蟠龙菜，又称盘龙菜、卷切，俗名剁菜，是湖北钟祥经典名菜之一，主要原料包括猪肉、鱼肉、鸡蛋、大葱、生姜等，具有色泽鲜艳、肥而不腻、肉滑油润等特点，迄今已有约500 年的食用历史[1-2]。随着我国肉制品生产和消费的不断发展，蟠龙菜近年来也进入肉品生产领域。随着生活水平的提高，人们对肉制品的消费需求和品质要求不断提升。脂质和蛋白质氧化变质、微生物的生长繁殖是导致肉制品品质下降的主要原因[3]。影响肉制品贮藏过程中品质的因素主要包括贮藏条件、氧气含量、pH值、包装材料及组成成分等，产品的腐败表现为产生黏液、褪色、变味等[4-5]。国内外学者对西式低温火腿[6]、法兰克福香肠[7]和腌肉切片[8]等肉制品在贮藏过程中的理化性质和微生物指标的变化规律进行了研究，这对相关肉制品贮藏期间的品质控制具有一定的指导意义。然而，蟠龙菜因主辅料种类繁多且制作工艺复杂而区别于一般肉制品，在生产过程中受到污染和在贮藏过程中氧化的风险较高。
添加保鲜剂是通过抑制食品中腐败菌生长和控制氧化过程，从而保证产品品质的常用方法，但随着人们对健康饮食的广泛认知和普遍接受，近年来，使用天然保鲜剂代替合成保鲜剂成为研究和应用的热点。因此，天然保鲜剂对肉制品腐败菌抑制作用的相关研究也逐步增多[9-11]。ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）复配抑菌剂应用于肉制品的防腐保鲜，有延长保质期和提升口感的双重优势[12]。茶多酚和溶菌酶作为安全性较高的抑菌剂，在抑制肉制品细菌生长、维持肉制品品质等方面具有显著效果[13]。李德红[14]研究得出，0.05 g/kg ε-PL、0.2 g/kg乳酸链球菌素（nisin）和0.12 g/kg茶多酚复配能有效抑制气调包装酱鸭食管中的优势腐败菌。戴增辉等[15]研究表明，生物保鲜剂处理后的植物基人造肉的贮藏期和品质较未处理的试样均有明显提升，并且1%壳聚糖和0.20～0.36% ε-PL处理能明显抑制微生物的生长。迷迭香提取物和香芹酚也能有效延缓肉制品的氧化变质进程[16-17]。但不同产品的原料组成及最适贮藏条件各不相同，要达到更好的保鲜效果，需要选择与之适配的保鲜剂。目前，蟠龙菜贮藏特性及针对性抑菌研究鲜见报道。本研究探究添加不同保鲜剂对蟠龙菜菌落总数、理化、感官和风味等贮藏指标的差异及变化规律，据此针对性制订产品货架期延长策略及降低产品安全性风险对蟠龙菜产品来说具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
猪肉、草鱼、大葱、生姜、鸡蛋、马铃薯淀粉、食盐、味精 湖北省荆门市东宝区荆楚理工学院南门超市；迷迭香提取物（鼠尾草酸质量分数≥10%，鼠尾草酚质量分数≥10%）、Nisin（效价≥900 IU/mg）深圳市佳禾旭日商贸有限公司；茶多酚（多酚质量分数≥98%）、ε-PL（纯度≥95%） 山东齐鲁生物科技集团有限公司；香芹酚（纯度99%） 上海麦克林生化科技股份有限公司；PCA培养基 青岛海博生物技术有限公司；1,1,3,3-四乙氧基丙烷标准品 德国Sigma公司；硫代巴比妥酸、乙二胺四乙酸二钠、氯化钾、氯化钠、氧化镁、硼酸、三氯甲烷、盐酸、95%乙醇、石油醚、硫代硫酸钠、亚铁氰化钾、冰乙酸、碘化钾、无水硫酸钠、可溶性淀粉、甲基红指示剂、溴甲酚绿指示剂 国药集团化学试剂有限公司；所有分离用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
KQ3200DE型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；PEN3型电子鼻 德国Airsence公司；PHSJ-3F型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；FJ-200S型高速分散均质机 江苏金坛金城国胜实验仪器厂；DW-86L626型立式超低温保存箱 青岛海尔特种电器有限公司；K D N-1 0 3 F 型自动定氮仪 上海纤检仪器有限公司；ULTRA 55型场发射扫描电子显微镜 德国蔡司仪器公司。
1.3 方法
1.3.1 天然保鲜剂预处理
