气调转换包装黑切牛肉不同温度贮藏与展示期间的微生物气味分析

摘要：针对黑切（dark cutting，DC）牛肉微生物腐败严重的问题，研究DC牛肉在冷却（4 ℃）和冰温（-1.5 ℃）母袋包装（mother-packaging，MP；80% CO2 MP（80% CO2/20% N2）、40% CO2 MP（40% CO2/60% N2）、真空包装（vacuum packaging，VP）贮藏及其后续4 ℃高氧气调包装（high-oxygen modified atmosphere packaging，HiOx-MAP；60% O2/40% CO2）展示期间的感官品质、微生物生长、挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs）变化规律。结果表明：相较于VP贮藏，40%和80% CO2 MP结合冰温贮藏均可显著抑制微生物的生长并降低己醛和1-辛烯-3-醇等VOCs含量，维持较好的气味新鲜度；高浓度CO2母袋包装贮藏的抑菌效果更强，并显著降低了HiOx-MAP展示期间DC牛排的3-甲基-1-丁醇含量，促进双乙酰、己醛等VOCs的生成；尽管高浓度CO2包装贮藏会产生异味，但打开包装15 min后异味快速消散，并未对新鲜度造成不良影响；贮藏期间CO2浓度和VP均会影响微生物菌群动态变化，但肉食杆菌经HiOx-MAP展示后最终成为各包装的优势菌；DC牛排贮藏和展示期间，肉食杆菌、沙雷氏菌及明串珠菌的生长可能是造成DC牛排异味产生的主要原因。本研究推荐使用80% CO2 MP冰温贮藏结合高氧包装展示延长DC牛肉货架期，抑制牛肉因微生物生长导致的腐败异味。

关键词：黑切牛排；二氧化碳；冰温贮藏；气调包装；微生物群落；挥发性有机化合物

基金项目：国家自然科学基金面上项目（32372409）；现代农业产业技术体系建设专项（CARS-37）；高原特色牛羊肉品加工关键技术研发及示范项目（YDZX2022149）

第一作者简介：荣鸽（1999—）（ORCID: 0009-0009-8366-2141），女，硕士研究生，研究方向为冷却肉包装保鲜。E-mail: 2827549285@qq.com

梁荣蓉（1979—）（ORCID: 0000-0002-8536-1520），女，副教授，博士，研究方向为肉品科学与肉类加工。E-mail: rrliang@sdau.edu.cn

杨啸吟（1989—）（ORCID: 0000-0002-4693-1121），男，副教授，博士，研究方向为畜产品加工及贮藏。E-mail: yangxiaoyin@sdau.edu.cn

Analysis of Microbial Community and Volatile Organic Compounds in Dark-Cutting Beef during Storage in Oxygen-Free Atmosphere at Different Temperatures and Subsequent Display in High-Oxygen Modified Atmosphere Packaging

RONG Ge, LIU Zhiyu, YANG Jun, ZHANG Yimin, MAO Yanwei, LIANG Rongrong*, YANG Xiaoyin*
(College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China)

Abstract: To address the problem of serious microbial spoilage of dark-cutting (DC) beef, this study investigated the changes in the sensory quality, microbial growth, and volatile organic compounds (VOCs) contents of DC beef during storage under mother packaging (MP) consisting of 80% CO2 and 20% N2 or 40% CO2 and 60% N2, or vacuum packaging(VP) at chilled (4 ℃) or superchilled (-1.5 ℃) temperature and subsequent display under high-oxygen modified atmosphere packaging (HiOx-MAP) consisting of 60% O2 and 40% CO2 at 4 ℃. The results showed that during superchilled storage, MP significantly inhibited bacterial growth, reduced the contents of certain VOCs (such as hexanal and 1-octen-3-ol), and thus maintained better odor freshness compared to VP; MP with 80% CO2 concentration showed higher antibacterial effect, and it significantly reduced the concentration of 3-methyl-1-butanol in displayed DC beef steaks while promoting the formation of some VOCs such as diacetyl and hexanal. After storage under high-CO2 MP, an off-odor was formed, but it disappeared at 15 min after opening the packaging, which did not cause any adverse effects on the freshness. Both CO2 concentration and VP affected the change of the microbial community during storage. For all packaging treatments, Carnobacterium was the dominant bacteria after display under HiOx-MAP. The growth of Carnobacterium, Serratia and Leuconostoc may be the main cause of off-odor development in DC steaks throughout the storage and display periods. This study recommends the use of storage with 80% CO2 MP at superchilled temperature and subsequent display under HiOx-MAP to extend the shelflife of DC beef and inhibit spoilage odor due to microbial growth.

