黑粒小麦作为特殊小麦种质资源，不仅具有含量极高的蛋白质、钙、铁、锌、硒、氨基酸和维生素等营养元素，且富含大量花青素[1]。花青素是一种存在于植物体内的水溶性黄酮类化合物，多以糖苷键与糖类物质结合形成的花色苷存在[2]，具有抗氧化、抗癌、抗疲劳等多种生理功能[3-5]。该色素作为天然可食用植物色素，安全无毒，有很高开发利用价值[6-7]。戴妙妙[5]、张海霞[8]、董雨荷[9]等分别在紫娟茶、紫马铃薯、黑果枸杞中发现花青素对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌效果。此外，前人对果蔬花青素抑菌性也进行了大量研究[10-11]，而对于粮食作物，尤其是黑粒小麦花青素抑菌性研究报道相对较少。
冷却肉指活畜被宰杀后24 h内将肉温度降低到0～4 ℃，并在后续加工、流通、销售等环节温度均保持恒定[12]。与热鲜肉和冷冻肉相比，该肉在加工过程中经过排酸、解僵、成熟3 个阶段，不仅肉质细腻美味、易消化，且更安全卫生[13]。但0～4 ℃只会在短时间内抑制肉内部微生物活动，贮藏时间一旦过长，肉质变色，腐败加速，货架期随之缩短[14]。如何延长货架期，保证冷却肉的商品价值成为科研人员和企业的关注焦点。
适宜的保鲜剂可有效抑制微生物滋生，保护肉的颜色、质地和风味。根据保鲜剂的来源可分为化学保鲜剂和天然保鲜剂2 种。化学保鲜剂杀菌效果虽好，但长期使用会对人体产生危害，而天然保鲜剂来源于植物，具有微量、高效的特点，成为科研人员研究的新热点[14]。常用的天然保鲜剂有茶多酚、苹果多酚、乳酸链球菌素、溶酶菌及植物提取物等[15-19]。目前，用于冷却肉保鲜的天然提取物研究大多集中在草药、茶叶及蔬菜方面，且以多酚研究为主[14,16-18]，花青素在冷却肉保鲜方面的研究相对较少，而关于粮食作物——黑粒小麦花青素保鲜效果的研究鲜有报道。本研究以黑粒小麦为原料，研究其籽粒中花青素的抑菌性和对冷却肉的保鲜效果，以期为黑粒小麦花青素作为生物抑菌剂和保鲜剂的开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑粒小麦由山西农业大学农学院提供；鲜猪肉购于吕梁市离石区，冰袋保存，0.5 h内运回实验室，4 ℃冷藏备用。
Luria-Bertani（LB）培养基、三氯乙酸、乙二胺四乙酸、2-硫代巴比妥酸、氧化镁、醋酸铅、对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸（均为分析纯） 西陇科学股份有限公司。
1.2 仪器与设备
RGX-350生化培养箱、DZKW-4电热恒温水浴锅北京中兴伟业世纪仪器有限公司；HC-2518R高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；SW-CJ-ID超净工作台 天津科赛特实验室设备有限公司；WSC-2B色差计 上海懿尚生物科技有限公司；PHS-3E酸度计 上海佑科仪器仪表有限公司；L6S紫外-可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；LC-JLQ-1C菌落计数器 湖南力辰仪器科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 花青素提取
首先用自来水对黑粒小麦进行冲洗，后用蒸馏水冲洗，干燥至恒质量后用磨粉机磨成粉末。参照张海霞等[8]的方法并稍作修改，称取0.2 g黑粒小麦粉置于圆底蒸馏烧瓶，加入4 mL 50%乙醇混匀，3 500 r/min离心10 min，弃上清液，重复1 次。向残渣中加入2 mL体积分数5%盐酸溶液，置于60 ℃恒温水浴锅中加热1 h，冷却后，4 ℃、3 500 r/min离心10 min，保留滤液，按上述方法重复加热提取1 次，合并2 次滤液，定容至10 mL。将上述提取液倒入培养皿中，置于真空冷冻干燥机-40 ℃冷冻干燥12 h，得到花青素提取物，配制成质量浓度分别为50、40、30、20、10、5 mg/mL的花青素溶液待用。