参照李新福[18]的方法，迷迭香提取物、茶多酚、香芹酚、ε-PL醇溶液的质量浓度均为0.01 g/mL，乙醇体积分数为25%，Nisin的酸溶液质量浓度为0.01 g/mL，盐酸浓度为0.02 mol/L。
1.3.2 受试菌悬液制备
1.3.2.1 超低温保存菌种的活化与复壮
取出课题组前期从蟠龙菜中分离鉴定后于-80 ℃冻存的3 种菌种（肠杆菌属（Enterobacter）、分散泛菌（Pantoea dispersa）、托拉假单胞菌（Pseudomonas juntendi）），将其置于约39 ℃的70%乙醇浴槽中，期间适当摇动冻存管至完全液化。在无菌环境下，以划线法将其接种至PCA培养基，36 ℃恒温条件下培养24～48 h，挑选典型菌落转接到新的培养基，重复培养及转接操作2～3 次。
1.3.2.2 菌悬液制备
挑取多个独立单菌落于5 支装有5 mL生理盐水的试管中制成不同浓度菌悬液，以生理盐水为空白对照并在600 nm处测定其吸光度，通过倒平板计算各浓度菌液单位体积活菌数，以吸光度为横坐标，单位体积活菌数为纵坐标，构建菌浓度-吸光度标准曲线。根据标准曲线，在600 nm下调整吸光度，调整至菌液浓度为7～8（lg（CFU/mL））备用，每种菌均制作单独的菌悬液。
1.3.3 天然保鲜剂的筛选
在超净台中吸取50 μL准备好的菌悬液，将其滴入PCA培养基平板，均匀涂布，每种菌都制作单独的PCA平板，然后在每个平板中放入3 个分布均匀的牛津杯（外径7.80 mm）。向不同菌种平板上的牛津杯内滴加0.2 mL预处理的1 种天然保鲜剂溶液，对每种天然保鲜剂溶液均进行同样操作。在牛津杯中添加等量的生理盐水作为空白对照，将处理后的平板平稳放入37 ℃培养箱中培养24 h，期间避免移动平板。采用十字交叉法用游标卡尺测定抑菌圈直径，重复3 次取平均值。
1.3.4 蟠龙菜制备工艺
蟠龙菜配料表：主料：猪瘦肉、肥肉、草鱼肉质量比4∶3∶3；辅料：马铃薯淀粉12%、水2%、蛋清15%、大葱末0.17%、生姜末0.17%；调味料：味精0.2%、盐1.5%；品质改良剂：大豆分离蛋白3.7%、卡拉胶1.2%、转谷氨酰胺酶0.5%。其中，辅料、调味料和品质改良剂添加量以原料肉质量为基础进行计算。
工艺流程及操作要点：蟠龙菜制作工艺流程参考王虹[1]的方法并做修改（图1）。将瘦肉、鱼肉按比例一同绞成肉糜状，肥肉绞至最大块体积不超过1.5 cm3，加入鸡蛋清、肥肉粒、马铃薯淀粉、葱、姜、盐、味精、水，逆时针手动搅拌5 min；将混合均匀的肉糜置于洁净的保鲜膜上，将其裹成长约10 cm、直径约6 cm的类圆柱体；将成型后的坯置于蒸笼上蒸制20 min，表面刷蛋黄液，继续蒸制5 min；随后将冷却后的蟠龙菜装袋并在0.1 MPa的真空度下进行抽真空操作并封口，105 ℃灭菌20 min，成品置于4 ℃条件下贮藏。
图1 蟠龙菜制作工艺流程
Fig. 1 Process flow chart for Panlongcai making
1.3.5 天然保鲜剂的应用
以添加筛选后的3 种天然保鲜剂的蟠龙菜为实验组，以不添加保鲜剂的蟠龙菜为对照组。Nisin和香芹酚添加量为0.25 g/kg、ε-PL添加量为0.2 g/kg，与辅料混合后一同加入。蟠龙菜制作完成后，于4 ℃贮藏，在0、5、10、15、20、25 d分别测定其菌落总数、pH值、总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、过氧化值和硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值，为探究3 种天然保鲜剂对蟠龙菜风味和微观结构的影响，贮藏15 d时进行微观结构观察、感官评价和电子鼻测定。
1.3.6 菌落总数测定
参照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》进行测定。
1.3.7 pH值测定
参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》进行测定。
1.3.8 TVB-N含量测定
参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》，采用自动凯氏定氮仪法测定。
1.3.9 TBARS值测定
采用GB 5009.181—2016《食品安全标准 食品中丙二醛的测定》的分光光度法进行测定。