Keywords: dark-cutting beef steaks; carbon dioxide; superchilled storage; modified atmosphere packaging; microbiota;volatile organic compounds

荣鸽, 刘智宇, 杨君, 等. 气调转换包装黑切牛肉不同温度贮藏与展示期间的微生物气味分析[J]. 肉类研究, 2024, 38(3):39-48.DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20240304-051. http://www.rlyj.net.cn

RONG Ge, LIU Zhiyu, YANG Jun, et al. Analysis of microbial community and volatile organic compounds in dark-cutting beef during storage in oxygen-free atmosphere at different temperatures and subsequent display in high-oxygen modified atmosphere packaging[J]. Meat Research, 2024, 38(3): 39-48. (in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20240304-051. http://www.rlyj.net.cn

黑切（dark cutting，DC）牛肉主要由肉牛宰前应激导致牛肉高极限pH值（pHu≥6.1）引发，其典型特征为肉色发暗、质地坚硬和表面干燥[1-2]。我国DC牛肉平均发生率高达10.07%，西北地区和中原地区发生率较高，分别为17.70%和23.61%，显著高于东北地区（4.89%）[3]。牛肉的冰点温度为-1.4～-1.7 ℃[4]。真空包装（vacuum packaging，VP）冷藏现已被广泛应用于冷鲜牛肉的长期运输与贮藏过程，然而冷却VP DC牛肉的货架期仅有14 d，并会快速出现硫代肌红蛋白绿变现象[5]。CO2作为一种高效的绿色抑菌气体可有效抑制腐败菌的生长[6]，而且高浓度CO2处理后的肉类即便在打开包装后仍具有长时效的遗留抑菌效果[7]。母袋包装是一种将大块生鲜肉或其小块分切肉放置在提前充入特定预混气的高阻隔性包装袋内并进行密封的包装方式，该包装方式主要用于牛肉的长期贮运过程，具有装货量大、成本低的优势，但不适用于牛肉的货架零售展示。母袋包装肉运输到商超后，通常会进行二次包装（如气调包装（modified atmosphere packaging，MAP））后再进入货架展示环节。母袋包装与MAP本质相似，都是借助改变肉类周围气体环境达到保鲜目的，但二者的流通环节不同。气调转换包装是指牛肉在长期贮藏或长途运输过程中采用无氧包装，后续货架展示期间配合使用高氧MAP（high-oxygen MAP，HiOx-MAP）赋予牛肉鲜红肉色的一系列配套包装方式。气体成分的改变可能会干预微生物群落演替而影响牛肉的最终货架期。当前，冰温贮藏（-3～-1 ℃）已被证明可以显著延长真空包装牛肉的货架期[8]，而且CO2在肉中的溶解能力随温度降低而增强[9]，高浓度CO2-MAP（60%或70%）结合冰温贮藏可以减少挥发性盐基氮及挥发性化合物的产生[10]。赵菲等[11]研究发现，-1 ℃结合75% O2+25% CO2包装可以使羊肉有效保鲜42 d。因此能否借助冰温和高浓度CO2的协同作用进一步延长牛肉贮藏和展示期间的货架期值得深入研究。

