鱼糜制品是鱼类原料的深加工制品,深受消费者喜爱。在鱼糜制品加工过程中,常添加淀粉、魔芋葡甘聚糖(konjac glucomannan,KGM)等多糖以改善其凝胶特性。国内外研究表明,与天然多糖相比,添加改性多糖可以更显著改善鱼糜的凝胶特性[1]。多糖改性后,其物化特性如电荷、疏水性、黏度等可能发生变化。然而,目前已有的报道主要聚焦于多糖改性方式对鱼糜胶凝特性的影响[2-5],而少见改性后多糖物化特性变化对鱼糜凝胶特性的影响。鱼糜的主要成分是肌原纤维蛋白,在鱼糜加热过程中,暴露出来的疏水部分相互交联,肌原纤维蛋白发生聚集,形成三维凝胶网络结构。鱼糜凝胶网络主要依靠氢键、疏水相互作用、静电相互作用、二硫键及非二硫共价键来维持,其中疏水相互作用被认为是主要的化学作用力[3,6]。有研究证明淀粉的加入能促进鱼糜凝胶中的疏水相互作用,从而显著提高鱼糜凝胶网络结构的致密度[6-7]。因此推测改性多糖的疏水性可能影响鱼糜凝胶特性。但是,目前关于改性多糖的疏水性对鱼糜凝胶特性的影响相关报道仍较少。
羧甲基化[8]和脱乙酰化[9]是常见的多糖化学改性方法,广泛应用于纤维素、壳聚糖、琼脂及KGM等高分子质量多糖的改性。这2 种改性方法可以分别通过脱除乙酰基和增加羧甲基改变多糖的疏水性[10]。因此,本研究拟通过脱乙酰化和羧甲基化2 种改性方式分别制备脱乙酰魔芋葡甘聚糖(de-acetylated konjac glucomannan,DKGM)和羧甲基化魔芋葡甘聚糖(carboxymethlated konjac glucomannan,CKGM),以增大和减小KGM的疏水性,探讨改性KGM的疏水性对鱼糜凝胶特性的影响,以期为高品质鱼糜制品的加工提供理论依据。
AAA级鲢鱼糜(水分质量分数76.11%,20 kg/件)湖北省洪湖市井力水产食品股份有限公司;KGM(葡甘聚糖质量分数90.30%,水分质量分数6.86%) 湖北强森魔芋科技有限公司;PVC塑料肠衣 天津市康泰塑料包装有限公司。
一氯乙酸、无水乙醇、无水醋酸钠、碳酸钠、氯化钾、溴化钾、氯化钠、浓盐酸、氢氧化钠(均为分析纯)国药集团化学试剂有限公司。
OCA20水接触角测试仪 德国Data Physics公司;WH28色差仪 深圳市威福光电科技有限公司;TA.XT Plus质构仪 英国Stable Micro System公司;SU8010扫描电子显微镜、HCP-2临界点干燥机 日本Hitachi公司;DSC 204 F1差示扫描量热仪 上海凯璞科技有限公司;FP3013食品调理机 德国博朗公司;IS50傅里叶变换红外光谱仪 苏州奥普斯等离子体科技有限公司;IKA2000高速分散均质机 德国IKA公司;506Y卡口机浙江双木包装机械有限公司。
1.3.1 改性KGM制备
DKGM的制备参考Du Xuezhu等[11]的方法并加以修改。准确称量1 g KGM,加入200 mL纯水中,25 ℃搅拌8 h,使其充分溶胀。加入不同体积(8.8、21.9 mL)的0.1 g/100 mL Na2CO3溶液,25 ℃下搅拌反应4 h。反应液加入2 倍体积的体积分数50%乙醇溶液,过滤,取沉淀。沉淀用200 mL 50%乙醇溶液反复洗涤,至滤液pH值为7。洗涤后的粗产物依次加入100 mL 75%乙醇溶液、100 mL 95%乙醇溶液脱水、过滤,然后加入100 mL无水乙醇溶液脱水过夜。过滤取沉淀,40 ℃鼓风干燥8 h。产物粉碎后过60 目筛,取筛下物,即获得DKGM1、DKGM2,其脱乙酰度为31.07%和50.72%。
CKGM的制备参考Xiao Man等[10]的方法并作相应修改。准确称量2.5 g KGM,缓慢加入500 mL纯水中,使其充分溶胀。取一定量无水醋酸钠(5、10 g),溶于100 mL 70%乙醇溶液,再加入KGM溶胶中,60 ℃水浴反应1 h。取0.6 g一氯乙酸,溶于20 mL 70%乙醇溶液,加入上述KGM溶胶中。60 ℃水浴反应1 h后取出,反应液加入500 mL 95%乙醇溶液沉淀15 min,沉淀加入50%乙醇溶液洗涤后,再使用95%乙醇脱水15 h。过滤取沉淀,于60 ℃鼓风干燥8 h。产物粉碎后过60 目筛,取筛下物,即获得CKGM1、CKGM2,其取代度分别为0.21%和0.29%。
