。摘 要：通过高效液相色谱法和紫外分光光度法定性、定量分析克氏原螯虾中游离氨基酸、呈味核苷酸、有机酸及无机盐离子等呈味物质，结合滋味活度值（taste activity value，TAV）和感官评价量化滋味贡献，模拟克氏原螯虾滋味轮廓，利用减除和添加实验确定熟制克氏原螯虾滋味活性组分。结果表明，熟制克氏原螯虾中共检测出17 种游离氨基酸和3 种呈味核苷酸，其中，Arg含量（935.19 mg/100 g）最高，占总游离氨基酸含量的35.95%，其次为K+（817.63 mg/100 g）和腺苷一磷酸（adenosine monophosphate，AMP）（778.09 mg/100 g）。此外，Arg、Glu、Ala、His、Val、Gly、Asp、AMP、鸟苷一磷酸、乳酸、琥珀酸、Na+和K+的TAV均大于1，可能是熟制克氏原螯虾中潜在的滋味活性组分。感官轮廓分析及重组、添加及减除实验结果表明，游离氨基酸和核苷酸是虾肉滋味的主要贡献者，有机酸和部分无机盐离子具有辅助增鲜作用。虾肉滋味提取液主要呈现鲜味和浓厚感，其关键滋味组分为Glu、Gly、Val、Ile、Leu、Phe、Arg、His、Ala、Tyr、AMP、乳酸、Na+、K+和。
克氏原螯虾（Procambarus clarkii），俗名小龙虾，隶属于节肢动物门、软甲纲、十足目、龙虾科，其氨基酸组成合理，富含鲜味氨基酸和不饱和脂肪酸，具有良好的风味和营养价值[1]。熟制后克氏原螯虾肉质鲜嫩，风味独特，深受消费者喜爱[2]。风味主要由气味和滋味组成，其中克氏原螯虾的挥发性风味化合物已有广泛研究[3-5]，目前挥发性滋味化合物的组成和呈味行为表征研究主要集中在鱼类、甲壳类和贝类[6-7]，克氏原螯虾的呈味研究较少。姚静玉等[8]通过1H核磁共振从克氏原螯虾中检出33 种滋味化合物，其中滋味活度值（taste activity value，TAV）大于1的为Arg、His、Glu、Ala、Lys、Gly、腺苷一磷酸（adenosine monophosphate，AMP）、肌苷一磷酸（inosine monophosphate，IMP）、琥珀酸和乳酸。李鹏鹏等[9]探究不同养殖模式下克氏原螯虾游离氨基酸的呈味特性，发现克氏原螯虾主要呈现鲜味和甜味。但克氏原螯虾热加工后关键呈味机制及虾肉鲜甜味的来源尚未明确。
非挥发性滋味化合物组分间相互作用关系复杂，可能对其滋味产生协同增效、掩蔽和变调等影响，无法定量分析单个呈味组分来评估整体滋味特征[10]。滋味感官组学是通过量化呈味组分、合成重组液以模拟滋味轮廓，并通过减除和添加实验减少组分协同作用影响，从分子水平确定关键滋味成分[11]。Gong Jun等[12]对长江刀鱼进行重组、减除实验，合成的简化滋味液与天然提取液相似。贾倩男等[13]通过分子感官科学定性、定量鹰爪虾滋味成分，并构建了滋味重组模型确定其关键滋味成分。
本研究以克氏原螯虾虾尾为原料，通过高效液相色谱法定性、定量热加工后克氏原螯虾的基本滋味组分，依据天然滋味液的组分比例配制简化滋味重组液（simplified taste recombinant，STR）和完全滋味重组液（complete taste recombinant，CTR），模拟克氏原螯虾滋味轮廓进行减除和添加实验，从而确定熟制后克氏原螯虾关键滋味组分，以期为深入研究克氏原螯虾风味品质提供一定参考。
新鲜克氏原螯虾，体质量为20～25 g，购于湖北武商超市。
AMP、鸟苷一磷酸（guanosine monophosphate，GMP）、IMP、Asp、Glu、Ser、Gly、Thr、Ala、Pro、Lys、Val、His、Tyr、Phe、Leu、Met、Ile、乳酸、氯化钠、蔗糖、柠檬酸（纯度≥99%）、Cys（纯度≥9 7%）、A r g（纯度≥9 9.5%）、琥珀酸（纯度≥99.5%）标准品 上海源叶生物科技有限公司；异硫氰酸苯酯、三乙胺、无水乙酸钠、氢氧化钠（均为优级纯） 国药集团化学试剂有限公司；冰醋酸（纯度≥99.5%） 上海麦克林生化科技有限公司；甲醇、乙醇、乙腈（均为色谱纯） 美国默克公司。
