9]。抑菌型保鲜剂通过破坏腐败菌细胞壁致其死亡，延缓肉品中尸胺和腐胺的形成以保鲜[10]，如溶菌酶[11]等；抗氧化型保鲜剂则通过竞争氧化或隔绝空气的方式延缓蛋白和脂肪的氧化[12]，如茶多酚[13]等；此外，壳聚糖等天然多糖也可抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等微生物的生长，且易在食品表面成膜维持水分，对感官特性产生积极影响[14]。近几年，AFP因其特殊的抗冻和持水能力，也被用于蔬菜保鲜，Kashyap等[15]发现AFP处理后的青豆滴水损失降低5%，同时有效减少了贮藏中维生素的降解，然而其用于肉品冰温保鲜的研究仍较少。
新疆羊肉因饲喂碱性饲草和饮水，其特殊风味深受消费者喜爱，但本地优质羊肉受制于物流时长难以销往内地，必须开发有效延长货架期的保鲜技术或保鲜剂。本研究提出以羊骨中提取的胶原AFP作为抗冻型保鲜剂，考察其应用于羊肉-4 ℃条件下贮藏时相较传统保鲜剂对新鲜度指标的改善效果，通过综合模型评估处理后羊肉货架期的变化，为AFP在肉品保鲜领域的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
羊骨、羊肉 市购。
胃蛋白酶（＞3 000 U/mg）、碱性蛋白酶（200 U/mg）、溶菌酶、壳聚糖、茶多酚（纯度97%）、杆菌酶、Gly6上海麦克林生化科技股份有限公司；I型胶原蛋白标准品美国Sigma试剂公司；细胞色素c 上海源叶生物科技有限公司；抑肽酶 上海惠诚生物科技有限公司；Gly3坛墨质检科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
DU800紫外-可见分光光度计 美国Beckman Coulter公司；HSC-2差示扫描量热（differential scanning calorimetry，DSC）仪 北京恒久试验设备有限公司；F r e e Z o n e® 2.5 L 冷冻干燥机 美国L a b c o n o c公司；TG-L-1650高速冷冻离心机 四川蜀科仪器有限公司；NR20XE色度仪 深圳三恩时智能科技有限公司；C-LM3嫩度仪 东北农业大学工程学院；pH610 pH计 德国博力飞公司；Heracell 150i CO2培养箱德国Thermo公司；AGQUITY超高效液相色谱（ultraperformance liquid chromatography，UPLC）仪 沃特世科技（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 AFP的制备
将剔除骨髓的羊骨粉碎后，以5 倍体积正己烷抽提脱脂，用5 倍体积0.1 mol/L氢氧化钠溶液除杂蛋白，5 倍体积0.1 mol/L柠檬酸溶液脱钙，0.25 g/100 mL胃蛋白酶酶解48 h，盐析后离心（8 000 r/min、5 min）收集蛋白沉淀，以料液比1∶10（g/mL）溶于0.5 mol/L乙酸溶液，并依次用0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液、0.05 mol/L乙酸溶液和蒸馏水透析，获得胶原蛋白液，冷冻干燥备用。
将胶原蛋白冻干粉用0.05 mol/L乙酸溶液溶解并调至pH 9，用碱性蛋白酶以酶底比260 000 U/g在59 ℃酶解5.6 h，100 ℃灭活5 min后获得酶解液，以自研的冰晶亲和的吸附装置[16]完成AFP分离纯化，获得纯化后AFP。
1.3.2 UPLC表征AFP分子质量
采用UPLC法对样品的肽分子质量分布进行测定。UPLC条件：流动相比例：甲醇、0.1%三氟乙酸溶液体积比30∶70；ACQUITY UPLC Protein BEH SEC色谱柱（4.6 mm×300 mm，1.7 µm），流速0.2 mL/min，进样量10 μL，柱温25 ℃，紫外检测波长220 nm。选用的标准品包括细胞色素c（12 384 Da）、抑肽酶（6 512 Da）、杆菌酶（1 423 Da）、Gly6（360 Da）、Gly3（189.7 Da）。1.5 mL标品（100 μg/mL）和1.5 mL酶解液样品用0.25 μm有机微孔滤膜过滤后进样。