1.3.2 抑菌实验
1.3.2.1 菌悬液的制备
将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌转移到LB固体培养基上37 ℃孵育24～36 h以活化菌株，然后将活化的菌株分别接种到LB液态培养基中，并在（25±2）℃恒定温度下振荡培养10～24 h。最后调节各菌悬液至105 CFU/mL，以备后续使用。
1.3.2.2 花青素抑菌性评估
将0.1 mL菌悬液均匀接种于LB培养基平板上。将已灭菌处理的一次性抑菌片（直径6 mm）依次放入不同质量浓度（50、40、30、20、10、5、0 mg/mL）的黑粒小麦花青素溶液中，浸泡20 min后轻轻沥去多余液体，将其平铺于前述的接种平板上。随后倒置于37 ℃恒温培养箱中孵育24 h。孵育结束后，通过测量各处理组产生的抑菌圈直径，对黑粒小麦花青素的抑菌能力进行评估。
1.3.2.3 最小抑菌质量浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）测定
采用二倍稀释法，首先配制质量浓度分别为40、20、10、5、2.5、1.25 mg/mL黑粒小麦花青素水溶液，将灭菌后的抑菌片放入其中浸泡20 min，沥干，放置于培养板上（25±2）℃恒温培养，测定抑菌圈直径。黑粒小麦花青素的MIC为无抑菌圈出现的质量浓度。
1.3.2.4 花青素与保鲜剂单独和混合使用的抑菌效果对比
对羟基苯甲酸乙酯和山梨酸是常用的食品添加剂，因此采用对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸和花青素作为抑菌效果对比实验的保鲜剂。将抑菌片分别浸泡于40 mg/mL黑粒小麦花青素溶液、2 μg/mL对羟基苯甲酸乙酯溶液、5 μg/mL山梨酸溶液、体积比为1∶1的40 mg/mL黑粒小麦花青素溶液+2 μg/mL对羟基苯甲酸乙酯溶液、体积比为1∶1的40 mg/mL黑粒小麦花青素溶液+5 μg/mL山梨酸溶液中20 min，沥干后放置于培养板上（25±2）℃恒温培养，通过抑菌圈直径判断抑菌差异性。
1.3.3 冷却猪肉保鲜实验
1.3.3.1 肉样处理
将新鲜猪肉在洁净消毒的案板上除去筋膜和多余的脂肪，将瘦肉切分为60 g左右的肉块（高约2 cm）。随机分为4 组，每组10 块。将处理好的4 组肉块分别用无菌蒸馏水（对照组）、40 mg/mL花青素、40 mg/mL花青素+5 μg/mL山梨酸、5 μg/mL山梨酸浸泡15 min，准确称质量，浅盘包装，并用保鲜膜覆盖，放入4 ℃冰箱中冷藏备用。对冷藏的4 组肉样，分别在初始（浅盘包装2 h）、冷藏3、6、9 d时进行色差值、持水力、pH值、硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值、总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、产H2S能力及菌落总数等指标的测定。每个实验重复3 次，结果以平均值±标准差表示。
1.3.3.2 指标测定
采用色差计测定肉样的亮度值（L*）和红度值（a*）；持水力测定、H2S实验、TBARS值测定参照尹爱武等[20]的方法进行；pH值测定参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》；TVB-N含量测定参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[21]；菌落总数测定方法：取3g冷却肉，用无菌剪刀剪碎后置于27 mL无菌生理盐水（0.9%，m/m）中，振摇30 min后取1 mL上清液进行加倍递增稀释，经LB肉汤培养基（250 mL LB，5 g琼脂）-平板倾注计数法，37 ℃有氧培养2 d后计数，评价标准为新鲜肉菌落总数＜4（lg（CFU/g）），次鲜肉4～6（lg（CFU/g）），变质肉＞7（lg（CFU/g））。
