香茅草（Cymbopogon citratus）是指禾本科植物香茅的全草[1]，其呈特殊柠檬香味，又被称作柠檬草。香茅草广泛分布于热带、亚热带地区，如巴西、印度、泰国等[2]。在我国集中分布在广东、广西、云南、海南等地区[3]。香茅草应用历史悠久、应用场景广泛。在传统应用场景中，香茅草常被用作烹调作料，以及用于制茶、入药。随着现代工业的进步，人们还利用香茅草精油中的香茅醛、香叶醇、柠檬醛等有效成分的抗氧化、清除自由基等功效[4-8]，制备化妆品[9]、保鲜剂、食品添加剂、消毒制剂、杀虫剂[10]等。
现有的香茅草精油提取方法有水蒸气蒸馏法、索氏提取法、超临界CO2萃取法等[11-12]。其中，水蒸气蒸馏法提取香茅草精油设备及操作简单，但提取率较低[13]；索氏提取法虽然提取率较高，但操作过程中加入的丙酮试剂会污染精油中有效成分；超临界CO2萃取法虽然能保护有效成分不受污染，但操作中所需的高压设备成本较大[14]。用超声辅助水蒸气蒸馏法提取香茅草精油不仅可以提高精油的出油率，还具有水蒸气蒸馏法提取时间短、操作简单的优点。
香茅草精油优良的抑菌性[15]及抗氧化性使其被应用于食品贮藏。唐森等[16]研究发现，添加香茅草的冷却猪肉糜能获得更长贮藏期，表明香茅草对冷却猪肉糜在贮藏过程中有保鲜作用。苏荣镇等[17]发现，添加香茅草提取物的鸡肉肠在氧化过程中氧化程度降低，且鸡肉肠硬度有所下降。程作慧等[18]通过测定香茅草微乳液的外观性状、稳定性、粒径、透明温度区间和抑菌活性，发现表面活性剂选用吐温-80、助表面活性剂选用无水乙醇、表面活性剂与助表面活性剂质量比为1∶5的香茅草精油微乳液增溶效果最好，透明温度介于-5～71 ℃之间，粒径大多为40～60 nm，抑菌性能明显。
柠檬醛是香茅草精油中的主要成分，刘家欣等[19]从湘西生长的香茅草提取精油中分析检测出其柠檬醛质量分数为39.12%；谢丽莎等[20]从广西南宁生长的香茅草提取精油中检测出柠檬醛质量分数为48.33%；杨欣等[21]从四川香茅草提取精油中分析检测出柠檬醛质量分数为42.48%。柠檬醛不仅有抑菌性能，也具有强抗氧化能力。Erkan等[22]发现富含柠檬醛的柠檬精油能有效抑制鲭鱼的脂质氧化，具体表现为更低的过氧化值和硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值。Khaledian等[23]研究表明，含有柠檬醛的柠檬皮提取物可延长白虾货架期，且在贮藏期间白虾的TBARS值显著降低。García-Márquez等[24]研究表明，香茅草精油的抗菌性可以预防鱼体中细菌的快速生长，提高鱼体的潜在抗病性。
柠檬醛作为一种天然无毒的高生物活性物质，化学结构不稳定，在酸性和氧化条件下易分解[25-26]。柠檬醛通常不单独作保鲜剂使用，但是许多含有柠檬醛的精油被用于水产品保鲜。TBARS值表示不饱和脂肪酸的氧化程度；总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量表示蛋白质被分解的程度，是反映鱼类鲜度的主要指标；K值也是反映鱼类鲜度的重要指标。本研究采用超声辅助水蒸气蒸馏法提取香茅草精油，并应用正交试验对提取工艺进行优化。实验通过测定主要成分为柠檬醛的香茅草精油乳液对金鲳鱼贮藏过程中TBARS值、TVB-N含量及K值的影响验证香茅草精油在金鲳鱼贮藏中的保鲜作用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
香茅草鲜草于2023年9月购于海南省万宁兴隆兴香香料作物种植场。金鲳鱼（Trachinotus ovatus）于2023年9月购于海南省三亚市胜利路旺豪超市，充氧后以活体状态运输至实验室。
吐温-80（食品级） 广州康本生物技术有限公司；中链甘油三酯（食品级） 武汉华翔科洁生物技术有限公司；石油醚（分析纯） 广州化学试剂有限公司；硫酸、硫酸铜、硫酸钾、硼酸（均为分析纯） 上海国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