UltiMate 3000高效液相色谱仪 赛默飞世尔科技公司；KS-7200DE液晶超声波清洗器 昆山洁力美超声仪器有限公司；A360紫外-可见分光光度计 上海柏欣仪器设备厂；L12-P128高速破壁料理机 北京合千润科贸有限公司；FD5-series冷冻干燥机 深圳市三莉科技有限公司；3K15台式高速冷冻离心机 德国Sigma公司；KDF-08消化炉 上海华睿仪器有限公司；SHZ-D（III）循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；AL204电子分析天平 上海衡平仪器仪表厂；C22-CS01电磁炉 浙江苏泊尔股份有限公司。
1.3.1 克氏原螯虾样品的处理
将新鲜克氏原螯虾洗净，去头、壳、虾线，置于沸水中蒸制280 s，使虾的中心温度达到90 ℃，冷却至室温后于-80 ℃冰箱保存待测。取一定质量的虾尾与超纯水以1∶4（g/mL）混合，均质机15 000 r/min匀浆2 min后热水浸提30 min，冷却并离心（10 000 r/min、4 ℃、2 min），上清液即为虾肉滋味提取液（shrimp meat extract，SE）。
1.3.2 基本滋味组分的定量分析
1.3.2.1 游离氨基酸的测定
参照李发田等[14]方法并稍作修改，取1 mL SE，加入100 μL衍生液（V乙醇∶V异硫氰酸苯酯∶V水∶V三乙胺＝7∶1∶1∶1），衍生30 min。然后加入0.9 mL流动相B并混匀。仪器条件：检测波长254 nm；烘箱温度40 ℃；进样量10 μL；流动相A：80%乙腈水溶液，流动相B：0.1 mol/L无水醋酸钠-乙腈（97∶3，V/V）；洗脱程序见表1；流速1 mL/min。使用已知浓度的氨基酸标准混合溶液（包括Met、Asp、Ser、Gly、Glu、Thr、Ala、Lys、Tyr、Pro、Val、Leu、Phe、Ile、His、Arg和Cys）进行外标法定量。
表1 流动相洗脱程序
Table 1 Mobile phase elution procedure
时间/min1142930373845流动相A体积分数/%0204010010000流动相B体积分数/% 100806000100100
1.3.2.2 呈味核苷酸的测定
参照Liu Ya等[15]方法并稍作修改，取1 mL SE，用1 mol/L NaOH溶液调节至中性，通过0.22 μm微孔滤膜过滤后用于高效液相色谱测定。色谱条件：流动相A：0.05 mol/L KH2PO4-K2HPO4（1∶1，V/V），pH 6.5；流动相B：90%甲醇水溶液。流速0.7 mL/min，柱温25 ℃，检测波长254 nm，进样量20 μL。梯度洗脱程序：0～14 min，100% A；14.01～18 min，100%～25% A；18.01～22 min，25%～10% A；22.01～25 min，10%～0% A；25.01～47 min，0% A。使用外标法进行定量分析。
1.3.2.3 有机酸的测定
参照GB 5009.157—2016《食品安全国家标准 食品中有机酸的测定》进行测定。
1.3.2.4 无机盐离子的测定
Na+、K+含量参照GB 5009.91—2017《食品安全国家标准 食品中钾、钠的测定》进行测定；Cl-含量参照美国分析化学家协会（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）标准方法进行测定；PO43-含量参照GB 5009.87—2016《食品安全国家标准 食品中磷的测定》中的钼蓝分光光度法进行测定。
1.3.2.5 TAV的测定
参考Zhang Ninglong等[16]的方法进行测定。
1.3.3 基本滋味组分的感官分析
1.3.3.1 感官培训
在湖北省农业科学院已成立的感官评估小组中选出30 名至少有2 年感官评定经验的评估员（男女各15 人，22～30 岁）进行感官培训。本研究首先确定以纯净水（pH 6.5）为溶剂时，下列标准化合物的滋味：味精（8 mmol/L）代表鲜味，蔗糖（50 mmol/L）代表甜味，柠檬酸（20 mmol/L）代表酸味，氯化钠（20 mmol/L）代表咸味，咖啡因（1 m m o l/L）代表苦味。根据ISO 4120：2021中的三角检验（triangle test，TS）法对评估人员进行培训，浓厚感评价依照Meyer等[17]的方法，鲜味标度实验依照张宁龙[18]的方法。小组成员对所有参考溶液的味觉强度进行多次讨论并达成共识后，设计一系列标准化合物的浓度梯度，用于提高其味觉灵敏度，如味精（0、2、4、6、8 mmol/L）的鲜味强度训练。强度评估采用五点评分法（0：无味；1：滋味较弱；2：滋味适中；3：滋味较强；4：滋味极强）[19]，纯净水的强度设为0 分。当小组的数据稳定后即可进行滋味特征分析。
