风干肠是一种发酵肉制品，制作过程包括前期原料肉绞碎、腌制、灌肠，后期发酵、风干和成熟等加工步骤。近年来，研究报道显示，除了常见的猪肉、羊肉和牛肉外[1-3]，还有利用鱼肉进行发酵加工的肠产品[4-5]。
前期的研究[6]表明，在鲶鱼肉风干肠加工过程中添加一定量的香辛料精油有利于改善其质量，并提高食品安全性，但在自然条件下发酵的风干肠易受环境因素的影响，自然发酵的产品品质不稳定，不适合工厂大批量生产。乳酸菌作为肉制品发酵过程中的主要菌种之一，被广泛认可为安全微生物，是食品生产过程中广泛使用的益生菌[7-8]。通过向革胡子鲶鱼肉馅中接种乳酸菌可以调节风干肠发酵初期的微生物环境，抑制腐败微生物的生长，从而改善产品品质。目前已有大量研究[9-10]证明乳酸菌在发酵肉制品中能分解亚硝酸盐，发酵产生的有机酸能影响微生物生长。
因此，拟将前期筛选出的对发酵肉制品作用效果较好的乳酸菌发酵剂PRO-MIX5与八角精油、紫苏精油一起添加在鲶鱼肉风干肠中，测定风干肠理化性质，分析乳酸菌发酵剂搭配香辛料精油对风干肠安全性的提升效果，本研究旨在提高风干肠的可食用性，使风干肠的制作工艺更加适应工厂化生产。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
革胡子鲶鱼（体质量（1.5±0.1）kg） 天津市红旗农贸综合水产批发市场；紫苏精油 吉安市青原区利康天然香料油有限公司；八角精油 顶兴（天津）食品科技发展有限公司；乳酸菌发酵剂PRO-MIX5（木糖葡萄球菌、清酒乳杆菌、类植物乳杆菌） 意大利萨科公司；30 mm胶原蛋白肠衣 梧州神冠蛋白肠衣有限公司。
N-亚硝胺标准品 美国Supelco公司；生物胺标准品美国Sigma公司；三氯乙酸、氯化钾、亚铁氰化钾盐酸、硫代巴比妥酸、亚硝酸钠、二氯甲烷（色谱纯）、乙腈（分析纯）、三氯甲烷（分析纯） 天津风船化学试剂科技有限公司；高氯酸、丹磺酰氯、丙酮 国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
T25高速分散机 德国IKA公司；LC-CCA冷却液循环泵、SHZ-D循环水式真空泵 上海力辰仪器科技有限公司；HD-4智能水分活度测量仪 迪乐电子仪器科技有限公司；Climacell恒温恒湿箱 艾力特国际贸易有限公司；BVBJ-30F真空搅拌机、BJRJ-82绞肉机 浙江嘉兴艾博实业有限公司；STARTER 3100实验室pH计奥豪斯仪器（上海）有限公司；ST-40R冷冻离心机德国Thermo Fisher公司；DZKW-S-6电热恒温水浴锅亿捷科技公司；CM-5分光测色计 日本柯尼卡美能达公司；7890A气相色谱仪、1260高效液相色谱仪 美国Agilent公司。
1.3 方法
1.3.1 鲶鱼肉风干肠制作
参考陈援援等[11]的方法，对风干肠工艺进行调整。革胡子鲶鱼→冰浴致晕→宰杀（去内脏、鱼皮）→取肉→清洗→鱼肉绞碎→真空搅拌→加入辅料（1.8%食盐、0.055%抗坏血酸钠和0.01%亚硝酸钠）→肉馅表面覆保鲜膜→4 ℃下腌制24 h→二次真空搅拌（肉馅、0.2%味精、0.3%酱油、4%白砂糖、1.5%曲酒、10%水和0.03%香辛料精油（八角精油、紫苏精油质量比1∶1））→搅拌8 min→灌肠→24 ℃发酵12 d。其他参数如表1所示。
表1 鲶鱼肉风干肠发酵过程中的相对湿度和风扇转速
Table 1 Relative humidity and fan speed during the fermentation process of dried catfish sausages
时间/d相对湿度/%时间/d风扇转速/%1 301～3100 2 70490 3 75580 4～12806～1270
1.3.2 实验分组
按照1.3.1节制作方法，在调味过程中，一组以质量比1∶1的比例复配添加八角精油和紫苏精油（AP组），精油总添加量为前期实验选出的0.03%（以肉质量计）；另一组在添加精油的基础上，添加0.02%（以肉质量计）经灭菌乳活化后的发酵剂PRO-MIX5（AP-PRO组）。在第12天完成风干后，测定成熟产品各项理化指标。
1.3.3 指标测定
1.3.3.1 水分质量分数、水分活度测定
