食品掺假是指在未注明标签的情况下，添加或减少某些改变食品成分、影响营养价值甚至不被社会接受的物质[1]。目前，肉制品是提供人体氨基酸和蛋白质等必需营养物质的重要来源之一，随着国内外生活水平的不断提升，其消耗量逐年递增，一些制造商为追逐更高利润，用廉价肉代替或掺入优质肉类但并未注明标签进行销售，如在牛肉产品中掺加马肉和猪肉[2]、羊肉产品中掺加鼠肉[3]等。故肉类掺假不仅使消费者利益受损，且威胁健康，特别是鼠肉，因鼠类对生存环境要求较低，常携带大量病毒，且可能食用毒鼠药物中毒[4]。因此，不真实的肉制品标签可能避开检验检疫，使人畜共患的病毒传入人体，造成严重的公共卫生风险[5]。虽然我国的食品安全监管部门对于肉类掺假方面严格筛查，但相应的检测标准仍有待完善[6]，尤其是鼠肉这种特殊成分的鉴定。此外，现有的检测方法难以满足肉类快速消费下大批量产品的检测需求。因此，亟需建立快速、有效、准确和高通量的检测技术，以防止掺假肉制品的非法销售。
脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）是大多数生物体的遗传物质，相比于蛋白质具有更高的稳定性和特异性，因此基于DNA的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术在现有的肉类掺假检测方法中应用最为广泛[7]，如传统PCR、实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，realtime PCR）和数字PCR（digital PCR，dPCR）等[8-9]。传统PCR技术具有操作简单、成本低廉的优点，但其检测时间长且不能定量分析。虽然real-time PCR和dPCR实现了实时定量或定性检测，但其设备昂贵，对人员专业程度要求较高[10-11]。近年来，随着等温扩增技术的发展，如环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术已被应用于加工肉制品中肉的种类鉴定[12]，该技术在恒温条件下可扩增目标DNA，但需4～6 条扩增引物，易出现假阳性，且扩增时间长（1 h以上）[13]。
实时荧光重组酶辅助扩增（real-time recombinaseaided amplification，Rt-RAA）作为近年来新兴的扩增技术，克服了传统PCR等PCR技术检测时间长且需依赖变温仪器的缺点，在恒温条件下即可实时快速扩增目的DNA[14]。此外，相比于LAMP，Rt-RAA仅需1 对引物和1 条中间修饰的探针，避免了因引物二聚体导致的假阳性。因其具有恒温、快速、准确及操作简便的优点，在本研究中基于Rt-RAA检测技术建立同步鉴定大鼠、小鼠源性成分的检测方法，并评估其特异性、灵敏度和稳定性，实现这2 种成分在肉制品中的快速检测，旨在为肉类掺假提供更有效的检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大鼠、小鼠活体购自广东省医学实验动物中心。鸭肉、牛肉、马肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鹅肉购自当地（重庆）超市，除马肉外其他通过外观确认。马肉与购自京东和淘宝的骆驼肉、马鹿肉、梅花鹿肉、驴肉的真实性通过相关检测标准进行鉴定。
RAA荧光核酸扩增试剂盒 杭州众测生物科技有限公司；通用型核酸提取试剂盒 成都TaKaRa公司。
1.2 仪器与设备
JXFSTPRP-32组织研磨仪 上海净信实业发展有限公司；CFX96 Touch荧光定量PCR仪 美国Bio-Rad公司；Nanodrop ONEc超微量分光光度计 美国Thermo Scientific公司；ME403千分之一电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；GR85DA高压灭菌锅 致微（厦门）仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品处理
羊肉、猪肉、牛肉作为日常食用的肉类，并且为红肉，与鼠肉相似，故本研究将此3 种鲜肉充分粉碎混合作为后续实验样本基底肉（以下称基底肉）。将基底肉与大鼠和小鼠肉按照不同的质量比进行混合，以确定混合肉制品中大鼠和小鼠源性成分检出限。