腐败异味是消费者评判牛肉腐败程度的一个重要感官指标，主要由微生物生长代谢产生的挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs）造成，了解贮藏牛肉的VOCs变化规律有助于理解牛肉腐败异味的形成过程[12]。与肉类腐败变质有关的常见VOCs主要是醇类、醛类、酮类、酸类、酯类及含硫化合物等[13]。某些微生物在特定气体成分下会逐渐占据主导地位，成为导致肉类腐败的特定腐败微生物[14]。不同种类微生物在不同包装和贮藏条件下会展现出较大差异的腐败潜力和代谢特征，进而产生不同VOCs，加剧不愉快异味。例如，透氧托盘包装肉中的假单胞菌和热杀环丝菌是3-甲基-1-丁醇、1-辛烯-3-醇等醇类VOCs的主要产生细菌[15]；真空包装肉中的肠杆菌、肉食杆菌和产气荚膜梭菌是硫化物和有机酸等恶臭和酸败味VOCs的主要产生细菌[16]，而高氧包装肉中的热杀环丝菌则是乙偶姻、双乙酰等黄油味VOCs的主要产生细菌[17]。因此探究特定包装环境下的菌群演替及其VOCs变化对监测肉类腐败进程和探究肉中腐败气味来源具有重要意义，然而上述高浓度CO2无氧包装向HiOx-MAP转化过程中的牛肉气味演变目前相关报道还很少。

本实验探究冷却和冰温贮藏中高浓度CO2无氧包装向后续HiOx-MAP转换过程中的微生物群落和VOCs动态变化及二者间的关系，旨在开发可以用于改善DC牛肉感官特性的气调转换包装方式，本研究有望为研究气调转换包装牛肉的腐败代谢和预测其新鲜度提供有价值的信息。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

平板计数琼脂（plate count agar，PCA）、蛋白胨北京陆桥技术股份有限公司；4-甲基-1-戊醇上海源叶生物科技有限公司；ShannuoTM DNA提取试剂盒天津佳美科技术有限公司。

1.2 仪器与设备

包装材料：高阻隔收缩袋（SP21，O2透过率（23 ℃）：20 mL/（m2·24 h），水蒸气透过率（38 ℃）：5 g/（m2·24 h））、PP托盘（TQBC-0775，O2透过率（23 ℃/相对湿度0%）：10 mL/（m2·24 h），水蒸气透过率（38 ℃/相对湿度90%）：15 g/（m2·24 h））、DLS-25吸水垫、Lid1050密封阻隔膜（O2透过率（23 ℃/相对湿度0%）：25 mL/（m2·24 h），水蒸气透过率（4 ℃/相对湿度100%）：10 g/（m2·24 h））希悦尔包装（上海）有限公司。

DZQ-600L台式外抽真空（充气）包装机浙江佑天元包装机械制造有限公司；DT-6D气调包装机中国大江机械设备有限公司；BagMixer®400拍打器法国英特塞恩斯有限公司；GCMS-QP2010气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪日本岛津公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS纤维萃取头美国Supelco公司；HH-4数显恒温水浴锅常州国华电器有限公司；5804R离心机德国Eppendorf公司。

1.3 方法

随机选取6 头西门塔尔杂交牛左右两侧的背最长肌腰段（pH≈6.4），真空包装后0～4 ℃条件下运回实验室。在实验室中将腰背最长肌分切为2.54 cm牛排，并将每块牛排各自装入托盘后，每2 块牛排放入一个母袋中，随机进行高浓度CO2母袋包装（H：80% CO2/20% N2，80% CO2 MP）、低浓度CO2母袋包装（L：40% CO2/60% N2，40% CO2 MP）和VP（V：对照组），将包装好的牛排分别在4 ℃（C：冷却）和-1.5 ℃（S：冰温）下贮藏（n＝6）。检测未包装前牛排的菌落总数、微生物多样性、VOCs和感官指标作为初始数据，并在贮藏14、21 d分别取出其中一块牛排测定上述指标；取出另一块牛排再进行HiOx-MAP（O：60% O2/40% CO2，60% O2 MAP），在4 ℃条件下货架展示14 d后，打开包装，测定牛排的上述指标。

1.3.2 菌落总数的测定

参照Yang Xiaoyin等[18]的方法使用PCA培养基计数测定菌落总数。

参照Chen Xue等[19]的方法稍作修改，在每个贮藏和货架展示时间点使用100 mm线标尺由10 名经实验室培训的小组成员（5男5女）对不同包装牛排进行感官评分，牛排感官评分标准如表1所示。