使用GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中的直接干燥法测定风干肠的水分质量分数。将风干肠绞碎后均匀平铺在玻璃测量皿底部，使用水分活度测量仪测定样品水分活度。
1.3.3.2 pH值测定
采用GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》方法对鲶鱼肉风干肠的pH值进行测定。
1.3.3.3 硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值测定
参考张雨婷等[6]的方法，取5 g风干肠与15 mL 7.5 g/100 mL三氯乙酸溶液混合，冰浴匀浆（13 000 r/min、30 s），过滤，取2.5 mL上清液与2.5 mL 0.02 mol/L 2-硫代巴比妥酸溶液混合，摇匀，沸水浴40 min后冰浴降温，再加入7.5 mL三氯甲烷离心（2 000×g、10 min），于532 nm波长处测定吸光度（A532 nm）。TBARS值按式（1）计算：
式中：V为样品体积/mL；M为丙二醛分子质量/（g/mol）；ε为摩尔吸光系数（1.56×105 L/（mol·cm））；L为光学路径长度（1 cm）；m为样品质量/g。
1.3.3.4 亚硝酸盐残留量测定
参考GB 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》。
1.3.3.5 乳酸菌数、肠杆菌科数、假单胞菌数测定
将无菌生理盐水与风干肠按质量比9∶1混匀，无菌均质器拍打5 min，梯度稀释10 倍备用。
向无菌平皿中加入1 mL适宜浓度的样品匀液，分别加入假单胞菌CFC鉴别琼脂、MRS培养基、结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂，于36 ℃培养。其中，肠杆菌科培养1 d后取出计数，其余样品2 d后取出计数。
1.3.3.6 生物胺含量测定
样品前处理：取风干6、12 d的5 g风干肠与20 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液混合，低温匀浆30 s，重复离心2 次（4 000 r/min、10 min）后过滤，将滤液移入50 mL容量瓶，用上述高氯酸溶液定容。
标准溶液和样品的衍生化：向试管中加入饱和碳酸氢钠溶液0.3 mL、2 mol/L氢氧化钠溶液0.2 mL，以及生物胺标准溶液与样品溶液各1 mL，再加入2 mL 10 mg/mL丹磺酰氯溶液，40 ℃水浴0.5 h后加入0.1 mL氨水，将混合液移入5 mL容量瓶，乙腈定容，离心（4 ℃、5 000 r/min、5 min），过滤后检测。
高效液相色谱检测条件： 色谱柱选用Agilent ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×150 nm，5 μm）；流动相A为水，流动相B为乙腈；进样量20 μL；流速1 mL/min；柱温30 ℃；紫外检测波长254 nm。梯度洗脱程序：0 min，80% A；0～3 min，80%～65% A；3～10 min，65% A；10～16 min，65%～10% A；16～25 min，10%～0% A；25～27 min，0% A；27～35 min，80% A。
以生物胺标准溶液质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线。样品中生物胺含量按式（2）计算：
式中：ρ为样品溶液中生物胺质量浓度/（mg/L）；V为样品溶液体积/mL；n为稀释倍数；m为样品质量/g。
1.3.3.7 N-亚硝胺含量测定
取风干12 d的风干肠样品，按照GB 5009.26—2016《食品安全国家标准 食品中N-亚硝胺类化合物的测定》中的气相色谱-质谱法测定。
1.4 数据处理
用Excel 2021和IBM SPSS Statistics 21.0软件进行数据整理和差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。用Origin 2021软件作图。
2 结果与分析
2.1 精油复配乳酸菌对鲶鱼肉风干肠成熟过程中水分质量分数和水分活度的影响
