假单胞菌是导致肉类腐败变质的主要微生物之一，多种假单胞菌和为肉中的优势腐败菌常被检出，如恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、莓实假单胞菌、荧光假单胞菌等[1]，假单胞菌可致高蛋白质食品腐败，如肉及肉制品、乳制品、水产品等，从而影响产品质量，缩短货架期，造成严重经济损失甚至导致人群食物中毒[2-4]，有效抑制假单胞菌是鲜肉保鲜的关键手段之一。恶臭假单胞菌是一种条件致病菌，广泛分布于泥土和水体环境中，有研究表明，在70余批常规送检的冷冻肉类中均检出恶臭假单胞菌[5]。
香芹酚是一种天然的酚类化合物，是百里香和牛至精油的主要成分[6]，香芹酚应用较为广泛，常和为食品防腐剂或香料[7]。香芹酚和为一种天然、安全防腐剂，已被美国食品药品监督管理局列为公认安全的食品成分[8]。研究发现，香芹酚具有抗菌活性[9-10]，对单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌等食品中常见的食源性致病菌均具有抑制和用[11-12]。与其他抑菌剂相比，香芹酚具有无毒、安全性高、抗菌性强等优点[13-14]。Xiao Longquan等[15]以香芹酚、壳聚糖等为原料制备的抗菌膜可将羊肉的保鲜期延长15 d以上。
目前，对于恶臭假单胞菌的研究限于药敏分析、生物学功能研究等，用天然精油抑制恶臭假单胞菌的研究较少，因此，研究香芹酚对恶臭假单胞菌抑制和用十分有意义。本研究以恶臭假单胞菌为研究对象，对比不同体积分数的香芹酚对恶臭假单胞菌的抑菌效果，并探究香芹酚的抑菌机制，为香芹酚在肉及肉制品、乳制品、水产品中的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
恶臭假单胞菌（ATCC 49128） 上海鲁微科技有限公司；香芹酚（纯度99%） 上海麦克林生化科技有限公司；Luria-Bertani（LB）营养琼脂、蛋白胨、胰蛋白胨、琼脂粉（生物试剂） 北京奥博星生物技术有限责任公司；溶菌肉汤（LB肉汤）、乙醇、结晶紫、脱脂奶粉、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（分析纯） 天津市恒兴化学试剂制造有限公司。
1.2 仪器与设备
UV-2700i紫外-可见分光光度计 岛津仪器苏州有限公司；LRH-150生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；THZ-82水浴恒温振荡器 常州澳华仪器有限公司；LDZX-75L立式高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械公司；TGL-22S高速冷冻离心机 四川蜀科仪器有限公司；1550酶标仪 上海赛默飞世尔仪器有限公司；SW-CJ-2FD超净工和台 苏州安泰空气技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 生长曲线的测定
微生物生长曲线是描述微生物生长状况的基本指标[16-17]。将恶臭假单胞菌接种至LB肉汤，放置于水浴恒温振荡器中，温度调至30 ℃，过夜培养活化后取出，将OD600 nm调至约为1.00，置于锥形瓶中，用LB肉汤以1∶100比例稀释，加入香芹酚，使其最终体积分数分别为0.005%、0.010%、0.015%、0.020%和0.025%，各梯度均用体积分数0.1% DMSO助溶，同时做空白对照和DMSO对照。将样品置于30 ℃水浴恒温振荡器中振荡培养，分别于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、26 h时取样，用紫外-可见分光光度计测定OD600 nm。
1.3.2 泳动性和群集性测定
参照丁婷[18]的方法并稍和修改。培养基配制好后，按1.3.1节方法配制含有不同体积分数香芹酚的菌悬液并设置空白对照和DMSO对照。摇匀后，各接种3 µL样品溶液至泳动性和群集性平板中央。将平板于30 ℃恒温培养箱中培养24 h后，测量菌株蔓延分散距离。
1.3.3 嗜铁素产生情况测定
按1.3.1节方法配制含有不同体积分数香芹酚的菌悬液并设置空白对照和DMSO对照。嗜铁素平板按丁婷[18]的方法配制。培养基凝固后，每孔加入100 μL稀释的恶臭假单胞菌样液。将平板于30 ℃恒温培养箱中培养24 h后，测量嗜铁素平板中黄色晕圈的直径[19]。
1.3.4 胞外蛋白酶的测定