1.3.3 AFP热滞活性（thermal hysteresis activity，THA）和冰晶含量测定
采用DSC法测定AFP的THA和冰晶含量。参照Ding Xiangli等[17]的方法并改进。将样品在5 ℃/min降温速率下冷冻至-50 ℃，再以1 ℃/min的速率升温至10 ℃保持5 min，获得AFP的熔融热（ΔHm/（J/g））和熔点（Tm）。将样品降温至-20 ℃保持5 min，然后以1 ℃/min的速率升温至样品熔融状态，即到达其保留温度（Th/℃），保持3 min，再将温度从Th降至-20 ℃。重复上述过程，在不同Th条件下停留3 min，分别记录不同Th样品的起始结晶温度（To/℃）和结晶热（ΔHr/（kJ/mol）），并分别按式（1）、（2）计算THA和冰晶含量：
1.3.4 AFP对羊肉冰温贮藏期间新鲜度的影响
宰后鲜切羊肉去除筋膜和大块脂肪后，处理为3 cm×3 cm×0.5 cm块状样品，设置对照组为未处理的羊肉样品，实验组为保鲜剂浸泡处理后的羊肉样品，分别为溶菌酶处理组、茶多酚处理组、壳聚糖处理组和AFP（THA＞4 ℃）处理组，各组保鲜剂质量浓度均为2 g/100 mL。所有样品在-4 ℃冰鲜冷藏，并分别在0、5、10、15、20 d取样检测样品新鲜度。选择考察代表品质的剪切力、色度、pH值3 种理化指标，以及代表腐败程度的总挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量和菌落总数。
1.3.4.1 品质理化指标测定
剪切力测定：参考NY/T 1180—2006《肉嫩度测定 剪切力测定法》[18]，将样品80 ℃蒸煮后，顺着肌纤维方向切出3 个2 cm×1 cm×1 cm的肉柱，然后垂直于肌纤维方向进行剪切，用嫩度仪测定剪切力，测定3 次，结果取平均值。
肉色测定：用色差仪测定亮度值（L*）和红度值（a*），在使用前设备用标准白板在室温下进行校正，样品解冻后，选取3 个位点进行测定，结果取平均值。
pH值测定：参考GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》[19]，取10 g羊肉样品加入到100 mL蒸馏水中浸泡30 min，5 000 r/min离心10 min后取上清液测定pH值，测定3 次，结果取平均值。
1.3.4.2 腐败程度指标测定
TVB-N含量测定：参考GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[20]，采用微量滴定法测定TVB-N含量。
菌落总数测定：参考GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[21]，样品置于无菌生理盐水中拍打制成1∶10的菌悬液，稀释至合适倍数，37 ℃培养48 h，记录菌落总数。
1.3.5 基于主成分分析（principal component analysis，PCA）的羊肉新鲜度综合评分模型构建
将获取的6 个羊肉新鲜度指标：剪切力（X1）、L*（X2）、a*（X3）、pH值（X4）、TVB-N含量（X5）、菌落总数（X6）的原始数据进行预处理后，利用SPSS软件进行PCA。
1.3.5.1 原始数据的预处理
为消除量纲差异，将数据指标（X）分类为逆向指标和适度指标，对形成的各指标矩阵X＝{Xij}m×n（其中n为样本个数，m为指标个数，Xij为第i个样本的第j个指标观测值）分别进行预处理。
按式（3）作逆向指标预处理：
式中：X′ij为逆向化之后的值；min（Xij）为指标最小值；max（Xij）为指标最大值。
按式（4）、（5）作适度指标预处理：
式中：a和b分别为最佳区间的最小值和最大值；M为a-min（Xij）和b-max（Xij）中的最大值；X″ij为适度化之后的值；最佳区间为[a，b]（实验过程中得出）。
设有n 个样本、6 项指标，计算相关系数（r），建立相关系数矩阵（R）。