由图1可知，随着成熟过程的进行，鲶鱼肉风干肠中的水分质量分数和水分活度均呈明显下降趋势，AP组和AP-PRO组的水分质量分数分别由初始的69.04%和68.05%降至27.39%和26.06%，接近李国柱等[12]添加乳酸菌发酵剂生产的发酵肠的水分质量分数（25%）。水分活度由初始的0.889和0.893降至0.746和0.751，低于大多数香肠中腐败菌生长所需水分活度[13]。赵佳莹等[14]发现，牦牛肉发酵香肠在发酵初期水分质量分数迅速下降，大量自由水蒸发，到了成熟后期自由水减少，与蛋白质结合紧密的结合水开始蒸发，水分质量分数下降变慢，与研究结果趋势一致。同时，水分活度的降低可能与pH值有关，酸性环境使肌肉蛋白发生变性，造成肠表面的水分进一步蒸发，使水分活度降低[15]。
图1 鲶鱼肉风干肠成熟过程中水分质量分数（A）和水分活度（B）的变化
Fig.1 Changes in moisture content (A) and water activity (B) during the maturation process of dried catfish sausages
小写字母不同表示不同时间差异显著（P＜0.05）。图2～5同。
2.2 精油复配乳酸菌对鲶鱼肉风干肠成熟过程中pH值的影响
如图2所示，2 组鲶鱼肉风干肠成熟过程中pH值的变化趋势一致，首先在3 d前迅速降低至5.4以下，在3～6 d内pH值变化较小，在9 d时pH值相比3～6 d时显著升高（P＜0.05），与同类型产品研究结果[11,16]相似。蔡永敏等[17]发现，猪肉发酵香肠在3～6 d干燥期间，温度和湿度的下降对乳酸菌的代谢活性有一定的影响；同时，能产氨类等碱性物质的酶活性增大，产品pH值略有升高。陈援援等[11]在筛选发酵剂时发现，AP-PRO组的pH值在成熟过程中显著高于其他处理组，说明PRO-MIX5组乳酸菌产酸能力相比其他商业乳酸菌发酵剂较弱。鲶鱼肉风干肠在成熟12 d时，AP-PRO组的pH值高于AP组。总的来看，2 种处理方法制备的风干肠pH值均低于5.4，酸性环境能抑制有害微生物的生命活动，使风干肠的安全性得到提高。
图2 鲶鱼肉风干肠成熟过程中pH值的变化
Fig.2 Changes in pH during the ripening process of dried catfish sausages
2.3 精油复配乳酸菌对鲶鱼肉风干肠成熟过程中TBARS值的影响
脂肪氧化是鲶鱼肉风干肠中一些风味物质的产生原因之一，TBARS值能反映脂肪氧化程度，有时适当的氧化可以令产品风味丰富，但是过度氧化会产生不良风味。由图3可知，0～6 d时TBARS值呈现上升趋势，在9 d时AP-PRO组的TBARS值开始低于AP组，说明接种乳酸菌能抑制风干肠中脂肪氧化，有利于特有风味的生成。郭玲玲[18]将植物乳杆菌6003接种到发酵香肠中，发现乳酸菌能够显著降低发酵香肠中的TBARS值。可能是接种乳酸菌发酵剂后，乳酸菌产生过氧化氢酶并分解过氧化氢，降低氧化作用，抑制发酵肉制品中的脂质氧化。
图3 鲶鱼肉风干肠成熟过程中TBARS值的变化
Fig.3 Changes in TBARS value during the maturation process of dried catfish sausages
2.4 精油复配乳酸菌对鲶鱼肉风干肠成熟过程中亚硝酸盐含量的影响
肉制品生产加工中经常用到亚硝酸盐，它在发酵香肠的感官和理化特性中具有重要作用，还能有效抑制微生物的生长[19-20]。但是，过量的亚硝酸盐残留对人体有害，因为其在肉制品中发色生成的亚硝基化合物对人体有致癌作用[21]。由图4可知，2 组风干肠中亚硝酸盐的残留量在3 d内迅速降低，并在后期的成熟过程中变化较小。除了八角精油和紫苏精油对亚硝酸盐的抑制外，环境中的微生物发酵产酸也对风干肠中亚硝酸盐含量减少作出贡献，因为低酸的环境促进亚硝酸盐还原成NO发色。在9 d时，亚硝酸盐残留量升高，可能是风干肠内的硝酸盐还原菌繁殖较多，将硝酸盐转化成亚硝酸盐。12 d时由于乳酸菌大量繁殖，产生较多乳酸，不利于硝酸盐还原菌的生长，所以亚硝酸盐残留量减少。总的来说，3 d之后2 组样品亚硝酸盐含量均低于国家限量标准的30 mg/kg，在品质安全方面具有一定的保障。