1.3.2 鱼糜凝胶制备
参考Qiu Jing等[12]的方法并略加修改。冷冻鱼糜常温解冻60 min,依次添加2%食盐(以鱼糜凝胶质量为基准,下同)和0.5%改性多糖(DKGM1、DKGM2、CKGM1、CKGM2)及未改性KGM,加冰水调节水分质量分数至78%,斩拌5 min。将斩拌好的鱼糜挤入肠衣中,两端用卡口机封口,90 ℃加热30 min。将加热完成的鱼糜凝胶取出,置于冰水中冷却15 min,于4 ℃冰箱中冷藏,以不添加多糖的鱼糜凝胶作为对照组。
1.3.3 多糖接触角测定
参考韩墨等[13]的方法测定多糖的接触角,以反映每种多糖的疏水性大小。每种多糖取2 g左右,使用压片仪将其压片,用接触角测试仪配套的注射器吸取2.0 μL去离子水作为介质,自动滴下介质至多糖压片表面,在表面形成液滴状,接触角测试仪自动捕获照片,并计算角度。
1.3.4 白度测定
参考阙凤等[14]的方法,将鱼肠切成圆柱体(高20 mm),室温下用色差仪测定并记录亮度值(L*)、红绿度值(a*)和黄蓝度值(b*)。白度按式(1)计算:
1.3.5 凝胶强度测定
参考Huang Qun等[15]的方法。探头型号:P/0.25S,测试条件:测前速率5 mm/s,测试速率1 mm/s,测后速率5 mm/s,穿刺距离15 mm。凝胶强度用破断力与刺破鱼糜凝胶时破断距离的乘积表示。
1.3.6 鱼糜凝胶质构特性测定
参考Liang Feng等[16]的方法。将鱼肠取出,切成高20 cm的圆柱体,用质构仪测定其质构特性(硬度、弹性、内聚性、咀嚼性和回复性)。探头型号:P/36 R;测试参数:触发力5 g,测前、测中和测后速率分别为5.0、1.0、1.0 mm/s;压缩比50%。
1.3.7 鱼糜凝胶持水性测定
参考戚勃等[17]的方法。准确称取(3±0.02)g样品,质量记为m1,采用双层滤纸包裹样品后,转入50 mL离心管中,在室温下3 000×g离心15 min。离心后的样品用滤纸吸干表面水分后称质量,记为m2。持水性按式(2)计算:
式中:m1为鱼糜样品质量/g;m2为离心后鱼糜凝胶质量/g。
1.3.8 鱼糜凝胶化学作用力测定
参考卢彦轩等[18]的方法。2 g鱼糜凝胶分别加入10 mL 0.05 mol/L NaCl(SA)、0.6 mol/L NaCl(SB)、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素(SC)、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素(SD)和0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+0.5 mol/L 2-β-巯基乙醇(SE),混合后6 000 r/min均质1 min,4 ℃静置1 h,8 000 r/min离心15 min。采用Lowry法测定上清液中蛋白质质量浓度。SA溶液中蛋白质含量表示非特异性键,离子键的贡献以溶于SB溶液与SA溶液中蛋白质含量之差表示;氢键的贡献以溶于SC溶液与SB溶液中蛋白质含量之差表示;疏水相互作用的贡献以溶于SD溶液与SC溶液中蛋白质含量之差表示;二硫键的贡献以溶于SE溶液与SD溶液中蛋白质含量之差表示。
1.3.9 傅里叶变换红外光谱测定
参考Zhou Xuxia等[19]的方法并作修改,分别将1.0 mg冻干后的鱼糜凝胶与100 mg干燥后的溴化钾晶体置于玛瑙研钵,在干燥灯下混匀并充分研磨,磨成细粉末后用油压机在20 N压力下压制2 min,制成透明薄片,放入傅里叶变换红外光谱仪中。扫描范围为4 000~400 cm-1。
1.3.10 鱼糜凝胶热稳定性测定
参考He Yating等[20]的方法并作修改。称取约15 mg样品,置于铝坩锅中液压密封,用空铝坩锅作为空白,以10 ℃/min的速率从20 ℃升温至90 ℃,采用差示扫描量热法对样品进行扫描。