1.3.5.2 羊肉新鲜度综合评分模型构建
利用SPSS软件求矩阵R的特征值和累计贡献率，选取合适的PC，以各PC的方差贡献率为权重，构建羊肉新鲜度综合评分模型[22-23]。
1.4 数据处理
采用Excel软件统计数据，用GraphPad Prism软件作图，利用SPSS Statistics 20.0软件对数据进行显著性分析、相关性分析和PCA。
2 结果与分析
2.1 羊骨AFP的表征
羊骨中获得的是I 型胶原蛋白，分子质量约为330 kDa。如表1所示，分布在180～1 000 Da之间的多肽相对含量最高，达65.01%，其次是大于10 000 Da和小于180 Da的短肽。张靖[24]的研究证实，碱性蛋白酶酶解后的羊骨胶原酶解液中，分子质量小于3 000 Da的肽可以有效清除自由基，具有成为保鲜剂的潜质。酶解液中分子质量小于180 Da的短肽相对含量较高（10.13%），更易转运进入胞内，对细胞内水分的冻结也有抑制作用，因此水解AFP的混合物可能相较于单一重组抗冻蛋白应用于食品保鲜更具优势。
表1 羊骨胶原AFP酶解液的分子质量分布
Table 1 Molecular mass distribution of enzymatic hydrolysate from sheep bone collagen
?
2.2 羊骨AFP的THA和冰晶含量
酶解液中的AFP可以利用其对冰晶的特殊吸附能力得到分离纯化。研究[25]证实，AFP包覆在冰晶表面时，能改变水分子的排列方式，抑制冰晶的生长和重结晶，表现出冰点降低。以THA代替纯度表征天然产物酶解AFP混合物的抗冻活性较为合理。由图1可知，AFP酶解液的THA为3.2 ℃，冰晶含量为19%，而分离纯化后的AFP THA上升到5.2 ℃，冰晶含量下降到11%。已发现的植物中AFP的THA较低，在0.06～0.35 ℃之间[26]，极地地区鱼类体内获取的AFP只需维持到略低于海水的冰点，THA为0.2～0.5 ℃，属于中度活性[27]，而昆虫中分离出的AFP[28]，THA在0.6～6 ℃之间，则归为高THA。本实验分离出的胶原水解AFP经纯化后THA达5.2 ℃，属于高活性的AFP，用于肉品在常规冰点附近贮藏，可以让整个体系维持较低的冰晶含量，且有效抑制贮藏过程中因温度波动发生的重结晶，将对细胞的机械破坏和渗透冲击降至最小。
图1 羊骨胶原蛋白和各级AFP产物THA和冰晶含量
Fig. 1 Thermal hysteresis activity and ice crystal contents of sheep bone collagen and AFP with different molecular masses
2.3 羊肉冰温贮藏过程中不同保鲜剂处理对新鲜度指标的影响
2.3.1 对品质理化指标的影响
羊肉的剪切力是反映其嫩度的指标之一[29]，剪切力越低，肉质越嫩。宰后羊肉在蛋白酶的作用下，肌肉纤维发生溶解松散，pH值呈先降后升趋势[30]，出现酸度极值。保鲜过程即延缓肌肉纤维细胞自溶和推迟酸度极值出现时间的过程。如图2所示，随贮藏时间延长，各组剪切力均呈现下降的趋势，未处理组在第10天剪切力急速下降，出现腐败，溶菌酶处理后的样品剪切力变化最为显著（P＜0.05），推测溶菌酶在贮藏期间对细胞膜和细胞间质产生了非特异性作用，至细胞松散且通透性发生变化[31]。各组样品pH值变化整体趋势符合肉品宰后乳糖积累和消散规律，然而保鲜剂处理后酸度极值出现时间差异明显，胶原AFP处理后酸度极值出现延迟至15 d。溶菌酶、茶多酚处理组贮藏10 d达到最低pH值，AFP、壳聚糖处理组则在15 d达到最低，证明这2 组中尸胺、腐胺等碱性物质的累积得到抑制，延缓了pH值的升高，即AFP可能和壳聚糖一样，对羊肉中微生物的生长有抑制作用，但其抑菌作用机制尚待证实。
图2 －4 ℃贮藏20 d羊肉品质理化指标变化
Fig. 2 Changes in physicochemical indexes of mutton stored at -4 ℃ for up to 20 d
