氨基糖苷类（aminoglycosides，AGs）抗生素是一类细菌蛋白质合成抑制剂，其抗菌谱较广、抗菌活性强，对需氧革兰氏阴性杆菌如大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌变形杆菌属、肠杆菌属、志贺菌属等有强大的杀菌作用，常用于防治畜禽呼吸道、肠道、泌尿道感染及败血症、禽霍乱等疫病，是防治需氧革兰氏阴性杆菌感染的首选药物[1-2]。AGs兽药具有严重的肾毒性、耳毒性及造血系统毒性，可造成神经肌肉阻滞、过敏等不良反应[3]，长期食用AGs兽药残留超标的动物源性食品会导致药物在人体内蓄积，同时引发相应的毒副作用或出现耐药性，损害人体健康。为此，监控畜禽肉中AGs兽药残留对于保障畜禽肉质量安全，以及消费者饮食安全和身体健康具有重要意义。
AGs兽药是由氨基糖苷与氨基环醇形成的苷，结构中含有氨基等碱性基团和多个羟基，故此类药物呈碱性，水溶性较强，且紫外吸收弱，进行食品中残留检测分析时存在提取难、保留弱、灵敏度低等难点问题。国内外在解决其保留弱、灵敏度低等难题方面的报道较多。例如，为解决AGs兽药在反相色谱柱上保留弱甚至无保留问题，可在样品进样溶液或流动相中加入离子对试剂[4-7]，或采用亲水性色谱柱[8-12]；若检测灵敏度低，可采用适宜的样品前处理净化技术，如液-液萃取法[13-15]、固相萃取法[16-21]、基质固相分散法[22]等，尽可能去除干扰杂质，降低基质效应，提高灵敏度。针对解决提取难问题的报道甚少，相关报道多采用磷酸盐缓冲液[23-24]，或加入蛋白沉淀剂如三氯乙酸[25-26]、高氯酸[27]、乙腈[28-29]等溶液，提取的同时沉淀蛋白，达到净化目的。
通过查阅文献[30-31]和实验研究发现，AGs兽药可与动物源性食品中的蛋白质结合形成稳定结构，缓冲液提取或沉淀蛋白不能很好地将待测组分提取出来。基于此，本研究拟通过离子对竞争性地与AGs兽药结合，将AGs兽药从牛肉样品的蛋白质中释放出来，同时对前处理方法和仪器条件进行优化，采用超高效液相色谱-串联质谱进行检测，以期解决食品中AGs兽药残留检测提取难、保留弱、灵敏度低的难点问题。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牛肉样品购自广西省内各地农贸市场，独立封装后在-20 ℃下冷冻贮藏，待测时提前取出并于室温下解冻，使用绞肉机处理为均匀肉泥以供前处理。
潮霉素B（纯度9 0.2%）、双氢链霉素（纯度97.7%）、硫酸巴龙霉素（纯度98.0%）、西索米星（纯度95.0%）、硫酸异帕米星（纯度98.6%） 天津阿尔塔有限公司；硫酸链霉素（纯度97.7%）、硫酸卡那霉素（纯度96.4%）、硫酸安普霉素（纯度86.3%）、硫酸庆大霉素（纯度89.2%）、妥布霉素（纯度94.3%）、硫酸新霉素（纯度80.1%）、盐酸壮观霉素（纯度99.9%）、硫酸奈替米星（纯度96.5%）、硫酸依替米星（纯度59.9%）、辛烷磺酸钠（分析纯） 上海安谱璀世标准技术服务有限公司；丁胺卡那霉素（纯度86.2%）、硫酸小诺霉素（纯度80.0%） 广州佳途科技股份有限公司；戊烷磺酸钠、十二烷基硫酸钠（均为分析纯） 上海麦克林生化科技股份有限公司；己烷磺酸钠（分析纯）美国Sigma-Aldrich公司；庚烷磺酸钠、癸烷磺酸钠（均为色谱纯） 美国Fisher Chemical公司；十二烷基磺酸钠（分析纯） 天津市大茂化学试剂厂；乙二胺四乙酸二钠（disodium ethylenediamine tetraacetic acid，Na2EDTA）（优级纯） 天津光复科技发展有限公司；三氯乙酸、磷酸二氢钾、盐酸（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠（分析纯） 广东光华科技股份有限公司；甲酸（色谱纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯） 默克股份两合公司；实验用水为GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》规定的一级水。
1.2 仪器与设备
Triple Quad 5500三重四极杆液相色谱-质谱联用仪美国AB SCIEX公司；1290超高效液相色谱仪、Hilic Plus色谱柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm） 美国Agilent公司；MS303TS电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Milli-Q Advantage A10超纯水机 德国Millipore公司；MILTIFUGE X3R高速冷冻离心机 美国Thermo Fisher Scientific公司；Multi Reax多管式涡旋振荡器德国Heidolph公司；Genius NM32LA氮气发生器 毕克气体仪器贸易（上海）有限公司；TurboVap LV样品自动浓缩仪 瑞典Biotage公司；Oasis HLB固相萃取小柱（6 mL，200 mg） 美国Waters公司。