1.4 数据处理
采用Excel软件进行数据整理，Origin 2020软件进行绘图，用SAS9.1.3统计分析软件的ANOVA过程进行方差分析，采用Duncan新复极差法进行显著性检验（P＜0.05）。
2 结果与分析
2.1 黑粒小麦花青素对供试菌的抑菌性
2.1.1 黑粒小麦花青素对不同供试菌的抑菌效果及MIC
由表1可知，黑粒小麦花青素对3 种供试菌均具有一定的抑制作用，且随着花青素质量浓度的增加，抑菌圈直径逐渐扩大，抑菌效果出现显著差异（P＜0.05）。3 种菌在花青素质量浓度为50 mg/mL时，抑制效果表现为金黄色葡萄球菌＞枯草芽孢杆菌＞大肠杆菌，其他花青素质量浓度下，枯草芽孢杆菌和大肠杆菌无显著差异。大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在花青素质量浓度为10、20 mg/mL之间抑菌效果均不显著，直到高质量浓度（50 mg/mL）才出现显著的抑菌效果，但抑菌圈直径均未达到10 mm，而金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径在最高花青素质量浓度时可达到11.52 mm。为筛选花青素对3 种菌的MIC，对抑菌质量浓度进行二倍稀释，发现黑粒小麦花青素对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC分别为10、5、1.25 mg/mL（表2）。在花青素质量浓度为40 mg/mL时，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径仅为8.09、8.97 mm，显著小于金黄色葡萄球菌（P＜0.05），且两者抑菌圈直径均小于10 mm，说明黑粒小麦籽粒花青素对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的生长均有影响，但作用效果不及对金黄色葡萄球菌的影响。
表1 不同质量浓度黑粒小麦花青素对供试菌的抑菌作用
Table 1 Antibacterial effect of black-grained wheat anthocyanins at different concentrations on the tested bacteria
注：—.无抑菌圈出现；同行大写字母不同表示同一质量浓度下不同供试菌之间差异显著（P＜0.05）；同列小写字母不同表示同一供试菌不同质量浓度之间差异显著（P＜0.05）。表2同。
花青素质量浓度/（mg/mL）供试菌抑菌圈直径/mm大肠杆菌金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌0——106.22±0.09Bc8.14±0.24Ac6.91±0.11ABc 206.92±0.07Bbc8.96±0.23Ac7.54±0.30Bbc 307.49±0.09Bb9.98±0.14Abc8.01±0.18Bb 408.09±0.17Bab10.56±0.09Ab8.97±0.17Bab 508.57±0.12Ca11.52±0.23Aa9.70±0.22Ba
表2 黑粒小麦花青素对供试菌的MIC
Table 2 MIC of black-grained wheat anthocyanins solution on the tested bacteria
花青素质量浓度/（mg/mL）供试菌抑菌圈直径/mm大肠杆菌金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌0——1.25—6.14±0.08c—2.5—6.43±0.17c—5—6.67±0.17Ac6.19±0.15Ac 106.22±0.09Bb8.14±0.24Ab6.91±0.11Bb 206.92±0.07Ba8.96±0.23Ab7.54±0.30Bab 408.09±0.17Ba10.56±0.09Aa8.97±0.17Ba