根据Yang Jun等[17]的方法，采用顶空固相微萃取法萃取DC牛排中的VOCs，并使用GC-MS系统进行分析。根据NIST11和NIST11s数据库对测定的VOCs进行定性，使用内标法（内标为4-甲基-1-戊醇，在顶空瓶中的终含量为2 000 μg/kg）对鉴定的VOCs进行定量。

GC-MS测定条件：DB-5色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），质谱源和四极杆温度分别为230 ℃和150 ℃，柱箱温度在40 ℃保持5 min后，4 ℃/min升温至150 ℃，然后30 ℃/min升温至250 ℃，保持5 min，电子能量设置为70 eV，扫描范围为29～350 m/z。

1.3.5 微生物多样性分析

从不同包装的DC牛排中提取贮藏和展示过程中的细菌基因组总DNA，DNA提取操作及聚合酶链式反应扩增程序如Yang Jun等[20]描述。测序后，以97%的相似度将DNA测序数据聚类成操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）并筛选出代表序列，通过SILVA数据库对OTU代表序列进行对比，在分类学上划分OTU。

1.4 数据处理

菌落数和VOCs采用SAS（9.0，美国SAS软件研究所）混合模型进行显著性分析，差异显著水平为P＜0.05。在第1部分贮藏实验中，母袋包装类型、贮藏温度、贮藏时间及其交互作用作为固定效应，牛个体作为随机效应。在第2部分展示实验中，母袋包装类型、贮藏温度、贮藏时间、展示时间及其交互作用作为固定效应，牛个体作为随机效应。应用Origin 2018软件（美国OriginLab公司）作图。利用SIMCA 14.1软件（德国Sartorius公司）通过正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）研究感官特征与VOCs含量之间的关系。以贮藏期间的VOCs含量为因变量，以OTU为自变量，采用SPSS 18.0软件（美国IBM公司）利用逐步多元线性回归分析丰度排名前10的OTU与VOCs之间的关系。

2 结果与分析

2.1 贮藏和展示期间不同母袋包装类型和贮藏温度对DC牛排菌落总数的影响

贮藏过程中，母袋包装类型、贮藏时间和贮藏温度的交互作用对DC牛排菌落总数影响显著（图1A，P＜0.05）。除冰温贮藏14 d外，冰温或冷却贮藏期间的充CO2无氧包装DC牛排的菌落总数显著低于VP牛排，且80% CO2 MP牛排菌落总数始终低于40% CO2 MP牛排，这表明随着CO2浓度的升高，其抑菌效果逐渐增强。在冷却或冰温贮藏21 d后，3 种包装牛肉的菌落总数均未超过微生物的腐败限值（7（lg（CFU/g）））[21]。80% CO2 MP的牛排冷却贮藏至21 d菌落总数为3.25（lg（CFU/g）），40% CO2 MP牛排为4.95（lg（CFU/g）），VP牛排为6.63（lg（CFU/g）），但3 种包装牛排冰温贮藏21 d的菌落总数显著低于其在冷却贮藏21 d的菌落总数。在21 d冰温贮藏期间，80% CO2 MP和40% CO2 MP牛排的菌落总数与初始值相比并没有显著变化，意味着冰温结合高浓度CO2无氧包装具有优越的协同抑菌效果。

展示过程中，母袋包装类型、贮藏温度和展示时间的交互作用对牛排菌落总数的影响显著（图1B）；此外，贮藏时间、贮藏温度和展示时间的交互作用也对牛排菌落总数影响显著（图1C，P＜0.05）。随货架展示时间延长，前期不同温度贮藏的各种包装牛排的菌落总数均显著升高（图1B）。冰温贮藏显著降低了后续展示期间牛排的细菌生长速率（图1B、C）。冰温贮藏14 d后展示14 d的菌落总数显著低于冰温贮藏21 d后展示14 d的菌落总数（图1C）。无论前期采用哪种母袋包装类型，牛排经冰温贮藏后再HiOx-MAP货架展示14 d，其菌落总数显著低于前期冷却贮藏后HiOx-MAP展示的牛排，且均未达到7（lg（CFU/g））的腐败阈值，只有3 种包装配合冷却贮藏的牛排在货架展示14 d后超过7（lg（CFU/g））（图1B）。相较于其他贮藏包装方式，80% CO2 MP冰温贮藏牛排展示期间的菌落总数始终处于最低水平（P＜0.05），展示14 d时牛排菌落总数仅为5.41（lg（CFU/g））。VP冷却牛排在货架展示14 d后菌落总数最高，达到8.44（lg（CFU/g））。因此，高浓度CO2无氧包装结合冰温贮藏21 d后即便在后期HiOx-MAP展示过程中均能有效将DC牛排的货架期延长至14 d以上。