小写字母不同表示相同贮藏时间组间差异显著（P＜0.05）。图3同。
消费者评价肉品新鲜度的主要依据是肉色，通常用L*和a*量化亮度和红度[32]。宰后鲜肉呈现亮红色，L*和a*较大，随后L*会持续下降。L*变化与肉的持水力变化有关，a*则与肌红蛋白氧化程度有关，各组呈现出较大差异。茶多酚处理后的样品，肌红蛋白向高铁肌红蛋白的转化较缓慢[33]，因此该组a*显著高于其他组（P＜0.05），壳聚糖处理后样品水分流失较少[34]，L*显著高于对照组（P＜0.05）。
肉类低温贮藏过程中细胞内外水分迁移显著[35]，冻结时细胞外水首先形成冰晶，改变细胞内外液的渗透平衡，胞内溶质的浓度会上升[36]。在冰温贮藏时，细胞内水分有充足的时间扩散，平衡细胞内外化学势，导致细胞脱水，影响体系的离子强度，导致蛋白质变性[37]。AFP的干预可抑制细胞液中冰晶的生长，保持细胞内外的渗透平衡，进而影响细胞内外化学变化速率。AFP处理后样品的各项指标虽并非所有组中最突出的，但对各项指标都有明显改善。特别是其对肉色等感官的改善较为均衡，可能是由于其对肌肉细胞完整性的保护，能有效阻止细胞内肌红蛋白和血红蛋白外溢而导致的一系列化学反应的发生，即表现为肉色变化延迟。
2.3.2 对腐败程度指标的影响
TVB-N是食品中的蛋白质分解产生的氨和胺类等碱性含氮物，一般随着贮藏时间延长而呈现持续上升趋势[38]。如图3所示，羊肉冰温贮藏过程中各组TVB-N含量均缓慢上升，10 d后对照组羊肉的TVB-N含量显著高于其他组（P＜0.05），保鲜剂处理组与对照组上升速率差异明显。贮藏第15天对照组羊肉的TVB-N含量为23.55 mg/100 g，已超过GB 2707—2016《食品安全国家标准 鲜（冻）畜、禽产品》[39]限值15 mg/100 g，发生腐败。保鲜剂处理组贮藏15 d时各组TVB-N含量仍在15 mg/100 g以下，其中AFP组该指标改善效果最好，TVB-N含量均维持在10 mg/100 g以下。在冰温贮藏下，腐败菌仍在缓慢生长[40]。贮藏期间，各保鲜剂处理组的菌落总数显著低于对照组（P＜0.05），对照组菌落总数从第5天的3.9（lg（CFU/g））升至第20天的5.01（lg（CFU/g）），超出新鲜肉的菌落总数范围（＜4（lg（CFU/g）））[41]，贮藏15 d出现明显的腐败，与TVB-N含量结果一致。在贮藏15 d时，AFP组和壳聚糖组改善效果最好，菌落总数分别为3.90、3.72（lg（CFU/g））。TVN-B含量和菌落总数是表征肉品微生物生长状况的主要指标，常被用作国标检测判断腐败的依据，AFP和壳聚糖处理后均显著改善2 项指标，壳聚糖依靠其成膜能力可以有效阻止菌体内外物质的交换致其死亡[42]，而AFP则通过抑制细胞内容物的溢出，保持细胞内外的渗透平衡，延缓氧化反应发生，有效抑制TVB-N生成。
图3 －4 ℃贮藏20 d羊肉品质腐败程度指标变化
Fig. 3 Changes in quality spoilage indices of mutton during superchilled storage for up to 20 d
各保鲜剂处理组均对羊肉贮藏期新鲜度指标有一定影响，显著优于对照组，但由于作用原理不同，难以依靠单一指标评价保鲜效果。为此设计构建基于PCA的羊肉贮藏期新鲜度评分模型，追踪各组羊肉样品-4 ℃贮藏期间新鲜度评分的变化，评价AFP对羊肉货架期的影响。
2.4 羊肉新鲜度综合评分模型
考察羊肉新鲜度所使用的6 个指标中，剪切力和pH值在贮藏期的变化呈现先降低后升高的趋势，属于适度指标，其余则呈现一致降低的规律变化，属于逆向指标。使用未保鲜干预的羊肉20 d贮藏期内6 个新鲜度指标建立羊肉新鲜度综合评分模型，首先对数据进行标准化，相关系数矩阵如表2所示。各指标之间相关系数的绝对值绝大多数都处在0.279～0.954之间，表明各指标之间具有较高的相关性，进一步对这些指标进行PCA。
表2 羊肉新鲜度指标的相关系数矩阵
Table 2 Correlation coefficient matrix of six freshness indicators
?