2.1.2 黑粒小麦花青素与对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸单独和混合使用的抑菌效果比较
黑粒小麦花青素、对羟基苯甲酸乙酯和山梨酸对3 种供试菌均有一定的抑制作用（表3）。当花青素分别与对羟基苯甲酸乙酯和山梨酸混合使用时，3 种供试菌抑菌圈直径均显著大于用单一保鲜剂处理的抑菌圈直径（P＜0.05），表明在任一食品添加剂（对羟基苯甲酸乙酯和山梨酸）使用中添加一定剂量的花青素有助于增强其抑菌效果。3 种供试菌中金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径最大，可达到25.14 mm，其次为枯草芽孢杆菌，最后为大肠杆菌。5 个保鲜处理组中以花青素+山梨酸混合组的抑菌效果最为显著。故在后续保鲜实验中，选用山梨酸和花青素进行比较分析。
表3 黑粒小麦花青素与对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸单独和混合使用抑菌效果比较
Table 3 Comparison of antibacterial effects of black-grained wheat anthocyanins, ethylparaben, and sorbic acid alone and in combination
注：同行大写字母不同表示同一保鲜剂处理下不同供试菌之间差异显著（P＜0.05）；同列小写字母不同表示同一供试菌不同保鲜剂处理之间差异显著（P＜0.05）。
保鲜剂供试菌抑菌圈直径/mm大肠杆菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌花青素8.09±0.17Bc10.56±0.09Ae8.97±0.17Bc对羟基苯甲酸乙酯10.26±0.11Cb15.58±0.21Ad13.19±0.15Bb山梨酸11.79±0.18Cb17.58±0.42Ac14.53±0.61Bb花青素+对羟基苯甲酸乙酯13.72±0.23Ca22.96±0.41Ab21.54±0.32Ba花青素+山梨酸14.22±0.29Ca25.14±0.28Aa22.25±0.51Ba
2.2 黑粒小麦花青素对冷却猪肉保鲜效果
2.2.1 黑粒小麦花青素对冷却猪肉色差的影响
L*和a*是评价猪肉新鲜度和与品质变化的重要感官指标[22]。在猪肉冷藏过程中微生物的污染与脂肪氧化会导致肉的L*和a*发生不同程度的改变。由图1可知，随着猪肉贮藏时间的延长，4 个处理下的猪肉L*和a*均显著降低（P＜0.05）。同一贮藏时间内，相较于对照组，保鲜剂处理组的L*和a*均显著提高（P＜0.05）。在贮藏3、6、9 d后，花青素组和山梨酸组间L*无显著差异，而a*在贮藏6 d后则表现为山梨酸组＞花青素组。随着贮藏时间的延长，4 个保鲜剂处理中L*和a*均以花青素+山梨酸组的值最大。
图1 不同处理对冷却猪肉色差的影响
Fig.1 Effect of different treatments on color parameters of chilled pork
大写字母不同表示同一保鲜剂处理下不同贮藏时间之间差异显著（P＜0.05）；小写字母不同表示同一贮藏时间不同保鲜剂处理之间差异显著（P＜0.05）。图2～5同。
2.2.2 黑粒小麦花青素对冷却猪肉持水力、pH值的影响
如图2所示，随着贮藏时间的延长，4 个处理组猪肉持水力均呈现显著降低趋势（P＜0.05），可能是由于贮藏时间的延长使猪肉内的细菌快速繁殖，导致其肌肉组织遭到破坏[23]。与对照组相比，保鲜剂处理组具有明显的抑菌效应，可能是通过有效抑制其肌肉组织膜脂氧化，降低膜透性，减少了水分的流失。贮藏9 d时，花青素+山梨酸组的持水力显著高于其他3 个处理组（P＜0.05），而山梨酸组略高于花青素组，对照组则失水最为严重。
图2 不同处理对冷却猪肉持水力及pH值的影响