实际的深加工或熟肉制品（如肉串、火腿肠等）中，通常存在多种肉混合的情况。为了模拟检测市售深加工或熟肉制品，将新鲜的羊肉、猪肉、牛肉与大鼠和小鼠肉按照不同的质量比进行混合，并通过高压灭菌锅121 ℃、20 min进行高压蒸熟处理。
1.3.2 样本DNA提取
参考试剂盒使用说明书进行提取，取25～100 mg组织样本置于含钢珠的离心管中，将裂解液加入其中进行充分研磨，随后加入相应的蛋白酶和RNA酶于56 ℃水浴锅中至样品组织完全溶解，后续通过吸附、离心、洗涤和洗脱得到总基因组DNA。采用超微量分光光度计在260 nm和280 nm波长处测定DNA浓度和纯度，将纯度（A260 nm/A280 nm）为1.7～1.9的样本基因组DNA稀释至约150 ng/mL，并于-20 ℃保存，备用。
1.3.3 双重Rt-RAA引物、探针设计与合成
基于小鼠1 6 S r R N A 基因序列（序列号：G U 3 3 2 5 8 9.2）和大鼠细胞色素c 氧化酶亚基I I I（cytochrome c coxidase subunit III，COX3）基因（基因ID：26204），根据Rt-RAA引物和探针设计原则，使用Snap Gene软件设计大鼠、小鼠特异性引物各1 对，从引物区间扩增子序列区域设计RAA探针各1 条（表1）。引物和探针均由北京擎科生物科技有限公司合成。
表1 用于检测大鼠和小鼠源性成分的Rt-RAA引物和探针序列
Table 1 Rt-RAA primers and probe sequences for detection of rats- and mice-derived ingredients
目标物种 引物和探针名称引物和探针序列（5’→3’）大鼠COX3-FATCATCCGTGAAGGAACATACCAAGGCCACC COX3-RTAATTCCTGTTGGGGGTCAGCAACCGCCTA COX3-PTACGGAATAATCCTGTTTATTGTCTCCGAAG-ROX-A-THF-BHQ2-CTTCTTTGCCGGATT小鼠16S rRNA-FTTAACAAAACAGCTTTTAACCATTGTAGGCC 16S rRNA-RTATTGCCTATAGTCTGATTAACTAACAATGG 16S rRNA-PAACTTCCTAAACTTAAAATTGGGTTAATCTA-FAM-A-THF-C-BHQ1-TTATAGATGCAACAC
1.3.4 大鼠和小鼠双重Rt-RAA检测条件
首先对双重Rt-RAA方法的引物和探针浓度、反应温度等检测条件进行测试与优化。通过Rt-RAA核酸扩增试剂（荧光型）说明书运行程序，测试双重Rt-RAA反应体系中不同的引物和探针浓度，最终优化得到最佳反应体系包括400 nmol/L COX3-F、-R引物，200 nmol/L COX3-P探针，200 nmol/L 16S rRNA-F、-R引物，60 nmol/L 16S rRNA-P探针，25 μL水化缓冲液，2.5 mL MgAc缓冲溶液（280 mmol/L），DNA模板各1 μL，用双蒸水补齐至50 μL。在此体系下，设置31～41 ℃的温度梯度进行反应，最终确立39 ℃为最佳反应温度。每组实验设置3 个平行。
双重Rt-RAA检测条件反应程序为：30 s/循环，40 个循环。
1.3.5 双重Rt-RAA特异性实验
按照1.3.4节确立的最终双重Rt-RAA检测条件，对建立的方法进行特异性验证实验，以提取的鸭肉、牛肉、马肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鹅肉、骆驼肉、马鹿肉、梅花鹿肉及驴肉DNA为特异性实验验证的非目标扩增序列，以大鼠肉和小鼠肉的DNA为阳性对照，并用双蒸水作为空白对照，以确定所建立方法的特异性。
1.3.6 双重Rt-RAA灵敏度实验