1.3.10 蟠龙菜贮藏指标评价方法
采用熵权法计算菌落总数、pH值、TBARS值、TVB-N含量的熵值和熵权，结合灰色系统理论，将蟠龙菜的菌落总数、pH值、TBARS值、TVB-N含量4 项指标视为1 个灰色系统，各指标为系统的1 个因素。取各指标最优值构建1 个理想的系统，然后对各指标进行无量纲化处理，综合计算不同贮藏期及添加不同保鲜剂的蟠龙菜贮藏品质的灰色关联系数。
1.3.10.1 贮藏指标权重计算
假设有m 个样本数据点，每个样本涵盖n 项特征指标，按式（1）、（2）分别对数据进行规范化和标准化处理：
式中：x i j为第i 个样本的第j 个指标的测定值（1≤i≤m，1≤j≤n）；fij为规范化处理后的值；Zij为标准化处理后的值。
对于第j个指标的熵值Hj，按式（3）进行计算：
式中：
当Zij＝0时，ZijlnZij＝0。
依照式（4）计算某一指标权重wj：
式中：0≤wj≤1且
wj＝1。
1.3.10.2 加权灰色关联度计算
依照式（5）构建原始评价矩阵及参考序列：
令X 0 为理想方案， 设定比较数列X 0 ＝（x01, x02…x0j…x0n）。
将评价矩阵按式（6）进行标准化及转化：
将理想方案X0进行标准化后得出理想数列矩阵Z0＝（z01, z02…z0j…z0n）。
按式（7）进行转化， i（j）为无量纲化后样本i的j指标值与理想方案中对应指标值的差值：
灰色关联系数及加权灰色关联度分别按式（8）、（9）计算：
式中：ξi（j）为灰色关联系数；ε为灰色分辨系数，取0.5；φi为样本i的加权灰色关联度。
1.3.11 扫描电子显微镜观察
参考余永名等[19]的方法并作适当修改，将贮藏0 d的蟠龙菜样品切为3 mm×3 mm×3 mm小块，2.5%戊二醛固定12 h，然后用0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.2）漂洗3 次，5 min/次，使用不同体积分数的乙醇（30%、50%、70%、90%、95%、100%）进行梯度脱水（15 min/梯度），后将样品真空冷冻干燥。扫描前离子溅射喷金，用扫描电子显微镜放大1 000 倍观察微观结构并记录。
1.3.12 感官评价
取蟠龙菜切为长5 cm、宽3 cm、厚3 mm的薄片，蒸煮5 min，标号后由4男4女共8 名受过培训的食品感官评价员根据感官评分标准（表1）对其外观、色泽、组织状态、风味和可接受性进行感官评价，在品尝样品时，先闻香后品尝，品尝完成后用纯净水漱口，并休息1 min，口中无余味后开始品尝下一样品，结果去掉最大值和最小值后取平均值。
表1 感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation criteria
项目评分标准分值外观（0～15）外形完整，无异物外观一般平整，无异物外观不平整，有异物10～15 5～9 0～4色泽（0～20）表面为硫磺色，内里为米白色表面为橙黄色，内里为较暗米白色或浅粉色表面为浅棕黄色，内里为暗灰色16～20 8～15 0～7组织状态（0～25）组织致密，弹性优良，切片良好，无密集气孔组织一般致密，弹性一般，不易切片，存在气孔组织疏松，弹性差，不能切片，存在较多气孔18～25 9～17 0～8风味（0～25）咸淡适中，风味优良，具固有风味偏咸或偏淡，风味一般过咸或过淡，风味差，有异味18～25 9～17 0～8可接受性（0～15）完全可以接受可以接受不能接受10～15 5～9 0～4
1.3.13 电子鼻测定
将蟠龙菜样品破碎至均匀状态，称取1.0 g样品于15 mL顶空瓶中，用垫片封口后放置至室温，然后进行样品检测，重复测定3 次。
电子鼻参数：测定时间间隔1 s，传感器清洗时间60 s，归零时间10 s，气体采样时间100 s，进样流量400 mL/min。根据传感器数据曲线，选择60～62 s的数据，对其进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。电子鼻传感器组成及功能如表2所示。
表2 电子鼻的传感器组成及功能
Table 2 Sensor composition and function of electronic nose