2.2 贮藏和展示期间不同母袋包装类型和贮藏温度对DC牛排感官品质的影响

如图2A～C所示，贮藏期间，母袋包装类型与贮藏时间的交互作用对贮藏牛排打开包装前的肉色、打开包装后的异味和气味新鲜度及打开包装15 min后的肉色和总体印象均影响显著。3 种包装牛排的总体印象随着贮藏时间的延长显著降低，贮藏14 d和21 d，40% CO2 MP牛排打开包装前的肉色评分和总体印象显著优于80% CO2 MP和VP牛排（P＜0.05）。80% CO2 MP牛排打开包装后的异味明显强于40% CO2 MP和VP牛排，评分为17.10，这可能是由于厌氧乳酸菌在高浓度CO2环境下增殖，产生一种特殊的CO2异味[22]。打开包装15 min后，仅贮藏时间这一主效应对异味有显著影响（P＜0.05），且异味随着贮藏时间的延长而增大，而母袋包装类型对牛排打开包装15 min后的异味影响并不显著，这是因为打开包装15 min后，高浓度CO2产生的异味大量消散，这也说明80% CO2 MP牛排打开包装后的气味新鲜度评分显著低于CO2包装牛排，这可能是因为VP冷却牛排贮藏末期达到临界腐败状态，微生物的生长产生了令人不愉快的异味。

如图2D～F所示，母袋包装类型、贮藏时间、贮藏温度和展示时间的交互作用对展示牛排打开包装前的肉色及打开包装15 min后的肉色影响显著（P＜0.05）。HiOx-MAP货架展示显著提高了品评小组成员对各贮藏时间点的不同母袋包装类型和温度贮藏牛肉展示后肉色的喜爱度，这可能是由于高浓度氧气使牛肉表面暗紫红色的脱氧肌红蛋白转化为鲜红色的氧合肌红蛋白，进而吸引消费者[23]。各包装冰温贮藏21 d后再货架展示14 d的牛肉打开包装前的肉色显著优于冷却贮藏牛肉的展示肉色。80% CO2 MP冷却贮藏牛排在展示14 d后打开包装前的肉色显著优于40% CO2 MP和VP冷却贮藏牛排的后续展示肉色，评分分别为72.91、68.32、57.58。母袋包装类型、贮藏时间和展示时间对牛排打开包装后的异味影响显著（P＜0.05）。VP贮藏21 d后的牛排随着货架展示时间延长，异味显著增强，评分为15.29；而80% CO2 MP贮藏牛排随着展示时间延长异味评分均显著降低。包装方式、贮藏温度、贮藏时间和展示时间两两交互作用对气味新鲜度和总体印象影响显著。货架展示14 d后，80% CO2 MP牛排的气味新鲜度均显著高于40% CO2 MP和VP牛排，这主要得益于CO2对微生物生长和代谢活动的有效抑制作用[24]。上述感官结果表明，80% CO2 MP冰温贮藏后采用60% O2 MAP货架展示可有效改善DC牛排肉色，延缓其腐败异味的产生，进而获得更高的整体感官接受度。