将大鼠肉和小鼠肉分别与基底肉混合，制成大鼠肉和小鼠肉质量分数均分别为20%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0%的2 组混合模拟样品，按照1.3.2节提取DNA，按照1.3.4节最佳反应条件及反应程序进行恒温扩增，以确定所建立的方法分别对大鼠肉、小鼠肉的检测灵敏度和同步检测大鼠肉、小鼠肉的灵敏度，并与BJS 201904《食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR法》中real-time PCR方法检测灵敏度进行对比。
1.3.7 双重Rt-RAA稳定性实验
以1.3.6节确定的大鼠肉、小鼠肉的检出限进行6 次平行实验，按照1.3.4节最佳反应条件及反应程序进行双重Rt-RAA扩增，以确定该检测方法的稳定性。
1.3.8 模拟市售样品实验
按照1.3.1节方法制备1.3.6节质量比模拟样品，制得同时含有大鼠肉和小鼠肉且各自所占质量分数分别为10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0%的7 种混合模拟市售熟肉制品，按照1.3.2节提取DNA，按照1.3.4节最佳反应条件及反应程序进行扩增，以确定该方法对实际样品中大鼠肉、小鼠肉同步检检测的可靠性。
1.3.9 市售样品和模拟样品实验
在烧烤店和烧烤摆位购买25 份样品，按照1.3.1节方法制作模拟样品，大鼠、小鼠肉质量分数均为0.5%。按照1.3.2节提取DNA，利用本研究建立的双重Rt-RAA方法和real-time PCR方法进行鼠源性成分检测，对比分析并评价实验结果。
1.4 数据处理
采用PowerPoint软件作图。采用Excel软件进行数据处理，实验结果以±s表示。
2 结果与分析
2.1 双重Rt-RAA检测条件的建立与优化
本研究主要对引物和探针浓度进行优化，最大限度地提高双重Rt-RAA检测方法扩增效率。如表2所示，在双重反应体系中大鼠和小鼠的引物（400 nnmol/L）和探针（120 nmol/L）浓度相同的条件下，小鼠的荧光扩增曲线对大鼠的荧光扩增曲线表现出一定的抑制。因此，通过降低小鼠的引物和探针浓度，并增加大鼠的引物和探针浓度，对双重扩增体系进行优化。最终确定小鼠的引物和探针浓度分别为200 nmol/L和60 nmol/L，大鼠的引物和探针浓度分别为400 nmol/L和200 nmol/L，并得到双重Rt-RAA最佳检测循环阈（cycle threshold，Ct）值。
表2 双重Rt-RAA方法检测不同引物和探针浓度下大鼠和小鼠源性成分的Ct值
Table 2 Cycle threshold (Ct) values of duplex Rt-RAA for rats- and mice-derived ingredients at different primer and probe concentrations
正反向引物浓度/（nmol/L）探针浓度/（nmol/L）Ct值COX316S rRNACOX316S rRNA大鼠小鼠40040012012011.48±0.998.28±0.68 400200120609.08±0.879.30±0.76 400200160606.91±0.877.97±0.26 400200200607.17±1.867.36±0.83 600200160607.90±0.258.14±0.24 600200320608.85±0.7614.62±1.57
为了优化双重R t-R A A 检测方法反应温度，在3 1 ～4 1 ℃进行温度梯度实验。如表3 所示，在31～39 ℃，随着温度的升高，检测大鼠和小鼠的Ct值逐渐降低。在41 ℃时，荧光扩增曲线则呈现出延迟，其中大鼠延迟幅度最大。因此，为了使双重Rt-RAA方法实现快速检测，将39 ℃作为最佳反应温度。
表3 双重Rt-RAA方法检测不同反应温度下大鼠和小鼠源性成分的Ct值
Table 3 Ct values of duplex Rt-RAA for rats- and mice-derived ingredients at different reaction temperatures
反应温度/℃Ct值大鼠小鼠3114.31±1.1811.29±0.25 3310.94±1.3110.60±1.70 359.02±4.029.66±0.59 377.78±4.099.54±4.59 395.97±0.535.73±1.38 4134.75±0.889.80±0.37