1.3.11 微观结构观察
参考Yin Tao等[21]的方法,用刀片将鱼糜凝胶样品切成1 mm×1 mm×1 mm的小块,用体积分数2.5%戊二醛溶液于4 ℃冰箱固定2 h后,分别用体积分数30%、50%、70%、80%乙醇溶液对样品进行脱水,每次15 min,再用90%乙醇溶液和无水乙醇分别脱水1 次和2 次,每次10 min;用100%乙酸异戊酯和无水乙醇混合溶液浸泡样品2 次,每次15 min,用临界点干燥机干燥样品2 h,将其用导电胶固定在扫描电子显微镜样品台上,样品表面真空喷金,用扫描电子显微镜观察。
所有实验重复3 次,每次实验做3 组平行,数据以平均值±标准差表示。采用Peak Fit v 4.12软件对样品酰胺带图谱进行处理,计算二级结构相对含量,并分析热特性参数(峰值、焓值)。采用Excel 2021软件对数据进行整理;SPSS 19.0软件对数据进行显著性分析,Origin 2021软件进行绘图。
接触角是描述液体与固体界面间相互作用的重要参数,它能够反映液体在固体表面上的润湿性,是表征固体表面疏水性最常用的指标[22]。如图1所示,KGM接触角为60.6°,小于65°,表明KGM疏水性相对较弱。通过脱乙酰化改性得到的DKGM1和DKGM2的接触角分别为42.7°和53.5°,相较于KGM有所减小,表明其疏水性降低。KGM脱乙酰化主要指在碱性条件下,其分子链上的乙酰基发生水解反应并被去除的过程。乙酰基(CH3CO—)是一个典型的疏水基团[23],碳氧双键和甲基的存在使其不易与水分子形成氢键,因此表现出疏水性。在KGM脱乙酰化后,其分子内氢键作用增强,空间位阻效应减弱,促进了分子间缔合,从而导致疏水性减弱。另一方面,采用羧甲基化改性得到的CKGM1和CKGM2的接触角分别为68.5°和72.7°,相较于KGM明显增加,疏水性明显增强,这是因为多糖分子链中引入羧甲基,提高了疏水性,与之前的报道一致[24]。
图1 改性前后KGM的水接触角
Fig.1 Water contact angle of native and modified KGM
A~E.分别为DKGM1、DKGM2、KGM、CKGM1、CKGM2。
由表1可知,添加疏水性不同的改性KGM对鱼糜凝胶的白度影响显著,与添加KGM相比,添加改性KGM鱼糜凝胶的L*与白度均显著减小(P<0.05),这可能是由于改性后的KGM可有效结合鱼糜凝胶中的水分,表面水分含量减少,降低了光在鱼糜凝胶中的折射能力,进而导致凝胶白度降低[25]。添加DKGM和CKGM鱼糜凝胶的L*和白度与对照组相比呈现下降趋势,这主要是由于外源添加物的颜色会直接影响鱼糜凝胶的白度[26],改性后的CKGM为淡黄色粉末,吸水后变为半透明颗粒,这一变化也会影响鱼糜凝胶L*和白度。
表1 添加疏水性不同的改性KGM鱼糜凝胶的颜色参数与白度
Table 1 Color parameters and whiteness value of surimi gel with modified KGM with different hydrophobicity
注:同列小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。表2、3同。
组别L*a*b*白度对照77.93±0.75b-1.55±0.03ab6.08±0.03bc77.05±0.73b DKGM177.73±0.62bc-1.55±0.06b6.42±0.10a76.77±0.62bc DKGM277.65±0.74bc-1.58±0.07b5.87±0.33c76.83±0.76bc KGM79.21±0.57a-1.46±0.06a6.37±0.16a78.20±0.58a CKGM176.87±0.56cd-1.76±0.07c6.29±0.12ab75.97±0.55cd CKGM276.67±0.54d-1.57±0.07b6.42±0.25a75.75±0.50d