2.3 贮藏和展示期间不同母袋包装类型和贮藏温度对DC牛排VOCs含量的影响

如表2、3所示，在贮藏过程中，共检测到13 种VOCs，包括醇类、醛类、酮类和己酸乙烯酯。母袋包装类型、贮藏温度和贮藏时间的交互作用对大多数VOCs的含量影响显著（P＜0.05），分别为醛类（己醛、壬醛）、醇类（1-辛醇、1-戊醇、1-庚醇、1-辛烯-3-醇、1-己醇、3-甲基-1-丁醇、3-甲基-3-庚醇）、己酸乙烯酯和双乙酰。与贮藏初期相比，经3 种母袋包装（80% CO2 MP、40% CO2 MP、VP）冰温和冷却贮藏21 d后，3-甲基-3-庚醇和双乙酰含量均显著增加。贮藏温度并未对80% CO2 MP组的3-甲基-3-庚醇和双乙酰含量造成显著差异；冰温VP贮藏末期的DC牛排产生的3-甲基-3-庚醇和双乙酰含量显著低于冷却VP贮藏的DC牛排。值得注意的是，40% CO2 MP冰温贮藏21 d的DC牛排产生的3-甲基-3庚醇、双乙酰含量高于该母袋包装下的冷却贮藏DC牛排。母袋包装类型和贮藏时间的交互作用对乙偶姻的含量影响显著，随着贮藏时间延长，3 种母袋包装牛排中的乙偶姻含量均显著增加，且80% CO2 MP、40% CO2 MP组贮藏21 d的乙偶姻含量显著低于VP组。双乙酰和乙偶姻是α-乙酰乳酸代谢途径的终产物，其通常由乳酸菌（如明串珠菌、鱼乳球菌）、热杀索丝菌等细菌代谢产生，并会使肉产生黄油、奶酪等异味[25-27]。除80% CO2 MP母袋包装冰温贮藏外，己醛含量在其他母袋包装贮藏期间显著增加，并在VP冷却贮藏21 d时达到最高值，这可能由沙雷氏菌产生[28]。此外，3-甲基-1-丁醇在80%和40% CO2 MP冰温贮藏下均未检出，但在其他包装中含量显著增加。与40% CO2 MP和VP冰温贮藏相比，80% CO2 MP可将DC牛排的壬醛、1-戊醇、1-己醇、1-辛醇、1-辛烯-3-醇和己酸乙烯酯等VOCs含量显著降低。以上结果均表明，CO2母袋包装贮藏通过抑制细菌生长降低了VOCs的含量，较高浓度CO2抑制VOCs的能力更强。冰温与CO2母袋包装贮藏协同作用更能抑制VOCs的产生。

如表4、5所示，在展示期间，共检测到17 种VOCs，其中1-庚醇、2-辛烯-1-醇、1-壬烯-4-醇、2-庚酮和2-辛酮是DC牛排展示期间特有的VOCs。母袋包装类型、贮藏时间、贮藏温度和展示时间的交互作用对双乙酰、3-甲基-3-庚醇和1-壬烯-4-醇有显著影响。除VP外，2 种CO2 MP贮藏牛肉的双乙酰含量均随展示时间延长显著增加。母袋包装类型、贮藏时间和展示时间的交互作用对己醛和2-辛烯-1-醇含量影响显著。40% CO2 MP牛排贮藏14 d后展示14 d的己醛含量显著低于80% CO2 MP和VP处理的样品。2-辛烯-1-醇在2 种CO2 MP贮藏21 d后再展示14 d的含量显著高于各自包装贮藏14 d后展示14 d。母袋包装类型、贮藏温度和展示时间的交互作用对壬醛、3-甲基-1-丁醇有显著影响。80%和40% CO2 MP冰温牛排后展示14 d的壬醛含量高于VP冰温牛排（P＜0.05）。得益于80% CO2 MP较好的抑菌效果，其在展示14 d时具有最低的3-甲基-1-丁醇含量，该物质的含量在40% CO2 MP和VP组中依次升高（P＜0.05）。此外，冰温贮藏也降低了牛排在40% CO2 MP和VP贮藏后展示14 d的3-甲基-1-丁醇含量。这些结果表明，在前期贮藏期间采用不同的母袋包装类型和贮藏温度会影响展示期间DC牛排的VOCs含量。贮藏时间、贮藏温度和展示时间的交互作用对1-庚醇、1-戊醇和2-庚酮的含量影响显著。在贮藏14 d或21 d之后，冰温及冷却贮藏条件下的1-庚醇、1-戊醇和2-庚酮含量随着展示时间的延长而升高。冰温贮藏21 d后展示14 d牛排的1-庚醇、1-戊醇和2-庚酮含量显著高于冰温贮藏14 d后展示14 d的含量。冷却贮藏21 d后展示14 d的1-戊醇含量高于冷却贮藏14 d后展示14 d的含量。有研究发现，2-庚酮和2-辛酮等酮类化合物是牛肉中的芳香化合物或化学氧化产物[29]。这些物质的较高含量可能会使DC牛排感官异味产生差异。本研究还发现，贮藏温度和展示时间的交互作用对1-辛烯-3-醇、己酸乙烯酯和2-辛酮的影响显著，随着展示时间延长，这3 种物质的含量逐渐升高，前期冰温贮藏促进了这3 种物质的生成。

