图1 苯甲酸和马尿酸含量相关性分析
Fig. 1 Correlation analysis between benzoic acid and hippuric acid contents
Analysis of Benzoic Acid Content in Beef
王娟强, 孔维恒, 王明立, 等. 牛肉中苯甲酸含量分析[J]. 肉类研究, 2024, 38(3): 24-29.DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20240304-050. http://www.rlyj.net.cn
WANG Juanqiang, KONG Weiheng, WANG Mingli, et al. Analysis of benzoic acid content in beef[J]. Meat Research, 2024,38(3): 24-29. (in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20240304-050. http://www.rlyj.net.cn
苯甲酸，又称安息香酸，是一种芳香酸类有机化合物，苯甲酸钠是苯甲酸的钠盐，价格低廉，更易溶于水，在酸性食品中能部分转化为有活性的苯甲酸。苯甲酸及其钠盐是我国最常用的食品添加剂之一，GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》规定，苯甲酸及其钠盐作为防腐剂，允许用于酱油、配制酒等22 类食品中，最大使用量为0.2～2.0 g/kg（以苯甲酸计），而肉及肉制品中均不允许添加苯甲酸[1]。国外大多数国家允许使用苯甲酸钠作为食品防腐剂[2-4]，在欧洲和澳大利亚，苯甲酸和苯甲酸钠可以用于肉制品[3]；在加拿大，苯甲酸和苯甲酸钠可以用于带包装的肉制品；在印度，苯甲酸钠被认为广泛存在于自然界中，接近天然添加剂，可以在肉制品中作为食品防腐剂使用；美国农业部食品安全检验局也在2013年批准苯甲酸钠用于肉制品，最大限量为0.1%（以质量计）[4]。苯甲酸钠的急性毒性较小，动物最大无作用剂量为500 mg/kg，但其在人体肠道的酸性环境下可转化为毒性较强的苯甲酸，苯甲酸在动物体内一般会很快降解，大量苯甲酸主要与甘氨酸结合形成马尿酸，随尿液排出[5-6]。联合国粮农组织和世界卫生组织1994年规定，苯甲酸的每日允许摄入量为0～5 mg/kg，过量摄入苯甲酸会损害神经系统、破坏细胞平衡、产生有毒物质，严重威胁人体健康[7-8]。
苯甲酸分子质量小，广泛存在于自然界中。在各种谷物、蔬菜、水果、豆类、坚果及原料乳中均天然存在一定量苯甲酸[9-10]。目前对内源性苯甲酸的报道多为植物源性食品[11-13]，而动物源性食品主要为蜂蜜[14]和发酵乳制品[15-16]，关于畜肉中苯甲酸含量研究的相关报道较少，畜肉中是否天然存在苯甲酸尚不明晰。注水肉一直是消费者关注的食品安全问题，由于注水肉所用水质不卫生，肉的腐败变质会加快，极易引发其他病原微生物污染。近年来不法商贩为降低畜肉注水后的腐败速率，注水时违法添加苯甲酸钠等防腐剂，制造、销售添加苯甲酸及其钠盐的注水肉，严重影响消费者的利益及身体健康。然而，由于国内外牛肉中苯甲酸本底含量的相关研究报道较为缺乏，导致判断牛肉中苯甲酸是天然存在还是非法添加存在困难，给食品安全监管部门及相关生产企业带来很大的困扰。此外，苯甲酸在动物体内大部分代谢为马尿酸，是否可通过马尿酸含量反映苯甲酸残留也尚不清楚。因此，本研究主要针对牛肉中苯甲酸及其代谢物马尿酸含量进行研究，通过剖析牛肉中二者含量范围分析其主要风险来源，提出监管建议，对政府食品安全监管、企业进行质量控制及社会公众参与食品安全社会共治具有重要意义。
样本采集：近5 年从全国多个屠宰场、批发市场和超市收集共1 660 个牛肉样本；从不同屠宰场和批发市场共购买收集340 个牛肉样本；从屠宰场采集屠宰企业自有牧场出栏后屠宰的牛肉样本共计50 个。3 组样本采样地均不相同。
甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵（均为色谱纯）、马尿酸（纯度98%） 德国CNW公司；乙腈、甲醇、乙酸（均为分析纯）、亚铁氰化钾、乙酸锌 国药集团化学试剂有限公司；水为一级水；苯甲酸钠（纯度98.94%）德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。
ExionLC高效液相色谱仪-QTRAP 5500串联四极杆质谱仪 美国AB SCIEX公司；UltiMate 3000高效液相色谱仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；S-100涡旋仪日本Taiyo公司；CR21N离心机 日本Hitachi公司；Milli-Q纯水仪 美国Millipore公司；PRiME HLB固相萃取柱 沃特世科技（上海）有限公司；HSE-12D固相萃取装置、HGC-24A氮吹仪 天津市恒奥科技发展有限公司；AUW220电子天平（分度值0.1 mg） 日本Shimadzu公司。
1.3.1 样品前处理
按照GB 5009.28—2016《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》[17]采用液相色谱法对1 660 个牛肉中苯甲酸含量进行测定：称取约2 g（精确至0.001 g）牛肉试样于离心管中，加水约25 mL，涡旋混匀，于50 ℃水浴超声20 min，冷却至室温后加入亚铁氰化钾溶液（92 g/L）和乙酸锌溶液（183 g/L）各2 mL，混匀，于8 000 r/min离心5 min，将水相转移至50 mL容量瓶中，残渣中加水20 mL，涡旋混匀后超声5 min，于8 000 r/min离心5 min，将水相转移至同一50 mL容量瓶中，用水定容，混匀。取适量上清液过0.22 μm滤膜，待液相色谱测定。
按照王娟强等[18]的方法，采用超高效液相色谱-串联质谱法对从不同屠宰场和批发市场收集的340 个牛肉样本及屠宰企业自有牧场收集的50 个牛肉样本中苯甲酸及其代谢物马尿酸进行测定：称取样品2 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入10 mL甲醇，加盖后涡旋提取20 min，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，将2 mL上清液过PRiME HLB固相萃取柱，用2 mL甲醇洗脱，收集全部流出液，在40 ℃以下氮气吹至近干（0.5 mL），加入0.5 mL水，涡旋复溶，过0.22 μm滤膜，待测。
1.3.2 液相色谱法检测牛肉中苯甲酸
采用GB 5009.28—2016液相色谱法。Phenomenex Kinetex C18色谱柱（3.0 mm×50 mm，2.6 μm）；柱温30 ℃；进样量10 μL；流动相A为20 mmol/L乙酸铵溶液（含2 mmol/L甲酸）；流动相B为甲醇；流速1 mL/min；紫外检测器。苯甲酸检出限5 mg/kg，定量限10 mg/kg[17]。
1.3.3 超高效液相色谱-串联质谱法检测牛肉中苯甲酸及其代谢物马尿酸
色谱条件：Phenomenex Luna Omega Polar C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；柱温30 ℃；进样量5 μL；流动相A为5 mmol/L乙酸铵溶液（含体积分数0.1%甲酸）；流动相B为乙腈；流速0.4 mL/min。
质谱条件：电喷雾离子源负离子模式；离子化电压4 500 V；气帘气压力30 psi，雾化气压力55 psi，辅助气压力60 psi；雾化温度550 ℃；多反应模式监测苯甲酸离子对m/z 121/77、121/121和马尿酸离子对m/z 178.1/77、178.1/134。此方法马尿酸的检出限和定量限分别为2.5、10 μg/kg。苯甲酸检出限12.5 μg/kg，定量限50 μg/kg[18]，远低于GB 5009.28—2016中液相色谱法检出限和定量限，有利于低含量苯甲酸检测。