2.2 双重Rt-RAA的检测特异性
按照优化的检测条件对双重Rt-RAA方法进行特异性验证。如图1所示，提取的鸭肉、牛肉、马肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鹅肉、骆驼肉、马鹿肉、梅花鹿肉及驴肉等非目标DNA和空白对照均未出现扩增，只有大鼠和小鼠样品DNA出现了扩增曲线，表明双重Rt-RAA检测方法具有良好的特异性。
图1 双重Rt-RAA方法检测大鼠和小鼠源性成分特异性验证
Fig. 1 Specificity verification of duplex Rt-RAA for rats- and mice-derived ingredients
2.3 双重Rt-RAA的检测灵敏度
如图2所示，大鼠和小鼠源性成分的检测灵敏度分别为0.5%和0.2%。
图2 双重Rt-RAA方法检测大鼠和小鼠源性成分灵敏度
Fig. 2 Sensitivity of duplex Rt-RAA for detecting rats- and mice-derived components
A.检测大鼠源性成分灵敏度；B.检测小鼠源性成分灵敏度。
根据其检测灵敏度，仍以羊肉、猪肉、牛肉粉碎混合作为基底肉，制备同时含有大鼠肉和小鼠肉，其质量分数均分别为5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0%的6 种混合样品，结果表明，利用双重Rt-RAA方法同步检测大鼠和小鼠源性成分的灵敏度仍低至0.5%（图3A），realtime PCR方法检测灵敏度则为2%（图3B）。表明本研究建立的鼠源性双重Rt-RAA检测方法灵敏度较传统的realtime PCR检测方法得到进一步的提升，为检测更低质量比鼠源性成分提供了新的方法。
图3 大鼠和小鼠源性成分同步检测灵敏度
Fig. 3 Sensitivity of duplex Rt-RAA and real-time PCR for synchronous detection of rats- and mice-derived components
A.双重Rt-RAA方法；B. real-time PCR方法。
2.4 双重Rt-RAA的检测稳定性
为了确定双重Rt-RAA方法同步检测大鼠和小鼠源性成分的稳定性，本研究对同时含有大鼠肉与小鼠肉且各自所占质量分数均为0.5%的模拟样品进行同步检测。如图4所示，对设置的6 个平行，均能同步扩增出大鼠和小鼠DNA，表明所建立的双重Rt-RAA方法具有良好的稳定性。
图4 双重Rt-RAA方法同步检测大鼠和小鼠源性成分稳定性
Fig. 4 Stability of duplex Rt-RAA for simultaneous detection of rats- and mice-derived components
2.5 模拟市售样品测定结果
如图5所示，本方法对于大鼠肉和小鼠肉质量分数为0.5%的混合模拟市售熟肉制品仍能检出大鼠和小鼠源性成分。因此，表明本研究所建立的双重Rt-RAA方法可用于实际检测。
图5 双重Rt-RAA方法同步检测模拟样本中大鼠和小鼠源性成分灵敏度
Fig. 5 Sensitivity of duplex Rt-RAA for simultaneous detection of ratsand mice-derived components in simulated samples
2.6 市售样品和模拟样品测定结果
为进一步验证本研究所建立的检测方法的适用性，用双重Rt-RAA方法和BJS 201904中real-time PCR方法对25 份市售样品进行检测，结果高度一致，如表4所示。由于检出阳性样本数较少，在实验中增加了模拟样品进行对比检测，2 种方法检测结果符合率为100%。
表4 大鼠和小鼠源性成分的双重Rt-RAA和real-time PCR方法检测结果
Table 4 Results of detection of rats- and mice-derived components by duplex Rt-RAA and real-time PCR