SH220石墨消解仪 济南海能仪器股份有限公司；DHG9070A电热恒温鼓风干燥箱 杭州蓝天仪器有限公司；SZF-06A粗脂肪测定仪、SHZ-S（III）循环水真空泵上海力辰邦西仪器科技有限公司；R E-5 2 A A 旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；DTY-A220电子天平华志（福建）电子科技有限公司；UV5105紫外-可见分光光度计 安徽皖仪科技股份有限公司；K1100全自动凯氏定氮仪 济南海能未来技术集团股份有限公司；SCIENTZ-II D超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；FSH-2A高速均质机 常州越新仪器制造有限公司；Ultimate 3000 RSLCnano高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 美国赛默飞世尔科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 香茅草营养成分测定
1.3.1.1 水分含量测定
参照赵建芬等[3]的方法。称取5.0 g香茅草，置于干燥至恒质量的称量瓶中，于70 ℃烘箱中干燥5 h，恢复至室温，称其质量；再于上述条件干燥1 h，恢复至室温后称质量，直至2 次称量差低于2‰。香茅草的水分含量按式（1）计算：
式中：m1为称量瓶和试样质量/g；m2为称量瓶和试样干燥后质量/g；m3为称量瓶质量/g。
1.3.1.2 脂肪含量测定
参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》[27]中索氏提取法测定。称取2.0 g香茅草，放入滤纸片筒中，然后将滤纸片筒置于脂肪抽提器的抽提筒内，并设定抽提温度为70 ℃。在冷凝管上端注入石油醚，至瓶内2/3时开始抽提，石油醚回流抽提速率为6～8 次/h，抽提时间为3～4 h。抽提完成后，从接收瓶中取出样品袋，并置于电热鼓风干燥箱中风干12 h后称其质量。脂肪含量按式（2）计算：
式中：m4为接收瓶和粗脂肪质量/g；m5为试样质量/g；m0为接受瓶质量/g。
1.3.1.3 蛋白质含量测定
参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》[28]中凯氏定氮法测定。将新鲜香茅草置于70 ℃烘箱中干燥后粉碎，称取2.0 g香茅草粉末，在250 mL消化管中依次加入香茅草粉末、0.4 g硫酸铜、6.0 g硫酸钾及20 mL硫酸，将其置于消化炉内消化后，温度设定为420 ℃，当炉内温度达到420 ℃后，继续消化1 h；对凯氏定氮仪进行清洗和调整，安装装有消化液的消化管，自动测试，选择2%（V/V）硼酸溶液20 mL、40%（V/V）氢氧化钠溶液40 mL，蒸馏时间为5 min。按式（3）、（4）计算氮含量和粗蛋白含量：
式中：m6为样品质量/g；c为标准酸浓度/（mol/L）；V为消耗标准酸体积/mL；V0为空白消化标准酸体积/mL。
1.3.1.4 碳水化合物含量测定
参考朱照武等[29]的方法，采用卡路里分析仪进行测定。
1.3.2 香茅草精油的提取
参考王利利等[30]的方法。按1.3.1.3节方法制备香茅草粉末，称取10.0 g粉末置于圆底烧瓶中，按一定料液比加入蒸馏水、无水乙醇，混合均匀，浸泡5 h，设定超声时间、超声功率，将浸泡好的香茅草粉末放入超声波细胞粉碎机中超声处理，并进行水蒸气蒸馏。蒸馏结束后，对提取的香茅草精油进行干燥处理。香茅草精油得率按式（5）计算：
式中：m7为香茅草精油质量/g；m8为在干基条件下称取的香茅草粉末质量/g。
1.3.3 单因素试验
称取10.0 g香茅草粉末，在添加无水乙醇100 mL、浸泡5 h、蒸馏温度85 ℃的条件下蒸馏提取，分别考察料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，g/mL）、超声时间（10、15、20、25、30 min）、超声功率（100、140、180、220、260 W）对香茅草精油得率的影响，确定最佳提取条件。
1.3.4 正交试验
在单因素试验基础上，以香茅草精油得率为评价指标，选择料液比、超声功率和超声时间3 个因素进行L9（34）正交试验，确定最佳条件，各因素及水平如表1所示。
表1 正交试验因素水平
Table 1 Code and level of independent variables used for orthogonal array design