利用SPSS软件进行PCA，得到相关系数矩阵的特征值和累计方差贡献率。根据累计方差贡献率达到85%以上和特征值大于1的原则确定PC个数[43]。如表3所示，PC1的方差贡献率为76.036%，PC2的方差贡献率为16.746%，前2 个PC的累计方差贡献率为92.782%，且特征值均大于1，说明前2 个PC包含羊肉这6 个指标的大部分信息，能够代表羊肉新鲜度的基本信息。
表3 相关系数矩阵特征值和累计贡献率
Table 3 Eigenvalues and explained variance of correlation coefficient matrix
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如图4所示，剪切力、L*、a*在PC1正轴方向上有较高载荷，说明PC1主要反映这3 个指标的信息。pH值、TVB-N含量、菌落总数在PC2正轴方向上有较高载荷，说明PC2主要反映这3 个指标的信息。
图4 PCA载荷图
Fig. 4 Loading plot of principal component analysis
由表3中PC的特征值及图4中的载荷求出所提取的2 个PC的特征向量，得出所提取的PC与6 个品质指标之间的关系函数：F1=0.414X1＋0.420X2＋0.438X3-0.286X4-0.452X5-0.416X6、F2=0.381X1＋0.334X2＋0.257X3＋0.732X4＋0.117X5＋0.357X6。以提取的2 个PC的方差贡献率作为权重系数，得到综合评分函数：F=0.760 36F1＋0.167 46F2。
冰温贮藏期各阶段羊肉新鲜度综合评分如表4所示，贮藏初始新鲜度综合评分为1.05左右，随着贮藏时间的延长，综合评分逐渐下降，评分为负则进入腐败阶段，货架期为正值阶段。贮藏第20天，对照组、溶菌酶处理组、茶多酚处理组和壳聚糖处理组羊肉的新鲜度综合评分均为负值，只有AFP组为0.005，即只有AFP处理后羊肉货架期延长到20 d。
表4 不同保鲜剂处理下羊肉在贮藏过程中的新鲜度综合评分
Table 4 Overall scores for mutton freshness during superchilled storage under different preservative treatments
?