1.3.3.2 感官轮廓分析
根据1.3.2节分析结果，将所有呈味组分按照天然浓度溶解于超纯水中配制CTR，取TAV＞1的呈味组分配制STR，使用KOH或HCl溶液（0.1 mmol/L）调节2 种重组液pH值至与SE相同。将SE（1.3.1节制备）、CTR和STR样品分别装入随机编号的塑料杯中呈递给感官小组成员。样品和漱口水（纯净水）均保持在25 ℃，采用鼻夹防止小组成员味觉与嗅觉发生跨模态交互作用，每次品尝样品时需“抿-吐”10 s，并漱口30 s后方可进行后续样品评价。感官小组成员在完成评估后需对5 种滋味强度进行评分，评分标准为0～4 分。
1.3.4 减除实验
通过在CTR中逐一省略单组或单个滋味化合物，共制备31 种不完全滋味重组液。要求小组成员用TS法从3 组重组液（1 个不完全重组液和2 个CTR）中找出1 个与其他2 个不同的重组液[20]。判断正确的小组成员需要描述与CTR相比所感知到的差异，并按照五点评分法对味觉属性进行评分。
1.3.5 添加实验
取TAV＞1但在减除实验中无味觉贡献的成分（共14 种），按天然浓度逐一添加到模型溶液（按照1.3.4节减除实验中确定的滋味活性组分按天然浓度配制而成）中。每种成分添加溶液均由感官小组成员通过TS法与模型溶液进行比较，具体方式同1.3.4节。
实验数据使用Excel 2010进行处理，所有数据均重复测定3 次。采用ISO 4120：2021标准描述的显著性差异（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）对结果进行分析，P值越小，表明其显著性越强。采用Origin 2024绘图。
为阐明克氏原螯虾的主要滋味活性化合物，明确单个化合物对滋味的影响，并进一步模拟SE的滋味轮廓，对SE中各滋味组分进行定量分析。游离氨基酸是虾肉中重要的呈味物质，大多呈现出苦味、甜味和鲜味[21]。由表2的组I可知，克氏原螯虾天然滋味液中共检出17 种游离氨基酸，其中Arg含量最高，占总游离氨基酸含量的35.95%，其次是Ala、Gly和Glu。Arg主要呈现苦味，高含量时可增加虾肉风味的复杂性，提高鲜度[22]，且高含量时可与带有甜味的Ala产生协同作用，赋予虾肉特有的适宜滋味[13]。由于各呈味物质的味觉阈值不同，需通过TAV判断呈味组分对样品整体滋味的贡献，TAV＞1表现为有重要贡献。表2中共有7 个游离氨基酸的含量高于其味觉阈值，分别为Arg（TAV=11.16）、Glu（TAV=6.05）、Ala（TAV=5.45）、His（TAV=4.42）、V a l（T A V=4.1 2）、G l y（T A V=1.7 1）和A s p（TAV=1.31）。Arg是虾肉滋味的主要贡献者，这与王曜等[23]的研究结果一致。呈鲜味的Asp和呈甜味的Val含量较低，但对虾肉滋味仍有重要贡献。Ala、Gly均为甜味氨基酸，且Gly可减少虾肉的苦味[24]。Glu是一种鲜味氨基酸，其酸性二肽Ala-Glu和Glu-Leu均具有鲜味特性，且Val-Glu具有缓冲作用[25]。
表2 SE中滋味组分定量分析
Table 2 Quantitative analysis of taste components in SE
组别非挥发性滋味组分含量/（mg/100 g）（mg/100 g）TAV呈味特征味觉阈值/组I：游离氨基酸Asp77.82±2.1459.51.31鲜/甜Thr22.94±0.22331.00.07甜Ser155.03±1.12201.10.77甜Glu162.74±5.4826.96.05鲜Gly252.33±8.00147.41.71甜Ala372.40±6.0968.35.45甜Cys28.23±3.7859.10.48咸Val67.57±5.4216.44.12甜/苦Ile74.92±3.83122.50.61苦Leu79.61±3.80123.40.65苦Tyr8.05±0.0896.60.08苦Phe39.12±1