1.3 方法
1.3.1 样品前处理
取样品2.0 g，加入10.0 mL提取剂（称取磷酸二氢钾1.36 g，加水980 mL使之溶解，采用1 mol/L盐酸溶液调节pH值至4.0，分别加入戊烷磺酸钠8.70 g、己烷磺酸钠9.41 g、Na2EDTA 0.15 g、三氯乙酸20 g使之溶解，以水定容至1 000 mL），涡旋5 min，超声5 min，10 000 r/min、-10 ℃离心10 min，取上清液，采用10 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至4～5，置于已活化HLB固相萃取小柱（6 mL，200 mg，活化：甲醇（5 mL）→水（5 mL）→提取液（5 mL）），用5 mL水淋洗，抽干，用10 mL 0.5%甲酸甲醇溶液洗脱，于40 ℃水浴氮气吹至近干，用1%甲酸水溶液-乙腈（15∶85，V/V）溶解并定容至1.0 mL，涡旋振荡5 min，过0.22 μm滤膜，上机测定。
1.3.2 标准溶液配制
标准储备溶液：精密称取16 种AGs标准物质各10.0 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，得到质量浓度为1 mg/mL的单标储备溶液，0～5 ℃保存。
混合标准中间液：分别精密移取各单标储备溶液0.1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，用水稀释、定容，摇匀，各标准物质质量浓度为10 μg/mL。
混合标准工作液：精密移取混合标准中间液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，用水稀释、定容，各标准物质质量浓度为1.0 μg/mL，用于绘制标准曲线。
称取牛肉空白基质样品，按1.3.1节处理后，得到空白基质溶液。分别精密吸取混合标准工作液0.05、0.10、0.20、0.50、0.75 mL，混合标准中间液0.10、0.12、0.15 mL，用空白基质溶液配制成质量浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.50、0.75、1.00、1.20、1.50 μg/mL的系列基质混合标准工作曲线所需溶液。
1.3.3 分析条件
1.3.3.1 色谱条件
色谱柱：Hilic Plus（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；柱温35 ℃；进样量10 μL；流动相A为1%甲酸溶液，B为乙腈；流动相梯度洗脱程序见表1。
表1 流动相梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution program of mobile phase
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1.3.3.2 质谱条件
电喷雾电离；多反应监测模式；正离子扫描；电喷雾电压5 500 V；碰撞室入口电压10 V；碰撞室出口电压12 V；雾化气（氮气）压力55 psi；辅助加热气压力60 psi；气帘气（氮气）压力35 psi；碰撞气压力9 psi；离子源温度550 ℃；扫描时间60 ms。
1.3.4 基质效应计算
按下式计算：
1.4 数据处理
分别利用Analyst软件和MutiQuant 3.0.2软件进行数据采集及处理，采用Excel 2010软件和Origin 2021软件进行数据汇总和分析。
2 结果与分析
2.1 色谱柱选择
由于AGs兽药含有多个氨基，电离作用强，在反相色谱分离柱中保留极弱甚至无保留。通过在流动相中添加离子对试剂，如戊烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、七氟丁酸等，使之与待测物离子结合，形成可在反相色谱柱中保留的分子，但离子对试剂会残留在质谱系统中，损坏质谱系统，造成质谱检测器对负离子分析性能下降。通过在高纯度、具有良好机械稳定性的硅胶基质表面键合高纯度亲水性基团，可得到亲水性反相分离柱，如HILIC柱、R柱、Gold柱等，可大大增强极性化合物在反相色谱柱上的保留能力和选择性[32-35]。本研究对比不同厂家、不同规格、不同型号的亲水作用色谱柱（Sielc obelisk R（2.1 mm×100 mm，5 μm）、HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Hypersil Gold（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）、Hypersil Gold AQ（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）、Agilent Proshell 120 Hilic（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）、Agilent Hilic Plus（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）、Agilent RRHD Hilic Plus（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Waters CORTECS UPLC Hilic（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）、Waters ACQUITY UPL BEH Hilic（2.1 mm×100 mm，1.6 μm））。