未处理的羊肉冰温贮藏5 d综合评分为正，而10 d降至-0.032，即最多贮藏5～10 d。各保鲜剂处理组从第5天之后均明显优于未处理组，从不同指标的角度延缓了羊肉的新鲜度变化。溶菌酶和茶多酚处理组贮藏第10天综合评分为正，15 d分别降至-0.119、-0.001，即可贮藏10～15 d，货架期较未处理组均延长5 d。传统单一型保鲜剂无法在超过10 d后继续有效抑制腐败菌的生长和延缓氧化发生，因为它们无法阻止细胞自溶的进程和冰晶对细胞的破坏。壳聚糖虽是抑菌型保鲜剂，但其极易发生交联成膜，持水性较好，在贮藏过程中无差别地包裹组织细胞和菌株细胞，起到抑菌和一定程度上维持细胞完整性的作用，效果优于溶菌酶和茶多酚，该组贮藏15 d综合评分仍为正，使羊肉货架期延长至15～20 d。AFP处理组的新鲜度指标并非最优，但其最大限度保护了细胞完整性，阻止细胞内外水分的流失，维持细胞内外平衡，减少氧化反应的发生，表现为对各项指标均有较明显的改善，因此综合评分反而优于壳聚糖组，追踪发现该组羊肉贮藏第20天综合评分仍为正，即AFP处理后的羊肉货架期延长至20 d以上。
3 结 论
本研究考察羊骨提取的高THA的胶原AFP作为天然抗冻型保鲜剂应用于羊肉-4 ℃条件下贮藏时，相较传统保鲜剂对新鲜度指标的改善效果。结果证实，AFP的冰晶抑制作用使其在羊肉冰温贮藏中有较好的保鲜潜质，表现出显著延缓了贮藏期肉色变化和酸度极值出现时间，有效抑制了TVB-N类物质的生成和腐败菌生长。通过羊肉贮藏期新鲜度综合评分模型的评定，AFP可使羊肉产品货架期延至20 d以上，较传统保鲜剂优势明显。本研究为AFP在肉品保鲜领域的应用提供了数据支持，同时也为高值化利用羊屠宰副产物提供了新的途径。
[1] KIRAN-YILDIRIM B, GAUKEL V. Thermal hysteresis and bursting rate in sucrose solutions with antifreeze proteins[J]. Chemical Engineering & Technology, 2020, 43(7)： 1383-1392. DOI：10.1002/ceat.201900418.
[2] CAO H, ZHAO Y, ZHU Y B, et al. Antifreeze and cryoprotective activities of ice-binding collagen peptides from pig skin[J].Food Chemistry, 2016, 194： 1245-1253. DOI：10.1016/j.foodchem.2015.08.102.
[3] CAO L, MAJURA J J, LIU L, et al. The cryoprotective activity of tilapia skin collagen hydrolysate and the structure elucidation of its antifreeze peptide[J]. Food Science and Technology, 2023, 179：114670. DOI：10.1016/j.lwt.2023.114670.
[4] CHEN X, SHI X D, CAI X X, et al. Ice-binding proteins： a remarkable ice crystal regulator for frozen foods[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2021, 61(20)： 3436-3449. DOI：10.1080/104083 98.2020.1798354.
[5] CHEN X, CAI X X, WANG X Y, et al. Recent progress and application prospects of antifreeze peptides in food industry[J]. Food Science,2019, 40(17)： 331-337. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20190303-025
[6] DAVIES P L. Ice-binding proteins： a remarkable diversity of structures for stopping and starting ice growth[J]. Trends in Biochemical Sciences, 2014, 39(11)： 548-555. DOI：10.1016/j.tibs.2014.09.005.
[7] LIU M, LIANG Y, WANG Y N, et al. Effects of recombinant carrot antifreeze protein from Pichia pastoris GS115 on the physicochemical properties of hydrated gluten during freeze-thawed cycles[J]. Journal of Cereal Science, 2018, 83： 245-251. DOI：10.1016/j.jcs.2018.08.016.
[8] LI F F, DU X, REN Y M, et al. Impact of ice structuring protein on myofibrillar protein aggregation behaviour and structural property of quick-frozen patty during frozen storage[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2021, 178(1)： 136-142. DOI：10.1016/j.ijbiomac.2021.02.158.
[9] 王婧. 预包装烤鱼贮藏期间品质变化规律与保鲜剂研发[D]. 重庆：重庆三峡学院, 2024. DOI：10.27883/d.cnki.gcqsx.2024.000045.
[10] GEESINK G H, MORTON J D, KENT M P, et al. Partial purification and characterization of chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha)calpains and an evaluation of their role in postmortem proteolysis[J].Journal of Food Science, 2000, 65(8)： 1318-1324. DOI：10.1111/j.1365-2621.2000.tb10605.x.
[11] JAHIT I S, NAZMI N N M, SARBON N M, et al. Preparation and physical properties of gelatin/CMC/chitosan composite films as affected by drying temperature[J]. International Food Research Journal, 2016, 23(3)： 1068-1074.