水平A料液比（g/mL）B超声时间/minC超声功率/W 1 1∶2020240 2 1∶2525260 3 1∶3030280
1.3.5 香茅草精油乳液的制备
参考Chu Yifu[31]、刘钱媛[32]等的方法制备香茅草精油乳液。将质量分数10%的香茅草精油和质量分数1%的吐温-80乳化剂在中链甘油三酯中溶解后磁力搅拌10 min，与去离子水按1∶10（V/V）混合，在高速均质机中以10 000 r/min均质10 min，所得乳液经超声（功率400 W，时间9 min）乳化后得香茅草精油乳液。
1.3.6 金鲳鱼预处理
将鲜活金鲳鱼碎冰致死，去除鱼头部、尾部和内脏，用生理盐水清洗鱼体以清除剩余黏液和血液，取其背部肌肉，每组样品10.0 g。将金鲳鱼样品分别浸泡在体积为鱼样品10 倍的空白乳液、香茅草精油乳液中15 min，并以未浸泡处理作为对照组。排出多余的液体后，将浸泡过的样品装入无菌密封袋中，保存在冰箱中（4 ℃、12 d），每2 d测定一次。
1.3.7 金鲳鱼TBARS值的测定
参考Xu Nan等[33]的方法。将2.0 g金鲳鱼样品与18 mL含有0.1 g/100 mL乙二胺四乙酸二钠的7.5 g/100 mL三氯乙酸溶液混合，在高速均质机中以15 000 r/min均质3 min，所得均质液离心（4 ℃、10 000 r/min）10 min，取上清液、0.02 mol/L硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）溶液各5 mL，混匀，于90 ℃水浴加热60 min后冰浴冷却。参照GB 5009.181—2016《食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定》[34]中的方法用1,1,3,3-四乙氧基丙烷配制丙二醛标准系列溶液。采用分光光度计，将TBA溶液作空白对照以测定样液及标准系列溶液在532 nm波长下的吸光度，以标准系列溶液的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并以此标曲测定试样中的TBARS含量。TBARS含量以丙二醛质量计，按式（6）计算：
式中：ρ0为从标准曲线中得到的试样溶液中丙二醛质量浓度/（μg/mL）；V1为试样溶液定容体积/mL；m9为最终试样溶液所代表试样质量/g。
1.3.8 金鲳鱼TVB-N含量的测定
参考Hu Zhiheng等[35]的方法。取2.0 g样品与18 mL高氯酸溶液（0.6 mol/L）混合，以15 000 r/min的转速均质3 min，将均质液在4 ℃环境以10 000 r/min离心10 min，取10 mL上清液加入到消化管中并添加1.0 g MgO，同时以高氯酸溶液作为空白对照。使用全自动凯氏定氮仪测定TVB-N含量，结果以每100 g样品的氮毫克数（mg/100 g）表示。
1.3.9 K值的测定
参考Hu Yaqin等[36]的方法，收集样品中的核苷酸降解产物三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphatc，ADP）、单磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）、肌苷酸（inosinic acid，IMP）、次黄嘌呤核苷（inosine，HxR）和次黄嘌呤（hypoxanthine，Hx），即取1.0 g样品与10 mL体积分数5%高氯酸溶液混合并用无菌剪刀剪散，滴加KOH溶液（1 mol/L）调整混合液的pH值至2.0～3.5，加入纯水定容至20 mL；将定容液通过0.45 μm滤膜过滤，滤液通过HPLC仪测定其中的核苷酸降解产物含量[37]：HPLC条件：色谱柱：C8色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温35 ℃；进样量20 μL；流动相A为0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液；流动相B为0.02 mol/L磷酸氢二钾溶液；流速1.0 mL/min；紫外检测器。ATP、ADP、AMP、IMP、HxR检出限为5.00 mg/kg；Hx为2.50 mg/kg。ATP、ADP、AMP、IMP、HxR定量限为10.0 mg/kg，Hx为5.00 mg/kg。K值按式（7）计算：