结果表明，使用Agilent Hilic Plus色谱柱时，16 种AGs兽药的保留效果较好，色谱峰峰形尖锐、对称性良好（图1）。故最终选择Agilent Hilic Plus色谱柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）。
图1 16 种AGs兽药标准溶液的提取离子流图
Fig. 1 Extracted ion chromatograms of 16 AGs standard solutions
2.2 质谱条件优化
AGs兽药分子结构中含有氨基环醇、羟基和伯胺或仲胺基团等碱性基团，可与流动相中甲酸的H＋结合，形成带正电荷的[M＋H]＋，适宜采用正离子扫描模式，通过优化锥孔电压和碰撞能量，选取响应丰度较高、易得到、出峰稳定的母离子和子离子，进而获得定量和定性离子对。具体质谱参数见表2。
表2 16 种AGs兽药质谱采集参数
Table 2 Mass spectrum acquisition parameters of 16 AGs
注：*.定量离子。
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2.3 提取剂优化
AGs兽药具有弱碱性、带正电，可与细胞中的金属离子螯合，同时牛肉中含有大量蛋白质，蛋白质的肽键结构含有羰基（C＝O），可与AGs兽药分子结构中的N—H键形成稳定结构，给样品提取和净化带来巨大困难。现阶段去除蛋白质的方法有酸性沉淀剂盐析、有机溶剂脱水、生物酶酶解、加热等。本研究采用三氯乙酸沉淀蛋白、Na2EDTA螯合金属离子、Tris溶液-磷酸盐缓冲液提取、蛋白酶水解蛋白质等方式，通过调节提取剂的酸碱度、水解蛋白质等方式，提取液出现不同程度的浑浊，且存在提取不完全、目标物丢失等现象，均不能取得满意效果。由此可知，单纯地沉淀蛋白质并不能破坏蛋白质与AGs兽药之间的结合力，在沉淀蛋白质的同时，AGs兽药也同时沉淀而被去除。
离子对试剂具有强亲水性和结合力，可与电离能力较强的化合物结合[4-5]。而AGs兽药为阳离子化合物，电离能力强，易与阴离子离子对试剂配对[7]。为此，本研究考察阴离子离子对试剂烷基磺酸盐类（0.1 mol/L戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、癸烷磺酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠溶液）对AGs兽药的提取效果。结果表明，在提取过程中，离子对试剂碳链越长（癸烷磺酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠），产生的泡沫越多，难以消除，导致无法涡旋振荡提取，固相萃取净化时过柱慢，且在浓缩时有白色残渣析出，提取回收率较低（＜35%）；采用戊烷磺酸钠溶液提取时，所有组分均能出峰，除潮霉素B回收率（＜45%）偏低外，其余组分回收率（60%～120%）良好；采用己烷磺酸钠溶液提取时，所有组分亦均能出峰，除链霉素、双氢链霉素、壮观霉素、奈替霉素和小诺霉素回收率（10%～60%）偏低外，其余组分回收率（60%～120%）良好。因此，为保证所有组分能达到更好的提取效果，本研究采用戊烷磺酸钠和己烷磺酸钠组合溶剂作为提取剂。
比较不同浓度的组合溶剂（0.02 mol/L戊烷磺酸钠-0.02 mol/L己烷磺酸钠溶液、0.05 mol/L戊烷磺酸钠-0.05 mol/L己烷磺酸钠溶液、0.1 mol/L戊烷磺酸钠-0.1 mol/L己烷磺酸钠溶液、0.2 mol/L戊烷磺酸钠-0.2 mol/L己烷磺酸钠溶液）对AGs兽药的提取效果。结果表明，随着提取剂浓度的升高，各组分的回收率也升高，提取剂浓度大于0.05 mol/L时，各组分回收率良好，提取效果较理想。因此，本研究采用组合溶剂0.05 mol/L戊烷磺酸钠-0.05 mol/L己烷磺酸钠溶液，通过离子对与蛋白质竞争性结合待测组分，将AGs兽药从蛋白质中释放出来。此外，为更好地降低基质效应，减小蛋白质对待测组分的干扰，本研究加入三氯乙酸沉淀蛋白，提供酸性环境，更有利于AGs兽药提取。
2.4 净化条件优化