序号传感器型号功能描述1 W1C能灵敏感知芳香族化合物2 W5C能灵敏识别氮氧化合物3 W3C能灵敏识别氨和芳香族化合物4 W6S对碳氢化合物、芳香族化合物敏感5 W5S对碳氢化合物、芳香族化合物有选择性6 W1S对短链烷烃如甲烷敏感7 W1W对多种萜类和有机硫化合物敏感8 W2S对醇、醚、醛、酮敏感9 W2W对芳香族化合物、硫、氯类化合物敏感10W3S对长链烷烃敏感
1.4 数据处理
测得的数据使用Excel 2019软件进行简单计算处理，采用SPSS 26.0软件进行差异显著性分析，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著；采用Origin 2019b软件绘图；电子鼻数据采用PEN3.0自带的Win-muster软件进行PCA；偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）分析采用Unscrambler 9.7软件的PLS2程序，数据在分析前均进行标准化。PLSR分析以贮藏时间（0、5、10、15、20、25 d）和不同保鲜剂处理（不添加、香芹酚、ε-PL、Nisin）为X变量，4 个品质指标（菌落总数、TBARS值、TVB-N含量、pH值）为Y变量。每个理化指标测定均重复3 次。
2 结果与分析
2.1 天然保鲜剂的筛选结果
对抑菌圈数据进行Kruskal-Wallis检验，得出添加不同保鲜剂时Enterobacter组卡方值为16.76，自由度为5，P（0.005）＜0.01，数据间存在极显著差异；P. dispersa组与P. juntendi组卡方值均为16.826，自由度均为5，P（0.005）＜0.01，数据间差异极显著。由表3可知，迷迭香提取物和茶多酚的醇溶液抑菌圈直径均等于牛津杯的外径（7.8 mm），这说明该浓度下的迷迭香提取物和茶多酚对从蟠龙菜中分离纯化出的细菌生长繁殖没有抑制作用。迷迭香提取物具有较高的抗氧化活性[20-21]，但在抑菌活性方面，相关研究表明，迷迭香提取物对细菌最低抑菌浓度为6.25 mg/mL[22]，因而在本研究中未表现出抑菌活性。茶多酚具有优异的抗氧化能力[23-24]，但其抑菌性能相较于ε-PL、Nisin等抑菌剂来说稍差[25]。对Enterobacter来说，香芹酚、ε-PL和Nisin的抑菌圈直径分别为32.27、16.50、11.20 mm，说明它们都有抑制其生长繁殖的能力，并且香芹酚抑菌效果最好，ε-PL次之，最后是Nisin。对于P. dispersa和P. juntendi而言，只有香芹酚（22.53、10.50 mm）和Nisin（11.30、13.03 mm）具有抑菌效果。综合评价得出，香芹酚、ε-PL和Nisin的添加均抑制了微生物的生长，且香芹酚相比于ε-PL和Nisin拥有更好的抑菌效果。因此，选择香芹酚、ε-PL和Nisin 3 种天然保鲜剂应用于蟠龙菜生产中。
表3 天然保鲜剂对不同优势腐败菌的抑菌效果
Table 3 Bacteriostatic effect of natural preservatives on dominant spoilage bacteria
抑菌圈直径/mm EnterobacterP. dispersaP. juntendi茶多酚7.80±0.007.80±0.007.80±0.00香芹酚32.27±0.9022.53±4.9410.50±0.20 ε-PL16.50±0.207.80±0.007.80±0.00迷迭香提取物7.80±0.007.80±0.007.80±0.00 Nisin11.20±0.3011.30±0.1713.03±0.06天然保鲜剂
2.2 蟠龙菜贮藏期间菌落总数变化
由表4可知，在贮藏的前5 d，各组均未检测出菌落，说明在此期间微生物数量级较小且活跃度低，传统微生物培养菌株未发展成菌落。由于大部分微生物在生产过程中的热处理中被杀死，蟠龙菜中残存细菌及芽孢的活力受损严重，菌群数量短时间内不能有效恢复。低温也会抑制某些微生物的生长，因此微生物绝对数量较少。在贮藏第10天，香芹酚组未检测出菌落，且在接下来的贮藏过程中，该组的菌落总数均显著低于其他组（P＜0.05），可以得出香芹酚具有较好的抑菌效果，与抑菌圈实验所得结果一致。Karam等[26]的研究同样表明香芹酚能有效抑制卤鸡产品中的微生物群。在不同贮藏时间点，香芹酚组和Nisin组菌落总数均低于对照组，表现出了一定的抑菌效果，这与刘欣等[27]的研究结果一致。ε-PL组在贮藏初期表现出了较好的抑菌效果，但在贮藏10 d后，与对照组之间的差异不显著（P＞0.05），不能有效抑制微生物的生长。