2.4 贮藏和展示期间不同母袋包装类型和贮藏温度下DC牛排微生物多样性分析

在贮藏和展示期间总共检测到19 种细菌属，DC牛排初始微生物群落主要由栖热菌、假单胞菌、乳杆菌和不动杆菌组成（图3）。这些细菌大部分来自于屠宰加工环境，如土壤、水源、屠宰刀具等[30-31]。贮藏期间，CO2 MP组微生物多样性演变趋势比VP组更复杂，这可能是由于VP牛排中优势微生物的快速生长降低了其他细菌的相对丰度，而CO2凭借其抑菌效果将微生物群落始终维持在类似于初始状态的复杂菌群结构中。在40% CO2 MP冷却或冰温贮藏末期，优势细菌为肉食杆菌，其次是环丝菌，而冷却80% CO2 MP牛排在贮藏21 d时沙雷氏菌、嗜冷杆菌、葡萄球菌的相对丰度明显增加。对于冰温80% CO2 MP，肉食杆菌也逐渐成为优势细菌。在整个VP冰温贮藏期间，肉食杆菌也是最常见的细菌属。在VP冷却贮藏14 d时，肉食杆菌和环丝菌为主要的细菌，然而气单胞菌和沙雷氏菌逐渐成为VP冷却牛排贮藏末期的优势细菌。研究发现，肉食杆菌、明串珠菌被确定为厌氧环境下导致牛肉腐败的主要微生物[32]，肉食杆菌能够在低温、高浓度CO2环境中快速生长，并通过产生有机酸和细菌素等来抑制其他细菌的生长[33]。本研究还发现，不论何种母袋包装类型及温度贮藏的牛排经过HiOx-MAP展示之后，肉食杆菌的丰度都占绝对优势。已有研究表明，肉食杆菌可用作生物保护菌来延长肉类的保质期并提高肉类的安全性[34]。因此，肉食杆菌作为母袋包装贮藏及HiOx-MAP展示期间特定的腐败微生物菌群，可能有利于延缓DC牛排腐败进程。

2.5 VOCs与异味的相关性分析

OPLS-DA（图4A）展示了DC牛肉母袋包装贮藏及HiOx-MAP展示期间感官异味特征与VOCs的关系。贮藏和展示期间的样品分别位于图中的左右两侧，这说明贮藏和展示期间样品的感官异味特征差异较大。贮藏期间的DC牛排样品与其异味及气味新鲜度相关性较低，因此贮藏期间产生的VOCs并不会导致感官异味。打开包装15 min后的异味与经VP冷却贮藏后的展示样品（OVC 14 d、OVC 21 d）呈正相关，这与感官评价中异味评分变化一致，均表明VP冷却贮藏牛排在展示期间会由于微生物大量生长而导致DC牛排产生令人不愉快的异味。