式中：mATP、mADP、mAMP、mIMP、mHxR、mHx为样品中ATP、AMP、ADP、IMP、Hx、HxR含量/（mol/g）。
1.4 数据处理
每组实验设置3 个重复，取平均值，结果以平均值±标准偏差表示，采用Origin 2022软件进行绘图，采用SPSS 27.0软件进行方差分析，显著性水平设置为P＜0.05。
2 结果与分析
2.1 香茅草原料营养成分测定结果
本实验所用香茅草原料营养成分中水分质量分数为香茅草鲜质量的（8 4.9 8±2.0 4）%；脂肪、粗蛋白、碳水化合物质量分数分别为香茅草干质量的（5.45±0.33）%、（7.29±0.07）%、（25.10±0.30）%。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 料液比对精油得率的影响
通常情况下，随着溶液占比的提高，物料在水溶液中会分散更充分、反应进行会更彻底；然而，这种增长效果有限，当溶液占比提高到一定程度时，水分散效果会得到限制，反而会影响其反应的充分性，降低精油得率。由图1可知，随着溶液占比不断提高，香茅草精油得率逐渐增加。当料液比达到1∶25时，精油得率最大。而后，随着溶液占比继续提高，香茅草精油得率则开始降低。因此，在使用超声辅助的水蒸气蒸馏法提取香茅草精油时，选择料液比为1∶25可以提高香茅草精油得率。
图1 料液比对香茅草精油得率的影响
Fig.1 Effect of solid-to-solvent ratio on the yield of citronella essential oil
小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。图2、3同。
2.2.2 超声时间对精油得率的影响
由图2可知，在超声时间为10～25 min时，随着超声时间延长，香茅草精油得率升高；当超声25 min时，香茅草精油得率达到最大值；超声时间超过25 min后，香茅草精油得率随着超声时间的延长而减小。原因可能是，超声10～25 min时，精油扩散随超声时间延长变得更加充分，提取率随之升高；当时间超过25 min时，精油中部分不稳定成分被破坏、挥发，乳化程度加剧，产量下降。因此，选择最佳超声处理时间为25 min。
图2 超声时间对香茅草精油得率的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic time on the yield of citronella essential oil
2.2.3 超声功率对精油得率的影响
由图3可知，超声功率在100～260 W时，香茅草精油得率随超声功率的升高而升高；与超声功率220 W相比，260 W时的精油得率显著提高（P＜0.05）。超声波在化学介质中传播后，其热力学特性被用于破坏物质细胞结构，对有机溶剂和萃取液的相互混合也有促进作用，萃取液在有效部位的得率也随之升高，对温度变化产生了瞬间稳定和提高效应，对热不稳定成分影响较小。因此，使用超声波处理可极大程度上缩短精油提取时间、改善提取效果。当超声功率为260 W时，香茅草精油的得率达到最大，为5.76%。
图3 超声功率对香茅草精油得率的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic power on the yield of citronella essential oil
2.3 正交试验结果
根据单因素试验结果可知，相对较优的料液比为1∶25、超声时间为25 min、超声功率为260 W，以此为基础设计正交试验，结果如表2所示。RA＞RC＞RB，料液比对精油提取率影响最大，其次是超声功率、超声时间。当料液比1∶30、超声时间25 min、超声功率280 W时，香茅草精油的提取率最低，为5.10%；当料液比1∶25、超声时间30 min、超声功率260 W时，香茅草精油提取率最高，为6.77%。所以香茅草精油提取的最佳工艺为：A2B3C2，即料液比1∶25、超声时间30 min、超声功率260 W。
表2 正交试验结果
Table 2 Orthogonal array design with experimental results