由图2可知,与对照组和KGM组相比,添加改性KGM能够显著提升鱼糜凝胶强度(P<0.05)。未改性KGM因其较大的分子尺寸,会干扰鱼糜肌球蛋白的胶凝过程并破坏凝胶网络结构,从而导致凝胶强度降低,这与前人的研究相吻合[27]。随着改性KGM疏水性的增强,鱼糜凝胶强度呈现先增加后减小的变化趋势。当添加接触角为42.7°和53.5°的DKGM时,鱼糜凝胶强度较KGM组分别提高50%、73%,这一趋势与之前的研究结果相一致[8,28]。随着DKGM疏水性的增强,蛋白质分子的移动与伸展变得更为容易,这有助于增强疏水相互作用,并进一步构建出更为稳固的凝胶网络结构。同时,改性后的DKGM能够穿入凝胶连续相,从而进一步提升凝胶强度,这与Li Junguang等[29]的研究结果相一致。此外,随着疏水性增强,DKGM将不再与蛋白质争夺水分,这有利于凝胶中氢键的形成,进而增强凝胶强度。当添加接触角68.5°和72.7°的CKGM时,鱼糜凝胶强度较KGM组分别提高60%、43%。改性后的CKGM疏水性逐渐增大,黏度下降。这种特性使得蛋白质移动性得以增强,进而促进了更强疏水相互作用的形成,并改善了凝胶网络结构[30]。综上,2 种改性方式中,脱乙酰化改性在提升鱼糜凝胶强度方面更具优势。随着DKGM疏水性的增强,鱼糜凝胶强度逐渐增大。然而,当CKGM接触角增大时,鱼糜凝胶强度开始逐渐下降。这表明改性KGM处于适当的疏水性范围内时才能够有效提升鱼糜凝胶强度。
图2 疏水性不同的改性KGM对鱼糜凝胶强度的影响
Fig.2 Effect of modified KGM with different hydrophobicity on the strength of surimi gel
小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。图3、4同。
如表2所示,添加DKGM和CKGM显著改善了鱼糜凝胶的质构特性(P<0.05)。随着改性KGM疏水性的增强,鱼糜凝胶的硬度、内聚性及咀嚼性均先增加后减小。当添加接触角为53.5°的DKGM2时,鱼糜凝胶的硬度和咀嚼性最大,分别是对照组的1.39、1.32 倍。这些质构特性参数的变化与凝胶内部蛋白结构的紧密程度密切相关,与凝胶强度的结果一致。这可能是由于适度疏水性的多糖能够有效填充鱼糜空腔,促进凝胶网络中的蛋白质交联,从而提高鱼糜凝胶网络结构的致密程度[31]。
表2 疏水性不同的改性KGM对鱼糜凝胶质构特性的影响
Table 2 Effect of modified KGM with different hydrophobicity on texture properties of surimi gel
组别硬度/g弹性内聚性咀嚼性/g回复性对照1 523.02±85.32bc0.85±0.01a0.66±0.00a 903.31±55.84b 0.37±0.01a DKGM1 1 530.27±183.28b0.85±0.07a0.52±0.11bc 686.89±224.45bc 0.26±0.06b DKGM2 2 122.77±107.81a0.85±0.01a0.66±0.01a 1 192.62±86.69a 0.36±0.01a KGM803.16±97.79c0.72±0.10b0.32±0.04d 183.57±46.29d 0.13±0.01c CKGM1 1 786.60±171.86b0.86±0.02a0.60±0.01ab 808.68±67.21bc 0.32±0.01ab CKGM2 1 557.69±93.74b0.83±0.03a0.50±0.16c 730.88±342.72c 0.29±0.06b