.761640.24苦His142.84±4.2532.34.42苦Lys81.23±3.77135.30.60苦/甜Arg935.19±10.8983.811.16苦/甜Pro89.85±2.64305.40.29苦/甜Met11.35±0.0861.30.19苦/甜组II：呈味核苷酸AMP778.09±1.1090.58.60鲜/甜GMP58.12±1.4513.54.31鲜IMP12.48±2.0018.10.69鲜组III：有机酸乳酸81.51±1.7077.91.05酸/苦琥珀酸39.97±2.5613.33.01酸/鲜组IV：无机盐离子Na+365.59±8.2734.210.69咸/苦K+817.63±3.7194.98.62咸Cl-3.94±0.0113.710.29改善风味PO4 3-35.51±4.86143.50.25改善风味
呈味核苷酸是水产品中重要的含氮物质，对水产品特殊风味有重要影响[26]，组II中，AMP含量及TAV均较高，AMP是SE的主要呈味核苷酸，具有增加鲜味及减少苦味的作用。其次是GMP，其TAV为4.31。组III中，乳酸和琥珀酸TAV＞1，其中琥珀酸具有更高的TAV（3.01），可为虾肉提供鲜味，增加虾肉滋味的复杂性。组IV中Na+和K+的TAV＞1，而Cl-和PO43-在SE中无突出滋味贡献，起改善风味的作用。
综上所述，Arg、Glu、Ala、His、Val、Gly、Asp、AMP、GMP、乳酸、琥珀酸、Na+和K+可能是SE中潜在的呈味组分（TAV＞1）。然而考虑到组分间存在相互作用，Tyr和Phe等游离氨基酸虽在溶液中具有较低的味觉阈值，但仍可增强其他呈味氨基酸的鲜味和甜味[27]，即部分滋味化合物在低于阈值浓度下同样对食品滋味具有促进作用，因此必须通过感官分析明确各呈味组分对整体滋味的影响。Wu Shujian等[28]发现，凡纳滨对虾头部蛋白质质量分数高达10.32%，其中风味氨基酸（鲜味氨基酸和甜味氨基酸）和功能氨基酸分别占总氨基酸含量的57%和37%，游离氨基酸在虾肉呈味上起重要作用，且虾头自溶过程中部分游离氨基酸会与IMP相互作用产生苦味。Zhou Fen等[29]也发现呈味氨基酸和呈味核苷酸可产生协同效应显著改善鲜味。这些研究均表明滋味的呈现是多种化合物协同作用的结果。Liu Zhenyang等[30]发现对温度敏感的Glu、Asp、Gly和IMP是海鲜滋味的关键贡献物质，对赋予鲜味的丰富度和甜味至关重要，也是凡纳滨对虾虾头的主要滋味成分，该结果与本研究具有一定相似性。
部分分子质量为300～1 500 Da的寡肽能与口腔中对应的风味受体结合，呈现出鲜味、咸味、酸味、苦味、甜味及浓厚感，其中浓厚感是一种具有连续性、醇厚、有回味的味道[31]。由图1可知，SE中鲜味和浓厚感的评分较高，分别为3.6 分和3.2 分。因此可认为鲜味和浓厚感是克氏原螯虾的主体味觉特征，其次是甜味和咸味，其他味觉特征强度较低，可忽略不计。韦磊[32]从南极磷虾中检出16 种游离氨基酸，AMP含量远高于其他呈味核苷酸，虾肉呈鲜甜味。这与本研究结果一致。
图1 SE、STR和CTR的感官轮廓图
Fig. 1 Radar graphs showing the sensory profiles of SE, STR and CTR
CTR和STR的滋味轮廓与SE相似，除咸味外，CTR的滋味强度均高于STR，由此可见，存在TAV＜1的呈味组分在SE中有滋味贡献。在以SE中主要滋味成分为模板构建的CTR中，其鲜味、浓厚感、甜味和鲜味相较于SE仅分别降低5.6%、3.1%、11.5%和20.0%，因此可认为该体系能够在减除实验中再现SE的典型滋味。
减除实验可进一步表征食品中单个呈味组分对整体滋味的贡献，从而揭示SE中关键滋味活性组分。依据2.1节将呈味组分分成4 组进行组间减除。由表3可知，分别消除组I游离氨基酸和组II呈味核苷酸时，重组液中浓厚感和鲜味均显著降低，其中消除游离氨基酸对浓厚感的影响更显著（P＜0.001）。Manninen等[33]研究表明，氨基酸和核苷酸存在协同增鲜作用。消除组III有机酸时，甜味极显著降低（P＜0.01），消除组IV无机盐离子时，咸味极显著降低（P＜0.01），因此，2 组呈味物质均能丰富SE滋味。
表3 克氏原螯虾滋味属性的减除实验结果