real-time PCR检出阳性样品数量牛肉串10000羊肉串10101猪肉烤肠5101模拟样（含大鼠肉）3303模拟样（含小鼠肉）3033模拟样（含大鼠肉、小鼠肉）3333样品类型样品数量双重Rt-RAA检出大鼠源性成分样品数量双重Rt-RAA检出小鼠源性成分样品数量
3 讨论与结论
在经济利益的驱使下，肉制品掺假屡禁不绝，不仅给消费者带来经济损失，且可能会对身体造成危害和引发疫病传染风险[15]。从欧洲的“马肉风波”至近年来被曝光的亚洲“鼠肉丑闻”事件，肉制品的掺假问题已经成为社会公众关注的焦点。随着科学技术不断发展，其掺假检测技术也在不断趋于完善。DNA作为绝大多数生物体遗传物质，具有高稳定性和保守性的特点，基于此建立的PCR检测技术[16]、real-time PCR检测技术[17]及等温扩增技术[18]等逐渐成为动物源性成分检测的国家标准或行业标准。目前，Ahamad等[19]建立多重PCR以区分兔肉、大鼠肉和松鼠肉。Suryawan等[20]基于细胞色素b（Cytb）基因开发了单重PCR方法，特异性检出印尼牛肉丸中的大鼠源性成分。王学政等[21]同样通过Cytb基因序列，设计针对鼠源性成分的荧光PCR法特异性引物。Duan Siqi等[4]建立并验证一种基于物种特异性PCR技术快速鉴别肉制品中鼠肉真伪的试剂盒。陈珍金等[22]分别开发了大鼠和小鼠源性成分的LAMP检测技术，用于羊肉制品中鼠源性成分的检测。然而，基于双重Rt-RAA技术同步检测大鼠和小鼠源性成分的技术鲜见报道。
鼠类是一种啮齿类哺乳动物，繁殖速度快、数量多，对生存环境要求低，生命力强。常携带流感病毒、冠状病毒及尼帕病毒等[23]，严重威胁消费者健康。鼠肉为红肉，掺入可食用的肉及肉制品中难以通过外观判断。此外，复杂的样品基质相互干扰，对于检测的准确度和特异性同样产生严重的影响。随着人们对于肉制品的需求不断增加，已报道的鼠源性成分检测方法难以满足大批量的检测。
Rt-RAA是一种基于重组酶、DNA聚合酶及单链DNA结合蛋白3 种关键因子，在恒温条件下通过核酸外切酶（exonuclease，exo）探针实时监测特定DNA扩增过程的检测技术[24-25]，exo探针含有与四氢呋喃（tetrahydrofuran，THF）残基紧密相连的内部荧光基团和猝灭基团[26]。当exo探针与目标序列相结合时，连接荧光基团与猝灭基团THF被切断，进而产生荧光，该荧光可以被常规的荧光定量仪器所检测，降低了Rt-RAA检测技术对仪器的要求。Rt-RAA检测技术具有简单、快速、特异性强和灵敏度高的优点[27]。相对于实时荧光重组酶聚合酶扩增（realtime recombinase polymerase amplification，Rt-RPA）检测技术，Rt-RAA重组酶从细菌或真菌中获得，来源范围广、成本低，且是我国自主研发的新型核酸扩增技术，而Rt-RPA重组酶则来自于T4噬菌体，来源范围窄、获取成本高[28-29]。因此，本研究基于大鼠的COX3基因和小鼠的16S rRNA基因序列建立双重Rt-RAA反应检测体系。实验结果表明，所建立的双重Rt-RAA特异性强、稳定性好，双重体系分别检测大鼠和小鼠源性成分的检出限分别为0.5%和0.2%，同步检测2 种源性成分检出限低至0.5%，并在模拟熟肉制品中同步检出限仍为0.5%，明显优于real-time PCR方法检测灵敏度。双重Rt-RAA方法与real-time PCR方法对市售样品和模拟样品检测结果具有高度一致性，符合率为100%。
与陈珍金等[22]建立的LAMP检测方法实验结果相比，Rt-RAA方法可在39 ℃恒温条件下30 min内完成检测，而LAMP方法则需要63 ℃恒温条件、45 min才能完成检测。同时，Rt-RAA检出限与LAMP检测大鼠和小鼠的检出限基本相当。此外，Rt-RPA检测方法并未出现交叉反应，通过6 次平行实验验证，本研究建立的检测方法具有很好的稳定性。因此，本研究建立的双重Rt-RAA检测方法适用于肉制品中大鼠和小鼠源性成分的快速检测，为现场快速检测肉制品掺假提供了另一条快捷、实用的检测方法。
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