Fig.2 Effect of different treatments on the water retention capacity and pH of chilled pork
肉类pH值评定标准为鲜肉pH 5.8～6.6，pH 6.7以上为变质肉。随着贮藏时间的延长，各处理组pH值均呈现整体上升趋势，原因可能是冷却猪肉在贮藏过程中，部分蛋白类物质会在微生物的作用下分解产生碱性物质[24]。贮藏6、9 d时，各保鲜处理组猪肉pH值均显著低于对照组（P＜0.05），其中花青素+山梨酸组pH值升高最为缓慢，说明保鲜剂配合花青素对冷却肉具有较强的抑菌和保鲜效果；对照组在贮藏第6天时，pH值升至6.75，已明显属于变质肉，而保鲜处理组直至贮藏第9天，花青素组和山梨酸组pH值才达到6.7，而花青素+山梨酸组尽管未达到变质肉界限，但pH值已接近6.7。说明保鲜剂和花青素结合起到了一定的保鲜效果。
2.2.3 黑粒小麦花青素对冷却猪肉TBARS值的影响
冷却肉中不饱和脂肪酸被氧化分解后产生的丙二醛与硫代巴比妥酸反应生成物含量用TBARS值表示，其大小反映脂肪氧化产物的量[25]。如图3所示，随着猪肉贮藏时间的延长，所有保鲜剂处理组TBARS值显著低于对照组（P＜0.05），保鲜效果依次为花青素+山梨酸＞山梨酸＞花青素＞蒸馏水。冷藏第9天，花青素+山梨酸组与山梨酸组出现显著差异（P＜0.05），表明黑粒小麦花青素可以在一定程度上抑制脂肪酸的氧化，但花青素+山梨酸混合使用效果会更好。
图3 不同处理对冷却猪肉TBARS值的影响
Fig.3 Effect of different treatments on the TBARS value of chilled pork
2.2.4 黑粒小麦花青素对冷却猪肉TVB-N含量的影响
TVB-N含量被用来表征肉制品鲜度的变化及蛋白质的分解程度[26]。如图4所示，TVB-N含量随着冷藏时间的延长逐渐升高，且贮藏第9天，部分保鲜处理组的TVB-N含量已经超出国家鲜肉标准GB 2707—2016《食品安全国家标准 鲜（冻）畜、禽产品》中规定的15 mg/100 g。冷藏第1天，对照组与保鲜处理组无显著差异；冷藏第3天，对照组TVB-N含量显著高于保鲜处理组（P＜0.05），花青素组与山梨酸组无显著差异，花青素+山梨酸组TVB-N含量最低；冷藏第6天，对照组TVB-N含量已经达到15.56 mg/100 g，处理组之间则出现显著差异（P＜0.05），山梨酸效果略优于花青素；直到冷藏第9天，花青素组TVB-N含量也超出了国家鲜肉标准，原因可能是保鲜实验选用的黑粒小麦花青素量偏少，所以其保鲜效果略差于山梨酸组和花青素+山梨酸组。总体来看，添加一定量的黑粒小麦花青素能够抑制冷却肉中相关酶活性和微生物的繁殖，从而降低TVB-N含量，以此达到延长货架期的效果。
图4 黑粒小麦花青素对冷却猪肉TVB-N含量的影响
Fig.4 Effect of black-grained wheat anthocyanins on the TVB-N content of chilled pork
2.2.5 黑粒小麦花青素对冷却猪肉产H2S能力的影响
如表4所示，对照组从第3天开始呈阳性，花青素组和山梨酸组从第6天开始呈阳性，而花青素+山梨酸组呈现阳性的时间延长，表明若在保鲜剂中另外添加一定剂量的黑粒小麦花青素，可有效延缓冷却肉的腐败。
表4 不同处理对冷却猪肉产H2S能力的影响
Table 4 Effect of different treatments on the H2S production of chilled pork
注：-.阴性；+.阳性。
组别贮藏时间/d 0 3 6 9对照-+++花青素--++花青素+山梨酸---+山梨酸--++
2.2.6 黑粒小麦花青素对冷却猪肉菌落总数的影响
如图5所示，在冷藏9 d内，保鲜处理组的菌落总数差异不大，对照组的菌落总数在贮藏第6天迅速增加，贮藏第9天对照组的菌落总数为11.92（lg（CFU/g）），猪肉属变质肉。贮藏6、9 d时，花青素+山梨酸组菌落总数显著低于其他保鲜处理组（P＜0.05），表明在保鲜剂使用时适当添加花青素能有效抑制猪肉冷藏过程中的细菌繁殖。这可能是由于花青素的强抗氧化特性影响细菌的代谢反应[27]，能抑制微生物生长。