变量投影重要性（variable importance projection，VIP）是反映自变量对因变量解释能力的重要指标，其值越大，说明该自变量对因变量的解释能力越强，一般VIP＞1时，自变量在解释因变量时具有重要性[35]。由图4B可知，本研究中VIP值大于1的VOCs为1-辛烯-3-醇（V6，2.39）、1-戊醇（V3，1.58）、己酸乙烯酯（V10，1.24）、2-辛烯-1-醇（V13，1.14）、己醛（V1，1.05）和1-己醇（V4，1.01），表明这6 种VOCs对DC牛排贮藏过程中产生的异味贡献最为显著。然而上述6 种VOCs与异味、气味新鲜度和打开包装15 min后的异味无关，并不会赋予牛排持续的难闻异味，这与本研究的感官评价结果一致。

2.6 细菌生长与VOCs的相关性分析

不同细菌利用肉中糖、氨基酸等营养物质的能力不同，进而会产生的不同的VOCs[12]。为清晰展示整个贮藏和展示期间不同母袋包装类型及贮藏温度中细菌演替与VOCs变化间的关系，本研究将贮藏21 d配合展示14 d期间排名前10的OTU与VOCs建立了逐步回归模型。如表6所示，80% CO2 MP冰温贮藏经高氧展示后的DC牛排中，明串珠菌和肠球菌是导致己醛和己酸乙烯酯产生的主要微生物；1-戊醇和1-己醇由明串珠菌和李斯特菌的生长导致；肉食杆菌的生长则导致双乙酰的产生；明串珠菌是2-辛烯-1-醇产生的原因。在40% CO2 MP冰温贮藏经高氧展示后的DC牛排中，沙雷氏菌是3-甲基-3-庚醇和双乙酰产生的主要微生物；明串珠菌和环丝菌的交互生长导致1-戊醇和1-己醇的产生；明串珠菌是产生1-辛烯-3-醇和2-辛烯-1-醇的主要微生物。对于VP冰温贮藏后经高氧展示的DC牛排，肠球菌是导致1-戊醇和己酸乙烯酯产生的主要原因；环丝菌和沙雷氏菌的交互生长则可产生己醛，而1-己醇与环丝菌呈正相关。

鉴于肉食杆菌是无氧包装（冰温和冷却贮藏）向高氧HiOx-MAP转换过程中的优势细菌（图3B），本研究发现肉食杆菌是80% CO2 MP冷却贮藏配合高氧展示牛排产生双乙酰、己酸乙烯酯、1-己醇、1-辛烯-3-醇和2-辛烯-1-醇的主要细菌。在40% CO2 MP冷却贮藏后的高氧展示牛排中，肉食杆菌则是产生双乙酰、己醛和3-甲基-3-庚醇的关键微生物，另外，肉食杆菌和沙雷氏菌的交互生长则导致2-辛烯-1-醇和1-壬烯-4-醇的产生。对于经VP冷却贮藏的高氧展示牛排，沙雷氏菌和肉食杆菌的生长导致己醛和1-辛烯-3-醇的产生[36]，沙雷氏菌和明串珠菌的生长则增加了1-戊醇的含量，肠球菌可促进2-辛烯-1-醇的产生。因此，肉食杆菌、沙雷氏菌和明串珠菌的生长可能是造成DC牛排整个贮藏及展示期间异味产生的主要原因。

3 结论

相较于CO2母袋包装和VP冷却贮藏的DC牛排，经CO2母袋包装与冰温协同贮藏的牛排具有更高的气味新鲜度和肉色评分。其中80% CO2 MP冰温贮藏更有利于抑制微生物生长和VOCs的产生，进而延长DC牛排的贮藏货架期。HiOx-MAP展示过程中，经冰温VP和CO2母袋包装贮藏DC牛排的1-辛烯-3-醇等关键VOCs含量显著低于VP冷却贮藏后的牛排，赋予牛排更好的气味新鲜度。使用CO2母袋包装贮藏DC牛排的微生物多样性比VP包装牛排微生物多样性更复杂，但在HiOx-MAP展示后肉食杆菌成为各种包装体系下的优势微生物。DC牛排贮藏与展示期间，肉食杆菌、沙雷氏菌及明串珠菌的交互生长可能是导致DC牛排异味产生的主要微生物。未来可通过代谢组学对不同包装条件下特定关键菌群的代谢活动开展进一步研究，从而深入了解该菌内在代谢通路对气调包装DC牛排产生特定VOCs的作用机制。

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