由图3可知,疏水性不同的改性KGM对鱼糜凝胶的持水性影响显著(P<0.05)。通常随着持水性的增加,凝胶网络结构会变得更加紧密,吸水性更强[32],这与本研究中凝胶强度结果相一致。结合图2可知,持水性的提升与凝胶强度的增强呈正相关。随着改性KGM疏水性的增强,鱼糜凝胶的持水性呈现出先增加后减小的趋势。当添加接触角为42.7°和53.5°的DKGM时,鱼糜凝胶持水性相较于对照组分别提升14%、17%。当添加接触角为68.5°和72.7°的CKGM时,鱼糜凝胶持水性相较于对照组分别提升13%、7%。结果表明,适度的疏水性有助于增强鱼糜凝胶的持水性。当使用接触角为53.5°的DKGM时,鱼糜凝胶的持水性达到最大值。然而,当疏水性增大到一定程度时,改性KGM提升鱼糜凝胶持水性的效果会减弱。这可能是由于过度疏水的多糖无法有效填充鱼糜空腔,导致凝胶网络结构变得松散,从而降低对水分的束缚能力。
图3 疏水性不同的改性KGM对鱼糜凝胶持水性的影响
Fig.3 Effect of modified KGM with different hydrophobicity on the water retention ability of surimi gel
在鱼糜凝胶形成过程中,疏水相互作用、二硫键、离子键和氢键均起重要作用。由图4可知,相较KGM组,改性后的DKGM组(疏水性减小组)和CKGM组(疏水性增大组)中的4 种化学作用力均显著增加(P<0.05)。随着添加改性KGM疏水性增强,鱼糜凝胶化学作用力呈现先增加后减小的趋势。当添加接触角为53.5°的DKGM2时,鱼糜凝胶的疏水相互作用达到最大,这可能是由于具有适度疏水性的多糖有助于蛋白质结构展开,促进鱼糜蛋白的疏水基团暴露,进而增强凝胶的疏水相互作用[3]。当添加的CKGM疏水性增大时,凝胶中的4 种化学作用力呈现下降趋势。这可能是由于高疏水性的CKGM创造了过度疏水环境,破坏了凝胶内部的稳定结构,导致各种化学作用力减弱[33]。这与本研究中凝胶强度结果一致。对比2 种改性方式,疏水性不同的改性KGM均可以提高凝胶中各化学作用力,有利于增强鱼糜凝胶的致密结构。然而,只有适度疏水性的改性KGM才可以更加有效地提高鱼糜凝胶化学作用力,该变化与持水性及质构特性变化一致。
图4 疏水性不同的改性KGM对鱼糜凝胶化学作用力的影响
Fig.4 Effect of modified KGM with different hydrophobicity on the chemical interactions of surimi gel
傅里叶变换红外光谱仪能够精准地探测样品内部结构特性,通过选择性吸收红外波长,产生特征性吸收峰。通过观察分析这些特征峰,可明确蛋白二级结构的变化情况[34]。如图5A所示,在鱼糜凝胶样品的傅里叶变换红外光谱中观察到多个特征吸收峰。由图5B可知,添加疏水性不同的改性KGM对鱼糜凝胶蛋白二级结构产生影响。与对照组及KGM组相比,添加疏水性不同的改性KGM导致鱼糜凝胶中α-螺旋相对含量减少,β-折叠相对含量增加,无规卷曲和β-转角相对含量变化不大。同时,α-螺旋向β-折叠转变有助于鱼糜凝胶形成更加稳定且均匀的结构,这种变化与凝胶强度的提升基本一致。随着改性KGM疏水性的增强,α-螺旋相对含量先减少后增加,即转化为β-折叠的程度也呈现先增强后减弱的趋势。当添加接触角为53.5°的DKGM2时,鱼糜凝胶中的α-螺旋相对含量达到最低,β-折叠相对含量最高。这可能是因为适度疏水性的KGM可在一定程度上促进疏水官能团暴露,加速蛋白质重新聚集,增强蛋白与KGM的结合相互作用,最终形成孔隙均一的凝胶网络结构[35]。随着改性KGM疏水性的继续增强,α-螺旋相对含量增加,转化为β-折叠程度减弱,表明当改性KGM的疏水性超过一定范围时,不利于形成稳定的鱼糜凝胶结构。
图5 疏水性不同的改性KGM对鱼糜凝胶蛋白二级结构的影响
Fig.5 Effect of modified KGM with different hydrophobicity on the secondary structure of protein in surimi gel
A.傅里叶变换红外光谱图;B.蛋白质二级结构组成。