图5 不同处理对冷却猪肉菌落总数的影响
Fig.5 Effect of different treatments on the total bacterial count of chilled pork
3 讨 论
随着社会经济的发展和人们生活水平的提高，消费者对于食品安全的关注也达到了前所未有的高度。在众多食品保鲜技术中，冷链物流因其能够有效延长食品的保质期而备受青睐。特别是在冷却肉等易腐食品的保鲜过程中，安全、可靠且无毒性的天然防腐剂逐渐被行业内广泛认可。花青素作为一种优良的天然色素，相较于其他化学保鲜防腐剂不仅天然、安全，而且资源丰富、成本较低，将花青素应用于食品保鲜已成为国内外的研究热点[11,28-30]。已有研究表明，花青素对多种细菌具有抑制作用。例如，胡萝卜花青素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌作用较大[31]；胭脂萝卜花青素能显著抑制枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、白色念珠菌的生长[32]；蓝莓果渣花青素在不同pH值和温度下显示出较强的体外抗氧化活性及抑菌性[11]；紫苏叶花青素对大肠杆菌具有较好的抑制作用，MIC为1.25 mg/mL[33]。本研究结果得出黑粒小麦花青素可以抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的生长，且对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好，枯草芽孢杆菌次之；而对大肠杆菌只有在花青素质量浓度达到一定值时才会产生抑制作用。对3 种供试菌的MIC依次为1.25、5、10 mg/mL，这种抑菌作用主要归因于花青素能够破坏细菌细胞膜的完整性，干扰其代谢过程，从而抑制细菌的生长和繁殖。与前人的研究结果相比，本研究结果不论是在菌种抑制方面还是抑菌质量浓度方面均有差异，可能是选用材料、提取方法及使用浓度等差异造成的。将黑粒小麦花青素与山梨酸结合使用后发现抑菌效果增强，说明将从黑粒小麦中提取到的花青素与化学抑菌剂配合使用可降低化学药剂使用剂量，应用于食药行业中。
猪肉在我国肉类消费中占有很大的比例，它不仅能为人体提供优质的蛋白、脂肪、无机盐及维生素，还具有吸收率高、耐饥饿、适口性好、适合烹饪等特点。然而，新鲜猪肉易因病原微生物的存在引发食源性疾病，从而限制其贮藏时间。腐败是一种代谢过程，在某些情况下，变质的猪肉可能仍然安全，不会引起疾病，但其质地、味道、气味和外观的变化会导致消费者拒绝食用。因此，需重视猪肉保鲜。保鲜原理是减少水分的流失，控制温度，以及使用防腐剂和竞争性微生物[34-35]。黑粒小麦花青素对冷却猪肉具有一定保鲜效果。用40 mg/mL黑粒小麦花青素+5 μg/mL山梨酸混合液处理后，冷却猪肉的pH值、TBARS值、TVB-N含量和菌落总数均随着时间延长的增加幅度较小，持水力和色泽相较于对照组更好。保鲜效果依次为花青素+山梨酸＞山梨酸＞花青素＞水。说明黑粒小麦花青素可以在一定程度上通过控制猪肉水分流失抑制腐败菌的生长繁殖及脂肪氧化，实现延长冷却肉货架期的目的，但若与山梨酸联合使用则效果更佳。相较于化学保鲜剂，花青素具有天然、安全、无毒的优势，二者联合使用可为新型环保生物保鲜剂的开发提供一种新的思路。
4 结 论
研究结果表明，黑粒小麦花青素对多种细菌具有抑制作用，并能有效控制冷却猪肉的持水力，抑制其TBARS值、TVB-N含量和菌落总数的增长，使其保持良好的色泽，延长冷却猪肉的货架期。综合分析，40 mg/mL黑粒小麦花青素+5 μg/mL山梨酸混合液对冷却猪肉的保鲜效果最好，理论上能将冷却肉的货架期延长至9 d左右。
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