图4 鲶鱼肉风干肠成熟过程中亚硝酸盐含量的变化
Fig.4 Changes in nitrite content during the maturation process of
dried catfish sausages
2.5 精油复配乳酸菌对鲶鱼肉风干肠成熟过程中微生物的影响
由图5A、B可知，风干肠的肠杆菌科和假单胞菌数均呈先上升后下降的趋势。肉制品的腐败大多与肠杆菌科有关，其主要来源于粪便。AP-PRO组的肠杆菌科数在1.5 d左右时超过AP组，在之后的成熟过程中与AP组保持相同的变化趋势。分析原因可能是2 组风干肠中添加的香辛料精油中的某种成分改变了发酵菌株的活力，使风干肠中的优势菌发生变化，从而使肠杆菌科数在前期增长过快。假单胞菌在环境中分布广泛且适应性强，在某些极端环境下也能生存[22]，例如水产品在冷链运输中容易感染假单胞菌，增加腐败几率[23-24]。AP-PRO组的假单胞菌数在3～9 d时明显高于AP组，在12 d时低于AP组。由于风干肠制作时初始发酵温度为24 ℃，并不是乳酸菌生长的最佳温度，反而更适合嗜冷菌的生长，造成乳酸菌在初期不是优势菌，对腐败微生物生长的抑制效果不理想。
图5 鲶鱼肉风干肠成熟过程中肠杆菌科数（A）、假单胞菌数（B）和乳酸菌数（C）的变化
Fig.5 Changes in the numbers of Enterobacteriaceae (A), Pseudomonas (B),and lactic acid bacteria (C) during the maturation process of dried catfish sausages
由图5 C 可知，在0 ～3 d 时乳酸菌生长迅速，3 ～1 2 d 时生长较为缓慢，2 组风干肠分别从初始菌数5.8、5.5（lg（CFU/g））增加到成熟终点的8.4、8.7（lg（CFU/g））。Cenci-Goga等[25]研究认为，通常大于7（lg（CFU/g））的乳酸菌含量被认为是充足的乳酸菌水平，有利于控制早期肉糜中的腐败菌、致病菌的生长繁殖，提升产品的安全性。AP组和AP-PRO组在3 d时乳酸菌数就已达到8.3、8.5（lg（CFU/g）），对有害微生物的抑制具有很大优势。乳酸、乙酸和苯乳酸均能降低酶活、破坏细胞质和细胞壁、抑制蛋白质合成，而乳酸菌通过发酵产生这些有机酸，进而破坏细胞正常代谢，达到抑菌效果[26-27]。
2.6 精油复配乳酸菌对鲶鱼肉风干肠成熟过程中生物胺含量的影响
生物胺是发酵肉制品在加工过程中易形成的化合物。Roselino等[28]研究发现，低浓度的生物胺有利于维持机体部分生理功能和代谢，其以激素或神经递质的形式调节免疫系统和肠道健康。当生物胺摄入过多时，则会导致中毒症状，如头痛、恶心和呼吸困难等，因此对食品中的生物胺进行控制十分有必要。表2显示了2 组风干肠在发酵中期（第6天）与末期（第12天）生物胺的含量，可以看出AP组和AP-PRO组在第12天的生物胺总量均比第6天高，表明随着发酵的进行，2 组风干肠的生物胺出现了积累。风干肠在第6天时未检测到色胺，到第12天时虽有检出，但是AP-PRO组的含量显著低于AP组（P＜0.05），说明乳酸菌对色胺的生成有一定的抑制作用。同时，第12天的苯乙胺、腐胺和精胺含量比第6天时减少，尤其是苯乙胺的含量未达到检测限，这可能与腐败微生物如肠杆菌科数量降低有关。黄岩等[29]认为肠杆菌是产生腐胺和尸胺的主要微生物，12 d时AP-PRO组腐胺的含量高于AP组，与图5A中成熟终点AP-PRO组的肠杆菌科数高于AP组结果一致。组胺和酪胺是毒性最强的2 种生物胺，是评价风干肠安全性的重要指标之一。生物胺的毒性因不同种族、地域和人体内胺类氧化酶等诸多因素的存在而因人而异，因此很难统一标准来衡量其毒性阈值[30]。根据国家规定，水产品中组胺含量应≤20 mg/kg，而2 组风干肠在成熟终点均未超过此限值，说明2 种处理下的风干肠安全性有一定的保障。有研究发现，人体一旦摄入超过100 mg/kg的酪胺会引发偏头痛，而摄入量达到1 080 mg/kg更会让人体严重中毒[31]，本研究中的酪胺含量远低于此值，且在成熟过程中含量变化较小。就对人体健康的危害而言，总生物胺的最高阈值为1 000 mg/kg[32]。鲶鱼肉风干肠的生物胺总量低于此限值，说明其安全品质有一定保障。同时，发酵结束后AP-PRO组生物胺总量相比AP组降低14.5%，且组间差异显著（P＜0.05），说明添加PRO-MIX5乳酸菌后对生物胺抑制效果较好。