按照世界卫生组织全球环境监测系统/食品污染监测与评估规划第二次会议“食品中低水平污染物可信评鉴”中对未检出数据的处理原则[13]，本研究中未检出及低于检出限数据的处理方法为：当未检出率小于60%时，未检出数据以1/2检出限代替；当未检出率高于60%时，未检出数据以检出限代替。采用SPSS 20.0软件对数据进行整理和统计分析，采用Origin 9.1软件作图。
为获取来源明确且确保不是外源添加苯甲酸的牛肉，从3 个屠宰场采集屠宰企业自有牧场出栏后屠宰的牛肉样本50 个，测定牛肉中苯甲酸和马尿酸含量。由图1可知，苯甲酸含量范围为未检出至185.68 μg/kg，大于定量限（50 μg/kg）的样本有19 个，均远小于10 mg/kg。马尿酸均有检出，含量范围为20.73～488.71 μg/kg，含量低于0.40 mg/kg的样本占92.0%（46/50）。表明牛肉中均含有微量苯甲酸和马尿酸，含量较低。对苯甲酸及其代谢物马尿酸含量进行Pearson相关性分析，以确证马尿酸残留量是否可以反映苯甲酸残留量。Pearson相关系数（r）的取值范围为-1～1，其绝对值越接近1，相关性越强，绝对值越接近于0，相关性越弱；此外，当r＜0时说明2 个变量之间呈现负相关，r＞0则为正相关[19-20]。苯甲酸与马尿酸含量之间的r＝-0.01，表示二者为负相关，且相关性极弱，含量之间未呈现一定规律，因此马尿酸含量不能反映苯甲酸残留情况。
图1 苯甲酸和马尿酸含量相关性分析
Fig. 1 Correlation analysis between benzoic acid and hippuric acid contents
对近5 年市场中1 660 个牛肉样本中苯甲酸残留量进行测定。统计分析结果显示，苯甲酸含量小于10 mg/kg的样本占94.7%。将大于定量限的样本列为问题样本，占5.3%（88/1 660），结果列于表1，苯甲酸含量范围为0.03～0.98 g/kg。由表1和图2可知，在所有问题样本中，苯甲酸含量均大于20 mg/kg，主要集中在0.05～0.40 g/kg，占86.4%（76/88）。大于40 倍定量限的样本有8 个，含量为0.41～0.98 g/kg。结果表明，牛肉中苯甲酸残留问题较为严峻，亟需明确本底情况，以判定其来源，为企业质量控制和实际监管提供科学依据。
表1 近5 年问题牛肉样本中苯甲酸含量
Table 1 Content of benzoic acid in problematic beef in the past 5 years g/kg
样品序号苯甲酸含量10.08 230.36 450.21 670.37 20.22 240.22 460.53 680.18 30.27 250.37 470.19 690.27 40.07 260.39 480.06 700.20 50.32 270.14 490.19 710.23 60.06 280.15 500.37 720.22 70.31 290.57 510.16 730.13 80.16 300.54 520.13 740.03 90.25 310.44 530.14 750.03 100.39 320.19 540.34 760.20 110.24 330.22 550.08 770.03 120.15 340.33 560.06 780.09 130.25 350.11 570.09 790.12 140.05 360.12 580.28 800.39 150.04 370.38 590.14 810.12 160.08 380.19 600.33 820.22 170.17 390.10 610.30 830.23 180.20 400.09 620.47 840.09 190.25 410.39 630.18 850.24 200.16 420.98 640.41 860.09 210.11 430.08 650.08 870.45 220.23 440.09 660.13 880.18苯甲酸含量样品序号苯甲酸含量样品序号苯甲酸含量样品序号
图2 近5 年问题牛肉样本中苯甲酸含量分布
Fig. 2 Distribution of benzoic acid contents in problematic beef in the past 5 years