表4 天然保鲜剂添加对蟠龙菜贮藏期间菌落总数的影响
Table 4 Effect of natural preservative addition on TBC during storage of Panlongcai lg（CFU/mL）
注：ND.未检出；同列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。表10同。
保鲜剂贮藏时间/d 0510152025对照NDND1.70±0.17a4.08±0.00a4.16±0.01a4.23±0.02a香芹酚NDNDND3.71±0.01b3.87±0.05c4.01±0.02b ε-PLNDND0.90±0.17b4.07±0.04a4.17±0.03a4.23±0.00a NisinNDND1.62±0.02a3.48±0.01c4.04±0.01b4.21±0.02a
2.3 蟠龙菜贮藏期间pH值和TVB-N含量变化
如表5所示，蟠龙菜贮藏25 d时pH值均低于0 d时的pH值，这是因为贮藏过程中微生物的生长繁殖活动利用有机物后，将其分解为乳酸、醋酸等有机酸。在贮藏的15 d以内，样品组和处理组的pH值变化不明显，推测可能与微生物数量较少有关，少量微生物分解糖类等营养物质能力较弱。贮藏中后期蟠龙菜中微生物加速利用蟠龙菜中的多种有机物生成各种有机酸，因此pH值下降速度加快，并且对照组pH值相较于实验组下降更快。
表5 添加不同保鲜剂的蟠龙菜贮藏期间pH值和TVB-N含量变化
Table 5 Changes of pH and TVB-N content during storage of Panlongcai supplemented with different preservatives
注：同行小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。表6同。
指标保鲜剂贮藏时间/d 0510152025理化pH对照 6.68±0.03bc 6.83±0.02a 6.70±0.01b 6.65±0.02c 6.56±0.03d 6.49±0.02e香芹酚 6.73±0.06a 6.79±0.02a 6.70±0.02b 6.64±0.02c 6.63±0.01c 6.62±0.01c ε-PL6.70±0.06a 6.80±0.02a 6.72±0.02a 6.69±0.01a 6.64±0.03a 6.64±0.02a Nisin 6.71±0.09a 6.77±0.02a 6.74±0.02a 6.67±0.01a 6.66±0.02a 6.54±0.03a对照 11.85±1.47ab 10.73±0.69b 11.11±0.43ab 11.76±0.50ab 11.90±0.42ab 13.16±1.89a香芹酚 11.20±0.00a 10.13±0.57a 11.43±0.40a 10.50±0.00a 10.97±0.21a 11.81±0.57a ε-PL 11.90±0.00a 12.23±0.53a 12.32±0.24a 11.25±0.08a 12.97±0.53a 12.83±0.40a Nisin 10.03±0.69b10.69±0.53ab 10.36±0.37ab 10.69±0.32ab 10.87±0.29a 11.06±0.14a TVB-N含量/（mg/100 g）
在贮藏初期，空白对照组蟠龙菜中TVB-N含量变化不明显；贮藏10～20 d时，TVB-N含量小幅增加，贮藏后期迅速升高，25 d时达到13.16 mg/100 g。对照组TVB-N含量呈现这样的变化是由于贮藏初期样品中微生物数量较少，分解蛋白质的能力有限，此后微生物逐渐适应外界环境，生长繁殖活动加快。香芹酚、ε-PL和Nisin的添加抑制了蟠龙菜样品中微生物的生理活动，因此TVB-N的生成量也相对较少，其中添加香芹酚的组别TVB-N含量变化最小，从贮藏初期的11.20 mg/100 g到后期的11.81 mg/100 g，仅增加0.61 mg/100 g，说明香芹酚能有效减缓蛋白质降解速率，维持产品品质。在贮藏25 d时，Nisin组TVB-N含量（11.06 mg/100 g）最低，表明Nisin能有效延缓TVB-N的生成。