表2 鲶鱼肉风干肠成熟过程中生物胺含量的变化
Table 2 Changes in biogenic amine content during the maturation process of dried catfish sausages mg/kg
注：同行小写字母不同表示组间差异显著（P＜0.05）；/.未检出。表3同。
风干6 d风干12 d AP组AP-PRO组AP组AP-PRO组色胺//16.82±1.10a 12.68±0.05b苯乙胺4.09±0.03a4.11±0.07a//腐胺5.44±0.06a5.15±0.03b0.50±0.01b1.12±0.00a尸胺70.61±0.21a 64.15±0.57b 105.20±1.42a 87.09±0.52b组胺0.92±0.00a0.91±0.00b2.27±0.02b5.44±0.02a酪胺1.16±0.01a1.13±0.00b1.17±0.00a1.06±0.00b亚精胺0.91±0.00a0.91±0.01a1.11±0.01a1.10±0.01a精胺3.12±0.01a2.80±0.04b0.92±0.00a0.93±0.01a总量86.26±0.21a 79.18±0.69b 128.00±2.25a 109.43±0.55b生物胺种类
2.7 精油复配乳酸菌对鲶鱼肉风干肠N-亚硝胺含量的影响
N-亚硝胺对人和动物都有潜在危害，在动物体内会导致“三致”[33-34]。发酵肉制品在加工过程中产生的蛋白质、氨基酸及生物胺能作为前体物质转化成亚硝胺。转化方式有2 种，一种是部分前体物质与亚硝化试剂直接生成亚硝胺，第2种是先转化为次级胺类物质，再与亚硝化试剂反应形成亚硝胺[35]。由表3可知，2 组风干肠中N-二甲基亚硝胺、N-亚硝基吡咯烷和N-二丙基亚硝胺均未检出，可能是由于乳酸菌和香辛料都能减少N-二甲基亚硝胺的含量，且乳酸菌产生了能够降解N-二甲基亚硝胺的酶系[36]，说明鲶鱼肉风干肠具有一定的安全性。风干结束后AP-PRO组对N-亚硝胺的抑制率为41.0%。孙学颖等[37]研究发现，商业发酵剂PRO-MIX5和弯曲乳杆菌单菌均能显著降低N-亚硝胺的含量，与本研究结果一致。
表3 鲶鱼肉风干肠中N-亚硝胺的含量
Table 3 Content of N-nitrosamines in dried catfish sausages μg/kg
N-亚硝胺AP组AP-PRO组N-二甲基亚硝胺//N-亚硝基吗啉13.28±0.14a11.33±0.20b N-亚硝基吡咯烷//N-二乙基亚硝胺6.07±0.07a3.85±0.33b N-甲基乙基亚硝胺1.62±0.24b3.00±0.06a N-亚硝基哌啶7.42±0.03a2.68±0.05b N-二丙基亚硝胺//N-二丁基亚硝胺7.80±0.34a6.66±0.61b N-亚硝基二苯胺22.99±2.32a7.41±0.92b总量59.17±2.48a34.93±0.56b
3 结 论
本研究在添加八角精油和紫苏精油的基础上，探究接入乳酸菌发酵剂PRO-MIX5后对鲶鱼肉风干肠品质的提升及对安全性的影响。结果表明：接入PRO-MIX5发酵剂后风干肠的水分质量分数降低至26.06%，pH值降低至5.26，低水分质量分数和高酸的环境限制了腐败微生物的生长，有利于提高产品的安全性；AP-PRO组中的乳酸菌能降低鲶鱼肉风干肠中的TBARS值，延缓脂肪氧化，其亚硝酸盐含量虽然高于AP组，但远低于国家限量标准；在成熟终点，AP-PRO组的肠杆菌科数高于AP组，假单胞菌数低于AP组，说明乳酸菌发酵剂和香辛料精油复配使用对假单胞菌生长的抑制效果更好，同时AP-PRO组具有更高的乳酸菌水平（8.7（lg（CFU/g））），有利于发酵产酸，抑制腐败微生物生长；AP-PRO组对生物胺和N-亚硝胺都有很好的抑制效果，抑制率分别为14.5%和41.0%。综上，AP-PRO组在改善鲶鱼肉风干肠品质和提高安全性方面的效果优于AP组。
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