如表3所示,在36~44、60~62、70~75 ℃ 3个温度区间内出现了特征吸收峰。与对照组及KGM组相比,添加改性KGM的鱼糜-多糖混合体系的变性温度逐渐升高,这表明改性KGM增强了鱼糜混合体系的热稳定性。随着改性KGM疏水性的增强,添加改性KGM的鱼糜凝胶肌球蛋白重链和肌球蛋白轻链的变性温度呈现先增加后减小的趋势,相应地,多糖-鱼糜混合体系的稳定性先增强后减弱。同时,当添加接触角53.5°的DKGM2时,鱼糜-多糖混合体系的变性温度(Tmax)和焓变(ΔH)均达到最大,结果表明,添加适度疏水性的改性KGM可以改善鱼糜-多糖混合体系的热稳定性。对于CKGM组,随着多糖疏水性的增强,鱼糜体系的热稳定性降低,这一结果可能与蛋白的空间结构稳定性有关。当添加的多糖疏水性过大时,可能会破坏这种平衡,从而导致蛋白质热稳定性改变[36]。
表3 疏水性不同的改性KGM对鱼糜凝胶热力学特性的影响
Table 3 Effect of modified KGM with different hydrophobicity on thermodynamic properties of surimi gel
组别峰I峰II峰III Tmax1/℃ΔH1/(J/g)Tmax2/℃ΔH2/(J/g)Tmax3/℃ΔH3/(J/g)对照37.85±0.49c 0.10±0.02bc62.05±2.76a 0.003±0.001c 70.50±5.94a 0.008±0.007a DKGM1 43.95±0.06ab 0.14±0.04ab62.30±6.50a 0.020±0.009a 72.30±4.38a 0.003±0.001a DKGM2 44.65±0.64a 0.16±0.03a62.70±4.10a 0.030±0.003a 72.85±3.89a 0.006±0.001a KGM36.60±1.13c 0.06±0.02d60.50±2.40a 0.001±0.001c 74.45±2.05a 0.003±0.002a CKGM1 42.75±7.28ab 0.11±0.01bc61.50±0.99a 0.030±0.001a 71.40±1.70a 0.008±0.007a CKGM2 39.80±0.57bc 0.09±0.04cd60.30±3.96a 0.020±0.001b 73.45±0.21a 0.003±0.001a
由图6可知,与对照组和KGM组相比,添加改性KGM后,鱼糜凝胶网络结构变得更加致密,孔洞较小,这与之前的凝胶强度和持水性结果相符。随着鱼糜中添加的改性KGM疏水性的增强,鱼糜凝胶网络结构先变得致密,后变得粗糙松散。这可能是因为适度疏水性的KGM增强了填充效应,使凝胶网络结构变得更加致密,并减少凝胶孔洞。尽管KGM疏水性较强,但其较大的分子颗粒可能干扰鱼糜肌球蛋白的凝胶过程,破坏凝胶网络结构,导致孔隙较大且不均匀。此外,当添加接触角为53.5°的DKGM2时,鱼糜凝胶网络结构最致密,间隙较小且分布均匀,与凝胶强度的结果一致。当改性KGM的疏水性过大时,不利于与蛋白交联,不易形成致密的凝胶网络,造成结构松散、不均一[6]。
图6 疏水性不同的改性KGM对鱼糜凝胶微观结构的影响(×10 000)
Fig.6 Effect of modified KGM with different hydrophobicity on the microstructure of surimi gel (× 10 000)
A~F.分别为对照组、DKGM1组、DKGM2组、K G M 组、C K G M 1 组、C K G M 2 组。
在接触角42.7°~72.7°范围内,对KGM进行脱乙酰和羧甲基化改性后,添加改性KGM均能显著改善鱼糜胶凝特性。对于DKGM,随着疏水性的增大,鱼糜凝胶的凝胶强度、硬度、内聚性、咀嚼性、持水性等显著增加,对于CKGM,凝胶特性随疏水性变化的趋势与DKGM相反。凝胶特性改善的原因可能与蛋白质热稳定性增加、蛋白质二级结构伸展后形成更强化学作用力和更致密的三维网络结构有关。
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