试验号A料液比B超声时间/min C超声功率/W 香茅草精油得率/%11∶20202406.40 21∶20252606.50 31∶20302806.13 41∶25252406.73 51∶25302606.77 61∶25202806.30 71∶30302406.33 81∶30202606.20 91∶30252805.10 K16.346.306.48 K26.606.116.49 K35.846.415.84极差（R）0.760.300.65
2.4 香茅草精油乳液对金鲳鱼贮藏期间TBARS值的影响
TBARS值反映脂质氧化成熟度。金鲳鱼含有丰富的不饱和脂肪酸，在贮藏期间极易发生氧化，进而导致变质。由图4可知，3 组样品的TBARS值均呈上升趋势，但上升趋势为未处理组＞空白乳液组＞香茅草精油乳液组。表明空白乳液和香茅草精油乳液均有一定抗氧化作用。空白乳液的抗氧化机制主要表现为与过渡金属离子催化剂结合、与自由基相互作用及对过氧化物的降解作用[38]。柠檬醛除抑菌性能外，也具有较强抗氧化能力。香茅草精油乳液中含有大量柠檬醛，在抗氧化性方面，香茅草精油与乳液有协同增强作用。
图4 金鲳鱼贮藏期间TBARS值变化
Fig.4 Changes in TBARS value of gold pomfret during storage
大写字母不同表示相同贮藏时间、不同处理组间差异显著（P＜0.05）；小写字母不同表示不同贮藏时间、相同处理组间差异显著（P＜0.05）。图5、6同。
2.5 香茅草精油乳液对金鲳鱼贮藏期间TVB-N含量的影响
TVB-N指蛋白质和氨基酸因内源酶和微生物的降解作用而产生的碱性含氮物质，其含量可反映肉品含氮物质的降解及营养破坏情况[39]。在鱼类贮藏期间，随着时间的延长，微生物降解鱼肉的程度加深，TVB-N含量不断提高。由图5可知，在贮藏前期，3 组样品中TVB-N含量无显著差异，但随着贮藏时间的延长，各组样品的TVB-N含量均升高，且升高速率为未处理组＞空白乳液组＞香茅草精油乳液组。香茅草精油乳液处理组TVB-N含量增长速率明显低于另外2 组，表明经香茅草精油乳液处理可以有效抑制金鲳鱼贮藏期间TVB-N含量的增长。对比香茅草精油乳液组和空白乳液组样品的TVB-N含量变化，发现加入香茅草精油乳液样品的TVB-N含量均低于空白乳液组，表明香茅草精油可以抑制腐败微生物分解蛋白质，从而在金鲳鱼的贮藏保鲜方面起积极作用。类似的结果也在鲅鱼鱼糜的保鲜研究中有所发现，即含有柠檬醛的乳液可显著降低水产品贮藏过程中的TVB-N含量增长[40]。
图5 金鲳鱼贮藏期间TVB-N含量变化
Fig.5 Changes in TVB-N content of gold pomfret during storage
2.6 香茅草精油乳液对金鲳鱼贮藏期间K值的影响
K值是目前评价鱼类新鲜度的公认指标，K值越低表明鱼肉新鲜度越高。一般而言，K值低于20%的鱼肉被认定为非常新鲜，而K值＞40%的鱼肉已不宜食用[41]。由图6可知，在贮藏过程中，金鲳鱼的K值随贮藏时间的延长不断升高，升高速率为未处理组＞空白乳液组＞香茅草精油乳液组。空白乳液组在贮藏第4天时K值就接近40%，在第6天时超过40%；而香茅草精油乳液组在第10天时K值才达到40%，表明香茅草精油乳液对K值的增长有延缓作用。Ahmad等[42]关于柠檬草精油保鲜鲈鱼的研究也得出类似研究结果。结果表明，香茅草精油乳液可延缓K值的增长并维持金鲳鱼新鲜度。
图6 金鲳鱼贮藏期间K值变化
Fig.6 Changes in K value of gold pomfret during storage
3 结 论
本研究在香茅草和水的料液比、超声辅助水蒸气蒸馏时间、超声功率等单因素试验的基础上进行正交试验，对超声辅助水蒸气蒸馏法提取香茅草精油的工艺条件进行优化。以香茅草精油提取率为优化指标，得出其最佳工艺条件为料液比1∶25、超声时间30 min、超声功率260 W。在此工艺条件得到的香茅草精油的平均提取率为6.77%。柠檬醛是香茅草精油的主要成分，是一种高生物活性物质，具有抗氧化性和保鲜作用。测定香茅草精油乳液浸泡后金鲳鱼贮藏期间的TBARS值、TVB-N含量和K值的变化，结果发现，与未处理组和空白乳液组相比，香茅草精油乳液组TBARS值、TVB-N含量和K值均明显降低，表明香茅草精油乳液对金鲳鱼有保鲜作用。
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