[12] TIAN Y, LI D M, LUO W H, et al. Rapid freezing using atomized liquid nitrogen spray followed by frozen storage below glass transition temperature for Cordyceps sinensis preservation： quality attributes and storage stability[J]. Food Science and Technology, 2020, 123： 109066.DOI：10.1016/j.lwt.2020.109066.
[13] FAN W J, CHEN Y C, SUN J X, et al. Effects of tea polyphenol on quality and shelf life of pork sausages[J]. Food Science Technology,2014, 51(1)： 191-195. DOI：10.1007/s13197-013-1076-x.
[14] FAN W J, SUN J X, CHEN Y C, et al. Effects of chitosan coating on quality and shelf life of silver carp during frozen storage[J]. Food Chemistry, 2009, 115(1)： 66-70. DOI：10.1016/j.foodchem.2008.11.060.
[15] KASHYAP P, KUMAR S J, SING D, et al. Performance of antifreeze protein HrCHI4 from Hippophae rhamnoides in improving the structure and freshness of green beans upon cryopreservation[J]. Food Chemistry, 2020, 320： 126599. DOI：10.1016/j.foodchem.2020.126599.
[16] 左晓佳, 郑文新, 高维明, 等. 一种胶原抗冻多肽的分离装置：CN111592593B[P]. 2023-11-28.
[17] DING X L, ZHANG H, LIU W H, et al. Extraction of carrot (Daucus carota) antifreeze proteins and evaluation of their effects on frozen white salted noodles[J]. Food and Bioprocess Technology, 2014, 7(3)：842-852. DOI：10.1007/s11947-013-1101-0.
[18] 农业部. 肉嫩度测定 剪切力测定法： NY/T 1180—2006[S]. 北京： 中国标准出版社, 2006.
[19] 国家卫生和计划生育委员会. 食品安全国家标准 食品pH值的测定：GB 5009.237—2016[S]. 北京： 中国标准出版社, 2016.
[20] 国家卫生和计划生育委员会. 食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定： GB 5009.228—2016[S]. 北京： 中国标准出版社, 2016.
[21] 国家卫生健康委员会, 国家市场监督管理总局. 食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数测定： GB 4789.2—2022[S]. 北京： 中国标准出版社, 2022.
[22] 王珊珊, 张萍, 张冰冰, 等. 寒地沙棘种质资源果实品质分析与综合评价[J]. 农业工程学报, 2023, 39(13)： 281-289. DOI：10.11975/j.issn.1002-6819.202303150.
[23] 隋勇, 施建斌, 蔡沙, 等. 基于主成分与聚类分析的不同粉路小麦次粉品质综合评价[J]. 现代食品科技, 2022, 38(2)： 164-171; 244.DOI：10.13982/j.mfst.1673-9078.2022.2.0284.
[24] 张靖. 羊骨多肽的制备及其抗氧化能力研究[D]. 呼和浩特： 内蒙古农业大学, 2021. DOI：10.27229/d.cnki.gnmnu.2021.000763.
[25] LOPEZ ORTIZ J I, QUIROGA E, NARAMBUENA C F, et al.Thermal hysteresis activity of antifreeze proteins： a model based on fractional statistics theory of adsorption[J]. Physica A： Statistical Mechanics and Its Applications, 2021, 575： 126046. DOI：10.1016/j.physa.2021.126046.
[26] WISNIEWSKI M, WEBB R, BALSAMO R, et al. Purification,immunolocalization, cryoprotective, and antifreeze activity of PCA60：a dehydrin from peach (Prunus persica)[J]. Physiologia Plantarum,2010, 105(4)： 600-608. DOI：10.1034/j.1399-3054.1999.105402.x.
[27] WU Y L, BANOUB J, GODDARD S V, et al. Antifreeze glycoproteins：relationship between molecular weight, thermal hysteresis and the inhibition of leakage from liposomes during thermotropic phase transition[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B：Biochemistry and Molecular Biology, 2001, 128(2)： 265-273.DOI：10.1016/S1096-4959(00)00323-7.