2.4 蟠龙菜贮藏期间TBARS值变化
如表6所示，在低温贮藏过程中，蟠龙菜的TBARS值虽总体处于较低水平，但随贮藏时间的延长均呈现上升趋势，即脂肪氧化的程度逐渐加深。在贮藏结束时，对照组TBARS值为0.48 mg/kg，与其他组相比变化最大。贮藏25 d时，香芹酚组TBARS值最低，Nisin组次之，说明香芹酚的添加能抑制蟠龙菜的脂肪氧化，Nisin的添加也能在一定程度上减缓蟠龙菜的脂肪氧化过程，提高其贮藏过程中的品质。
表6 添加不同天然保鲜剂的蟠龙菜贮藏期间TBARS值的变化
Table 6 Changes of TBARS value during storage of Panlongcai supplemented with different natural preservativesmg/kg
保鲜剂贮藏时间/d 0 5 10152025对照0.28±0.03c 0.29±0.02bc 0.33±0.04bc 0.31±0.02bc 0.34±0.04b 0.48±0.01a香芹酚 0.17±0.00c 0.20±0.02b 0.26±0.02a 0.26±0.02a 0.27±0.01a 0.28±0.00a ε-PL0.32±0.02b 0.37±0.07b 0.31±0.01b 0.36±0.07b 0.38±0.02b 0.47±0.02a Nisin0.25±0.04a 0.29±0.02a 0.28±0.00a 0.31±0.01a 0.33±0.01a 0.37±0.02a
2.5 PLSR分析
在进行多变量回归分析时，采用PLSR进行分析可避免存在变量的共线性问题，减少分析的误差，保持回归分析的稳定。因而，使用PLSR分析各主要因素对蟠龙菜样品品质指标变化的影响。由图2可知，PC1和PC2共解释了Y变量的77%，Y变量均落于内外2 个椭圆之间，表明这些变量能合理地被该PLSR模型解释。贮藏时间（0、5、10 d）和蟠龙菜的pH值均位于PC1轴的负半轴，说明在贮藏初期蟠龙菜pH值并未出现明显变化。贮藏时间（15、20、25 d）和蟠龙菜的TVB-N含量、TBARS值和细菌菌落总数均位于载荷图的右侧，说明贮藏时间和反映蟠龙菜品质下降的指标（TVB-N含量、TBARS值和菌落总数）呈正相关，与pH值呈负相关，贮藏初期和贮藏后期的蟠龙菜品质指标具有明显区别。ε-PL组、对照组位于PC1轴的正半轴，与TVB-N含量、TBARS值和菌落总数呈正相关，与pH值呈负相关，说明添加ε-PL与不添加保鲜剂的蟠龙菜在贮藏过程中品质指标无明显差异，均不能有效维持蟠龙菜的品质稳定性。香芹酚组和Nisin组均位于载荷图左下侧，远离反映蟠龙菜品质下降的3 项指标，说明香芹酚处理和Nisin处理能很好地避免或延缓蟠龙菜在贮藏过程中产生品质劣变。
图2 基于PLSR分析各主要因素对蟠龙菜品质指标影响的相关载荷图
Fig. 2 PLSR loading plot showing the effects of the main factors on the quality indexes of Panlongcai
2.6 蟠龙菜贮藏期间微生物理化指标权重及加权灰色关联度分析
2.6.1 贮藏指标权重确定
对蟠龙菜菌落总数、pH值、TBARS值、TVB-N含量4 项贮藏指标进行熵值计算（表7），并进一步得出熵权。经求解，菌落总数、pH值、TBARS值、TVB-N含量的权重分别为0.137 9、0.549 5、0.113 9、0.198 7。
表7 蟠龙菜贮藏指标的熵值及熵权
Table 7 Entropy values and entropy weights of storage indexes of Panlongcai
贮藏指标熵值熵权TBARS值0.958 20.137 9菌落总数0.833 50.549 5 pH值0.965 50.113 9 TVB-N含量0.939 80.198 7