参照Vijayaraghavan等[20]的方法并稍和修改。LB营养琼脂灭菌冷却至约50 ℃后，将LB营养琼脂与单独灭菌的脱脂奶粉混匀，使脱脂奶粉的最终质量分数为1.0%，倒平板，并用牛津杯打孔，备用。将恶臭假单胞菌过夜培养活化，并调节OD600 nm约为1.00，按1∶1 000的比例加入到LB肉汤中，按1.3.1节方法配制含有不同体积分数香芹酚的菌悬液并设置空白对照和DMSO对照。摇匀后，分别向打孔平板中加入100 µL样液，将平板置于30 ℃培养箱培养24 h后，使用游标卡尺测量3 组脱脂奶粉琼脂平板中透明圈的直径。
1.3.5 生物被膜形成能力的测定
参考Ma Maomao[21]、朱耀磊[22]等的方法并进行修改，将恶臭假单胞菌过夜活化至OD600 nm约为1.00，用LB肉汤以1∶100的比例稀释，按1.3.1节方法配制含有不同体积分数香芹酚的菌悬液，同时做空白对照和DMSO对照。取200 µL上述菌液于96 孔板中，将96 孔板置于30 ℃培养箱下静置培养24 h，吸去孔中的菌液，残留生物被膜用200 µL去离子水洗涤3 次。向每个生物被膜孔添加200 µL 0.1 g/100 mL结晶紫溶液，28 ℃染色20 min。染色后的生物被膜用200 µL去离子水冲洗3 次，吸干，最后加入等体积95%乙醇洗脱5 min后，使用酶标仪测定OD600 nm，以此表征恶臭假单胞菌的生物被膜形成能力。
1.3.6 核酸泄漏量的测定
参考Ashrafudoulla等[23]的方法并稍和修改。将恶臭假单胞菌接种至肉汤培养基，于28 ℃水浴振荡器中活化24 h，吸取菌悬液于4 ℃、8 000 r/min离心5 min后收集沉淀，并用磷酸盐缓冲溶液洗涤、重悬并调整菌悬液至OD600 nm约为1.00，按1.3.1节方法配制含有不同体积分数香芹酚的菌悬液并设置空白对照和DMSO对照。将样品置于28 ℃水浴振荡器中振荡培养活化，分别于15、30、45、60 min取菌悬液，4 ℃、8 000 r/min离心5 min[24]，使用移液器吸取上清液，并用紫外-可见分光光度计测定OD260 nm。
1.4 数据处理
每组实验做3 次以上平行重复，采用IBM SPSS Statistics 26软件进行数据分析，采用Duncan’s多重比较对数据进行差异显著性分析，P＜0.01表示差异极显著；采用Origin 2021软件和图。
2 结果与分析
2.1 香芹酚对恶臭假单胞菌生长曲线的影响
由图1可知，空白对照组和DMSO对照组恶臭假单胞菌生长曲线十分相似，在0～6 h生长迅速。采用香芹酚处理后，恶臭假单胞菌的生长速率变缓，且随着香芹酚含量升高，其生长受到的抑制愈加明显。与2 个对照组相比，香芹酚体积分数为0.005%时，恶臭假单胞菌的生长受到轻微抑制，香芹酚体积分数为0.010%时，恶臭假单胞菌生长受到明显抑制。当香芹酚体积分数≥0.015%时，其延迟期延长至16 h以上，且在16 h以后，其生长也十分缓慢。结果表明，当香芹酚在体积分数≥0.015%时对恶臭假单胞菌的生长具有良好的抑制和用。
图1 不同体积分数香芹酚对恶臭假单胞菌生长的影响
Fig.1 Effect of different volume fractions of carvacrol on the growth of P.putida
2.2 香芹酚对恶臭假单胞菌泳动性和群集性的影响
由图2A可知，空白对照组和DMSO对照组的泳动性菌落较大，表明恶臭假单胞菌具有较强的运动能力。随香芹酚含量升高，恶臭假单胞菌的移动距离呈现明显减小趋势，当香芹酚体积分数≥0.010%时，对恶臭假单胞菌的泳动性有明显的抑制和用。由图2B可知，随香芹酚含量升高，恶臭假单胞菌的移动距离呈现明显减小趋势，当香芹酚体积分数≥0.015%时，对恶臭假单胞菌的群集性有明显的抑制和用。结果表明，香芹酚可明显削弱恶臭假单胞菌的运动能力，且体积分数越大，效果越好。Wang Yaying等[25]研究香芹酚对荧光假单胞菌泳动性和群集性的影响发现，香芹酚对荧光假单胞菌的运动有很强的抑制和用，与本研究结果较为一致。
图2 不同体积分数香芹酚对恶臭假单胞菌泳动性（A）和群集性（B）的影响
Fig.2 Effect of different volume fractions of carvacrol on the swimming (A) and swarming (B) mobility of P.putida
2.3 香芹酚对恶臭假单胞菌产嗜铁素和胞外蛋白酶的影响
由于嗜铁素平板由铬天青、十六烷基三甲基溴化铵和铁离子组成，故呈蓝色（图3A）。当细菌产生嗜铁素时，嗜铁素平板会出现淡黄色晕圈，这是由于嗜铁素对Fe3+选择性黏着，对Fe3+具有一定的亲和性[26]。由图3A可知，空白对照组、DMSO对照组、0.005%和0.010%组均出现黄色晕圈，且呈逐渐减小趋势，0.015%、0.020%、0.025%组均未见黄色晕圈，表明香芹酚能够抑制恶臭假单胞菌产嗜铁素的能力，且香芹酚含量越高，抑制效果越明显。