目前，最常用的兽药残留检测前处理净化方法为固相萃取法和QuEChERS方法。AGs兽药极易溶于水，宜采用水溶液进行提取，若采用QuEChERS方法净化，水溶液难以浓缩，而兽药残留检测为痕量分析，未经浓缩的样品溶液可导致方法检出限偏低，达不到检测灵敏度要求。因此，本研究拟采用固相萃取法。AGs兽药为弱碱性有机物，宜采用反相固相萃取法或阳离子交换固相萃取法。本研究以16 种AGs兽药的混合标准溶液（1 μg/mL）考察不同品牌、不同填料、不同规格固相萃取柱的净化效果。如表3所示，Oasis MCX柱（150 mg，6 mL）、Bond Elut-Pba柱（100 mg，3 mL）对所有组分均无保留，Oasis WCX柱（500 mg，6 mL）对其中9 种组分（潮霉素B、双氢链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、安普霉素、妥布霉素、壮观霉素、巴龙霉素、异帕霉素）有保留；Bond Elut-C18柱对其中11 种组分（双氢链霉素、卡那霉素、安普霉素、庆大霉素、妥布霉素、新霉素、巴龙霉素、小诺霉素、西索米星、奈替米星、依替米星）有保留；HLB填料对16 种AGs兽药均有保留，当填料规格200 mg、柱容量6 mL时，各组分回收率良好。故本研究采用Waters Oasis HLB固相萃取柱（200 mg，6 mL）作为AGs兽药净化的固相萃取柱。
表3 AGs兽药在不同品牌、不同填料、不同规格固相萃取柱中的保留数量和回收率
Table 3 Ability of different brands, fillers and specifications of SPE column to retain AGs and their effects on the recovery of AGs
注：品牌1. Agilent；品牌2. Waters；品牌3. SHIMSEN。
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2.5 基质效应分析
本研究通过空白基质加标法对牛肉中的基质效应进行评价。如图2所示，牛肉基质中，只有丁胺卡那霉素表现为基质增强效应，基质效应为8.5%，其他AGs兽药均表现为基质抑制效应，基质效应为-77.2%～-23.7%，其中潮霉素B、卡那霉素、庆大霉素、新霉素、壮观霉素、奈替米星和依替米星基质效应绝对值均小于50%，而链霉素、双氢链霉素、安普霉素、妥布霉素、巴龙霉素、小诺霉素、西索米星和异帕米星基质效应绝对值大于50%。因此，本研究采用空白基质溶液配制标准曲线溶液，以消除基质效应影响，提高定量分析结果的准确性。
图2 牛肉基质中16 种AGs兽药的基质效应
Fig. 2 Matrix effects of 16 AGs in beef
2.6 方法学验证
2.6.1 线性关系、检出限和定量限
采用阴性牛肉样品制备空白基质标准曲线溶液，按优化条件进行测试，以目标物定量离子的质谱图峰面积（y）为纵坐标、相应的空白基质标准工作溶液质量浓度（x，ng/mL）为横坐标，绘制标准曲线，得到16 种AGs兽药的线性回归方程和相关系数，分别以信噪比（RSN）＝3和RSN＝10计算检出限和定量限，如表4所示。结果表明，16 种AGs兽药在25～750 µg/kg范围内线性关系良好，相关系数r均大于0.990，检出限为0.006～0.609 µg/kg，定量限为0.02～1.83 µg/kg，满足AGs兽药的检测要求。
表4 16 种AGs兽药的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限
Table 4 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients,LOD and LOQ for 16 AGs
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2.6.2 准确度和精密度
在空白牛肉基质样品中，进行3 个水平（100、250、375 µg/kg）的加标回收实验，每个加标水平平行测定6 次。如表5所示，16 种AGs兽药的平均加标回收率为69.09%～115.50%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.04%～16.58%（n＝6），方法具有良好的准确度与精密度。
表5 16 种AGs兽药的平均加标回收率及RSDs（n＝6）
Table 5 Average spiked recoveries and RSDs of 16 AGs (n = 6)
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2.7 实际样品检测
在广西省内随机选取牛肉样品100 批次，采用本方法对样品中16 种AGs兽药进行检测，100 批次样品中均未检出AGs。
3 结 论
本研究基于超高效液相色谱-串联质谱建立了牛肉中16 种AGs兽药残留的测定方法。通过选择合适的色谱柱，采用三氯乙酸沉淀蛋白，以组合溶剂0.05 mol/L戊烷磺酸钠-0.05 mol/L己烷磺酸钠溶液作为提取剂，HLB固相萃取柱富集净化，实现了16 种AGs兽药的有效提取、保留和准确定量分析。本方法提取效率高、净化效果好、灵敏度高、准确度和精密度良好，适用于牛肉中16 种AGs兽药的同时测定。
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