Table 3 Taste attributes of cooked crayfish evaluated by omission tests
注：*.差异显著（P＜0.05）；**.差异极显著（P＜0.01）；***.差异高度显著（P＜0.001）。表4同。
减除组分正确区分样品数（n＝30）差异显著性滋味描述组I：游离氨基酸26***咸味↓、鲜味↓**、浓厚感↓***、甜味↓Asp9 Thr6 Ser7 Glu21***鲜味↓***、甜味↓、浓厚感↓、酸味↓Gly16*甜味↓Ala10 Cys12 Val20**鲜味↑*、浓厚感↑*、甜味↑Ile16*鲜味↑**、浓厚感↓*、甜味↓Leu9甜味↑Tyr14 Phe9甜味↓His12 Lys15*Arg21***鲜味↑、甜味↑Pro10 Met组II：呈味核苷酸18**鲜味↓**、浓厚感↓*AMP16*甜味↓、鲜味↓*GMP6 IMP9组III：有机酸22***咸味↓、甜味↓**乳酸13鲜味↓、苦味↑、浓厚感↓琥珀酸11组IV：无机盐离子28***咸味↓**、鲜味↑、甜味↑Na+20***咸味↓、甜味↓、鲜味↓K+21***甜味↓***、鲜味↓**Cl-10 PO4 3-16*甜味↑
对组内单一呈味物质进行组内减除。组I减除Glu和Arg时，滋味均与CTR有高度显著差异（P＜0.001），可认为Arg和Glu是虾肉滋味的主要贡献者，其中减除Glu时，鲜味高度显著下降（P＜0.001），甜味、酸味、浓厚感均下降。组II减除AMP时，滋味与CTR有显著差异（P＜0.05），结合2.1节可得AMP为主要呈味物质，且将3 种呈味核苷酸从CTR中减除时，鲜味极显著下降（P＜0.01），可认为GMP和IMP存在协同增鲜作用。组III减除乳酸时，鲜味和浓厚感均下降，苦味有所增加，乳酸在SE中具有增鲜（浓厚）降苦的双重功效。无机盐离子辅助水产呈鲜[34]，组IV减除Na+和K+时，滋味均同CTR存在高度显著差异（P＜0.001），重组液鲜甜味下降，其中减除K+时，下降高度显著（P＜0.001）。而减除PO34-时，滋味与CTR存在显著差异（P＜0.05），甜味有所增加。无机盐离子能够在一定程度上掩蔽样品的咸味，且通过与其他呈味组分发生相互作用，能极显著提升SE整体滋味。
通过减除实验初步确定，克氏原螯虾虾肉的主要呈味物质为Glu、Gly、Val、Ile、Leu、Phe、Arg、AMP、乳酸、Na+、K+、
，为避免遗漏潜在的滋味活性组分，排除组分间协同作用造成味觉特性的改变，对部分在减除实验中不具备显著性的滋味组分进行添加实验。
将2.3节确定的滋味组分按天然浓度配制重组液，逐一分别添加无显著性滋味组分，结果如表4所示。添加H i s 后重组液滋味与模型溶液有高度显著差异（P＜0.001），咸味下降。张玲等[35]发现，His可与乳酸、
等形成缓冲体系，增加食品滋味。添加Ala和Tyr会导致产物鲜味、甜味下降，而添加乳酸则对滋味具有积极影响，这与2.3节结论一致。
表4 克氏原螯虾滋味属性的添加实验结果
Table 4 Taste attributes of cooked crayfish evaluated by addition tests
单一增加组分正确区分样品数（n＝30）差异显著性滋味描述Asp9 Thr5 Ser10 Ala16*鲜味↓Cys9 Tyr15*鲜味↓、甜味↓His19***咸味↓Lys12 Pro6乳酸16*鲜味↑、苦味↓、浓厚感↑琥珀酸11 GMP10 IMP4 Cl-8
综上所述，可确定克氏原螯虾关键滋味组分为Glu、Gly、Val、Ile、Leu、Phe、Arg、His、Ala、Tyr、AMP、乳酸、Na+、K+和
。然而，由2.1节可知，Asp、GMP的TAV＞1，但减除和添加实验均未见两者对滋味强度的显著影响，这可能是因为存在协同和掩蔽作用。克氏原螯虾的呈味特性极其复杂，存在多重作用影响，仍需进一步探究。