2.6.2 贮藏指标加权灰色关联度分析
根据蟠龙菜贮藏指标与品质的关系确定各核心指标的理想值（表8），除菌落总数选择最小值外，其他品质指标均选择最大值为理想值，以此构建理想序列。
表8 蟠龙菜贮藏指标理想值
Table 8 Ideal values of storage indicators of Panlongcai
TBARS值/（mg/kg）菌落总数（lg（CFU/mL））pHTVB-N含量/（mg/100 g）0.1706.8310.03
将各项指标标准化处理后构建评价矩阵，根据式（8）得出蟠龙菜样品相应指标的灰色关联系数，然后将计算出的熵权代入式（9）中，得出各样品的加权灰色关联度。加权灰色关联度数值越大，表明该样本与理想样品相似度越高，由表9可知，在贮藏25 d时，Nisin组样品加权灰色关联度为0.405 9，排名相较于其他组最靠前，因而推测添加Nisin能够有效提高蟠龙菜的贮藏品质。其次是香芹酚组，表明香芹酚的添加同样能在一定程度上延缓蟠龙菜贮藏期间品质指标的下降速度，有利于延长蟠龙菜产品的货架期。
表9 蟠龙菜各样品的加权灰色关联度
Table 9 Weighted grey correlations among Panlongcai samples
样品号加权灰色关联度排名对照-0 d0.782 58对照-5 d0.878 43对照-10 d0.554 612对照-15 d0.409 818对照-20 d0.385 521对照-25 d0.333 324香芹酚-0 d0.872 84香芹酚-5 d0.926 71香芹酚-10 d0.806 26香芹酚-15 d0.434 915香芹酚-20 d0.420 917香芹酚-25 d0.387 620 ε-PL-0 d0.774 69 ε-PL-5 d0.789 17 ε-PL-10 d0.607 711 ε-PL-15 d0.424 016 ε-PL-20 d0.366 322 ε-PL-25 d0.355 223 Nisin-0 d0.905 92 Nisin-5 d0.851 25 Nisin-10 d0.630 410 Nisin-15 d0.478 613 Nisin-20 d0.442 914 Nisin-25 d0.405 919
2.7 蟠龙菜扫描电子显微镜观察结果
如图3所示，对照组蟠龙菜表面微观结构孔隙较大且数量较多，较为粗糙。香芹酚组与对照组微观结构图之间不存在明显差异。ε-PL组与其他组相比表面更为光滑且孔隙较小，可能是因为ε-PL是由25～30 个赖氨酸残基组成的高分子聚合物，主要二级结构单元为α-螺旋结构，且存在部分无规卷曲结构[28]，ε-PL的添加增加了蟠龙菜中蛋白质的交联和相互作用，有助于致密网状结构的形成，从而改变了蟠龙菜表面的微观结构。Nisin组微观结构相较于对照组而言孔隙较少，且表面撕裂状结构较少，可能由于Nisin含34 种氨基酸残基，且分子质量（3 510 Da）较大[29]，与蟠龙菜中蛋白质产生相互作用或交联，形成更为致密的结构。
图3 添加不同天然保鲜剂蟠龙菜的微观结构
Fig. 3 Microstructure of Panlongcai supplemented with different natural preservatives
A.对照组；B.香芹酚组；C. ε-PL组；D. Nisin组。
2.8 蟠龙菜感官评价
由表10可知，各组的外观、色泽和组织状态评分并未显示出显著变化（P＜0.05），可推知香芹酚、ε-PL和Nisin的添加不会在消费者能感知的范围内影响蟠龙菜的外观、色泽及组织状态。从风味角度来看，香芹酚组风味评分（16.25）显著低于对照组和其他处理组（P＜0.05），这可能是因为香芹酚本身具有的特殊气味改变了蟠龙菜的固有风味，并且部分人群对香芹酚风味的接受度较低。在实际生产中，可通过与其他保鲜剂复配减少香芹酚的用量，从而减少特殊香味对产品风味的影响。从可接受性角度来看，香芹酚组的评分同样较其他组低。从总体评分来看，ε-PL组、Nisin组与对照组之间的感官评分并未出现显著差异（P＞0.05），由此可知添加ε-PL和Nisin不会对蟠龙菜的感官特性产生负面影响。
表10 添加天然保鲜剂对蟠龙菜贮藏期间感官评分的影响