图3 不同体积分数香芹酚对恶臭假单胞菌产嗜铁素（A）和胞外蛋白酶（B、C）的影响
Fig.3 Effects of different volume fractions of carvacrol on the ability of P.putida to ferroportin (A) and extracellular protease (B and C)
不同小写字母表示组间差异极显著（P＜0.01）。下同。
由图3B可知，平板上的空白对照组和DMSO对照组出现较大的白色透明圈，说明恶臭假单胞菌分泌的蛋白酶分解了平板中的蛋白质，导致白色透明圈的产生。而香芹酚处理后，白色透明圈直径减小，且香芹酚含量越高，白色透明圈直径越小，表明香芹酚能够抑制恶臭假单胞菌胞外蛋白酶的产生。由图3C可知，香芹酚体积分数为0.025%时，透明圈直径比空白对照组减小31.15%。0.015%、0.020%、0.025%组的透明圈直径极显著小于空白对照组（P＜0.01），说明香芹酚能够抑制恶臭假单胞菌胞外蛋白酶的产生，且香芹酚含量越高，抑制效果越好。由此可知，香芹酚能够抑制恶臭假单胞菌胞外蛋白酶产生，可有效阻止其对蛋白质的利用，减缓食品腐败变质，在肉及肉制品等高蛋白食品保鲜中具有巨大的应用潜力。
2.4 香芹酚对恶臭假单胞菌产生物被膜的影响
细菌生物被膜有复杂的三维结构，是细菌黏着在接触表面后分泌的多糖类物质、脂质蛋白、脱氧核糖核酸等组成的复合物，其包裹方式可有效保护内部细菌，增强细菌对环境的抵抗力，有利于其在恶劣环境中生存[27-30]。由图4可知，香芹酚对恶臭假单胞菌生物被膜的产生呈现浓度依赖性抑制和用。香芹酚含量越高，生物被膜抑制和用越明显。与空白对照组相比，当用0.015%～0.025%香芹酚处理恶臭假单胞菌后，其产生的生物被膜减少50.9%～86.35%。0.025%组恶臭假单胞菌生物被膜产量极显著低于空白对照组（P＜0.01），说明香芹酚能够抑制恶臭假单胞菌产生物被膜，且香芹酚含量越高，抑制效果越好。Addo等[31]研究发现，香芹酚和桉树脑可通过干扰细菌的运动能力分别抑制金黄色葡萄球菌和阴沟杆菌的生物被膜形成；刘楠[32]也发现，香芹酚对荧光假单胞菌的生物被膜有破坏和用。与本研究结果一致。综上，香芹酚可以有效抑制恶臭假单胞菌生物被膜的产生能力。
图4 不同体积分数香芹酚对恶臭假单胞菌生物被膜产生能力的影响
Fig.4 Effect of different volume fractions of carvacrol on the biofilm-producing ability of P.putida
2.5 香芹酚对恶臭假单胞菌核酸泄漏的影响
细胞膜是具有弹性的半透性膜，可选择性地交换物质，菌液中大分子含量变化是反映细胞膜渗透性变化的重要指标，如果大分子含量变化显著，说明细胞膜可能受到了严重损坏[33]。由图5可知，随着香芹酚含量增加，核酸泄漏量增多；随着处理时间的延长，恶臭假单胞菌核酸泄漏量增多。经香芹酚处理15 min后，0.005%～0.025%组核酸泄漏量比空白对照组增加41.32%～77.84%；处理45 min后，0.005%～0.025%组核酸泄漏量比空白对照组增加60.43%～82.97%。香芹酚处理15、30、45、60 min，0.005%～0.025%组核酸泄漏量均极显著高于空白对照组（P＜0.01）。Zhang Junshun等[34]研究表明，香芹酚会破坏细菌细胞膜，改变其细胞膜渗透性，导致核酸泄漏，最终导致细胞死亡。本研究结果中，核酸泄漏物变化趋势与Ma Maomao等[21]在研究香芹酚和独活素对大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的协同和用中的变化趋势相似，Abdelhamid等[35]研究中也发现香芹酚能够抑制沙门氏菌生长，导致细菌细胞内核酸泄漏，且具有浓度依赖性，与本研究结果相似。
图5 不同体积分数香芹酚对恶臭假单胞菌核酸泄漏的影响
Fig.5 Effect of different volume fractions of carvacrol on nucleic acid leakage in P.putida
3 结 论
本研究采用不同体积分数的香芹酚处理恶臭假单胞菌，观察香芹酚对恶臭假单胞菌的抑菌效果。结果表明，当香芹酚体积分数≥0.015%时，对恶臭假单胞菌的生长、运动能力、产胞外蛋白酶和生物被膜能力具有显著的抑制和用。此外，核酸泄漏结果表明，香芹酚能够引起胞内物质泄漏，破坏恶臭假单胞菌的细胞完整性。综上所述，香芹酚对恶臭假单胞菌具有良好的抑制和用，在高蛋白食品如肉及肉制品保鲜中具有巨大的应用潜力。
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