[28] DUMAN J G, BENNETT V, SFORMO T, et al. Antifreeze proteins in Alaskan insects and spiders[J]. Journal of Insect Physiology, 2004,50(4)： 259-266. DOI：10.1016/j.jinsphys.2003.12.003.
[29] 路彤, 李震, 徐幸莲, 等. 冻融对木质化鸡胸肉品质的影响[J]. 肉类研究, 2021, 35(10)： 54-61. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210618-175.
[30] 王薇, 罗瑞明, 李俊丽, 等. 不同贮藏温度下滩羊肉的保水性与色泽变化特性[J]. 食品与机械, 2015, 31(3)： 140-144. DOI：10.13652/j.issn.1003-5788.2015.03.033.
[31] CEGIELSKARADZIEJEWSKA R, SZABLEWSKI T. The effect of modified lysozyme treatment on the microflora, physicochemical and sensory characteristics of pork packaged in preservative gas atmospheres[J]. Coatings, 2021, 11(5)： 488. DOI：10.3390/coatings11050488.
[32] MANCINI R A, SUMAN S P, KONDA M K R, et al. Effect of carbon monoxide packaging and lactate enhancement on the color stability of beef steaks stored at 1 ℃ for 9 days[J]. Meat Science, 2009, 81(1)： 71-76. DOI：10.1016/j.meatsci.2008.06.021.
[33] 杨洪刚, 周垚卿, 张忠. 茶多酚对猪肉色泽稳定性的影响研究[J].食品与发酵科技, 2022, 58(2)： 47-51; 66.
[34] 吴瑞琛, 韩丽娟, 马娜娜, 等. 不同保鲜剂对藏羊肉煮制品品质的影响[J]. 食品与发酵工业, 2024, 50(22)： 214-225. DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.037913.
[35] LI D M, ZHU Z W, SUN D W, et al. Effects of freezing on cell structure of fresh cellular food materials： a review[J]. Trends in Food Science & Technology, 2018, 75： 46-55. DOI：10.1016/j.tifs.2018.02.019.
[36] FELLOWS P J. 22： freezing[M]//FELLOWS P J. Food processing technology. Cambridge： Woodhead Publishing, 2017： 885-928.DOI：10.1016/B978-0-08-100522-4.00022-5.
[37] DALVI-ISFAHAN M, JHA P K, TAVAKOLI J, et al. Review on identification, underlying mechanisms and evaluation of freezing damage[J]. Journal of Food Engineering, 2019, 255： 50-60.DOI：10.1016/j.jfoodeng.2019.03.011.
[38] CAI L Y, WANG Q J, DONG Z J, et al. Biochemical, nutritional, and sensory quality of the low salt fermented shrimp paste[J]. Journal of Aquatic Food Product Technology, 2017, 26(6)： 706-718. DOI：10.108 0/10498850.2016.1276111.
[39] 国家卫生和计划生育委员会, 国家食品药品监督管理总局. 食品安全国家标准 鲜(冻)畜、禽产品： GB 2707—2016[S]. 北京： 中国标准出版社, 2016.
[40] MILLS J, DONNISON A, BRIGHTWELL G, et al. Factors affecting microbial spoilage and shelf-life of chilled vacuum-packed lamb transported to distant markets： a review[J]. Meat Science, 2014, 98(1)：71-80. DOI：10.1016/j.meatsci.2014.05.002.
[41] DUUN A S, HEMMINGSEN A K T, HAUGLAND A, et al. Quality changes during super-chilled storage of pork roast[J]. LWT-Food Science and Technology, 2008, 41(10)： 2136-2143. DOI：10.1016/j.lwt.2008.02.001.
[42] 付丽, 胡晓波, 吴丽, 等. 天然保鲜剂的配比优化及其对牛肉保鲜效果的影响[J]. 现代食品科技, 2018, 34(6)： 204-211; 187.DOI：10.13982/j.mfst.1673-9078.2018.6.028.
[43] 彭小丽. 不同温度处理对绵羊肉中挥发性成分的影响[D]. 石河子：石河子大学, 2014.