Table 10 Effect of natural preservative addition on sensory scores of Panlongcai
保鲜剂外观评分色泽评分 组织状态评分 风味评分 可接受性评分总分对照13.50±1.07a 17.00±2.51a 20.88±1.73a 21.38±1.41a 12.63±1.19a 85.38±3.20a香芹酚 13.63±1.19a 17.50±1.20a 20.88±1.55a 16.25±5.85b 8.88±2.64b 77.13±9.11b ε-PL14.25±0.89a 17.38±0.92a 22.75±1.83a 21.25±1.98a 12.38±1.69a 88.00±1.69a Nisin13.75±1.04a 18.00±1.31a 21.38±1.51a 21.75±1.83a 13.25±1.28a 88.13±3.09a
2.9 蟠龙菜电子鼻分析
电子鼻系统中的多个气敏传感器可将不同特征的风味物质转化为电信号[30]，从而识别风味物质，再根据PCA和判别分析等方法对识别的不同风味进行分析。不同传感器对特定类别的物质敏感，因而根据传感器信号强度可直观地判断特征气味物质。由图4可知，传感器W5S、W1S、W1W、W2S、W2W的响应值有明显变化，这些传感器对添加不同保鲜剂蟠龙菜的风味区分做出了较大的贡献。蟠龙菜风味物质与产生强信号的传感器所对应的风味物质类别一致，有短链烷烃、碳氢化合物、芳香烃化合物、萜类、有机硫化物、醇、醚、醛、酮、硫类和氯类化合物。同时，传感器W5S和W1W的响应值变化最为明显，据此可知蟠龙菜风味物质中碳氢化合物、芳香烃化合物、萜类和有机硫化物含量较高。添加不同保鲜剂的样品在雷达图中呈现出相似的连接形状，表明不同组别之间的风味物质存在一定的相似性。Nisin组图形与对照组之间更为接近，说明Nisin的添加未对蟠龙菜风味产生明显改变。
图4 添加不同天然保鲜剂蟠龙菜的电子鼻传感器响应值雷达图
Fig. 4 Radar plot of electronic nose response for Panlongcai supplemented with different natural preservatives
图5中的椭圆代表同组蟠龙菜风味数据集，PC1方差贡献率为98.46%，表明样品间的差异集中在PC1上，前2 个PC贡献率总和达到99.58%，说明PC1和PC2几乎能解释全部原始变量的信息。对照组与Nisin组图形有一定的重叠，说明添加Nisin对蟠龙菜样品的风味无明显影响；从PC1轴来说，香芹酚组与对照组的椭圆几乎不存在重合，表明添加香芹酚的蟠龙菜风味相较于对照组差异较大。对照组与ε-PL组图形彼此独立，但在PC1轴上存在一定的重合。结合雷达图和PCA图，香芹酚组具有独特气味，Nisin组的气味与对照组更为接近，与感官评价结果一致。
图5 添加不同天然保鲜剂蟠龙菜的电子鼻传感器响应值PCA图
Fig. 5 PCA score plot of Panlongcai supplemented with different natural preservatives based on electronic nose signals
3 结 论
ε-PL、Nisin和香芹酚对蟠龙菜中优势腐败菌抑制效果较好。添加香芹酚能有效减缓pH值下降、脂肪氧化和挥发性盐基氮的生成，从而延缓蟠龙菜的腐败，但会显著降低蟠龙菜的风味及可接受性（P＜0.05）。添加Nisin或ε-PL的蟠龙菜微观结构中孔隙较少且结构更为致密。相较于其他天然保鲜剂，添加Nisin的蟠龙菜风味与对照组更为接近，且感官评分最高。使用PLSR及熵权法结合加权灰色关联度对4 项贮藏指标进行分析，贮藏25 d时，加权灰色关联度较高的是Nisin（0.405 9）和香芹酚（0.387 6），表明Nisin和香芹酚的添加能有效改善蟠龙菜贮藏过程中的微生物及理化品质。综合分析得出，Nisin能在不改变蟠龙菜风味的同时有效抑制冷藏过程中微生物的生长繁殖及蛋白质和脂肪氧化，提高其贮藏品质。本研究为蟠龙菜工业化生产中的天然保鲜剂选择及蟠龙菜产品贮藏过程安全性风险的控制提供了一定的理论支持。
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