本研究在熟制克氏原螯虾中共检测出17 种游离氨基酸和3 种呈味核苷酸，高含量氨基酸主要为Arg、Ala、Gly和Glu，其中Arg含量最高，占总游离氨基酸含量的35.95%，而呈味核苷酸中含量最高的为AMP。有机酸含量均较低，无机盐离子主要为Na+和K+。其中，Arg、Glu、Ala、His、Val、Gly、Asp、AMP、GMP、乳酸、琥珀酸、Na+和K+的TAV均大于1，是熟制克氏原螯虾滋味的贡献者。熟制克氏原螯虾的滋味主要由游离氨基酸、呈味核苷酸、有机酸和部分无机盐离子共同呈现，其中游离氨基酸和呈味核苷酸是滋味的主要贡献者，而有机酸和部分无机盐离子具有辅助增鲜作用。熟制虾肉提取液主要呈现鲜味和浓厚感，其关键滋味组分为Glu、Gly、Val、Ile、Leu、Phe、Arg、His、Ala、Tyr、AMP、乳酸、Na+、K+和PO43-。本研究可为克氏原螯虾产品的创新发展提供理论依据。
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Characterization of the Key Taste Components of Cooked Crayfish Based on Molecular Sensory Science
Abstract: The free amino acids, flavor nucleotides, organic acids and inorganic salts in cooked crayfish were qualitatively and quantitatively analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) and ultraviolet (UV) spectrophotometry.The taste profile was determined by taste activity value (TAV) and sensory evaluation, and the taste-active components were identified by omission and addition tests. The results showed that a total of 17 free amino acids and three taste nucleotides were detected in cooked crayfish. Among all taste components tested, the content of Arg (935.19 mg/100 g) was the highest,accounting for 35.95% of the total free amino acids, followed by K+ (817.63 mg/100 g) and adenosine monophosphate (AMP,778.09 mg/100 g). Arg, Glu, Ala, His, Val, Gly, Asp, AMP, guanosine monophosphate, lactic acid, succinic acid, Na+, and K+ had TAV greater than 1, which may be potential taste-active components in cooked crayfish. Sensory profiling analysis and recombination, addition and omission tests showed that free amino acids and nucleotides were the main contributors to crayfish taste, and organic acids and some inorganic salt ions were auxiliary umami enhancers. The main taste characteristics of the hot aqueous extract of cooked crayfish were umami and kokumi, and its key taste components were Glu, Gly, Val, Ile,Leu, Phe, Arg, His, Ala, Tyr, AMP, lactic acid, Na+, K+ and 
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