为进一步确定牛肉中苯甲酸含量水平，采用灵敏度更高的超高效液相色谱-串联质谱法对屠宰场和批发市场收集的340 个牛肉样本中苯甲酸及其代谢物马尿酸含量进行测定，通过统计分析牛肉中苯甲酸和马尿酸含量的中位数、平均值及绘制含量分布图，可较为直观显示牛肉中苯甲酸及马尿酸含量水平及离散程度。
由表2可知，苯甲酸含量为未检出至131.41 mg/kg，平均值为2.75 mg/kg，中位数为0.10 mg/kg，苯甲酸含量低于12.5 μg/kg视为未检出，在340 批次牛肉中212 批次检出苯甲酸，检出率为62.4%。
表2 牛肉中苯甲酸和马尿酸含量
Table 2 Contents of benzoic acid and hippuric acid in beef
注：ND.未检出。
最大值/（mg/kg）苯甲酸62.42.75ND0.10131.41马尿酸100.00.155.66×10-30.101.15化合物检出率/%均值/（mg/kg）最小值/（mg/kg）中位数/（mg/kg）
以5 mg/kg为1 个区间，绘制苯甲酸的含量分布图。由图3可知，牛肉中苯甲酸呈偏态分布。由图3、4可知，苯甲酸含量低于0.05 mg/kg的样本共154 批次，占总样本量的45.3%，含量0.05～0.50 mg/kg的样本占比较高（45.88%）、含量0.5～5.0 mg/kg的样本有10 个、含量5～10 mg/kg的样本有4 个。苯甲酸含量高于10 mg/kg的问题样本占4.70%（16/340），问题样本中苯甲酸含量为20.42～131.41 mg/kg。总体来说，随机抽取的340 批次牛肉样本中苯甲酸含量大多（91.18%）小于0.50 mg/kg，含量远低于国家规定的小于10 mg/kg要求。表明牛肉中可能天然存在微量苯甲酸，但同时检测结果发现存在苯甲酸含量较高的牛肉样本，这些样本的苯甲酸来源需进一步确定。
图3 牛肉中苯甲酸含量分布
Fig. 3 Distribution of benzoic acid contents in 340 beef samples
图4 牛肉中苯甲酸含量分布占比
Fig. 4 Percentage distribution of benzoic acid contents in 340 beef samples
由表2可知，340 个牛肉样本中马尿酸含量范围为5.66×10-3～1.15 mg/kg，平均值为0.15 mg/kg，中位数为0.10 mg/kg。以0.1 mg/kg为1 个区间，绘制马尿酸的含量分布图，由图5、6可知，马尿酸含量在0.01～0.10、0.10～0.20 mg/kg区间的样本占比较高，分别为50.00%和24.71%。58 批次样本中马尿酸含量为0.20～0.40 mg/kg，占总样本量的17.06%。由此看出94.1%牛肉样本中马尿酸含量低于0.40 mg/kg，仅20 批次样本含量较高，超过0.40 mg/kg，占总样本量的5.88%。马尿酸含量低于2.5 μg/kg视为未检出，340 份牛肉中均检出马尿酸，检出率为100.0%，表明牛肉样本中均含有一定量马尿酸。
图5 牛肉中马尿酸含量分布
Fig. 5 Distribution of hippuric acid contents in 340 beef samples
图6 牛肉中马尿酸含量分布占比
Fig. 6 Percentage distribution of hippuric acid contents in 340 beef samples
2.4.1 苯甲酸在养殖环节的应用
我国《饲料添加剂品种目录（2013）》将苯甲酸作为酸度调节剂和防腐剂，允许在畜禽饲粮中使用，尚无添加限量规定[21]。2003年欧盟正式允许在猪饲粮中添加0.5%～1.0%苯甲酸作为酸化剂；2018年欧盟委员会正式允许将苯甲酸作为饲料添加剂，其作为断奶仔猪饲料添加剂的最大用量为5 000 mg/kg，作为育肥猪饲料添加剂的最大用量为10 000 mg/kg；2020年欧盟委员会发布条例批准苯甲酸作为育肥猪的饲料添加剂，饲料中含量范围为3 000～10 000 mg/kg[22-23]。
目前，苯甲酸主要用于家禽、猪、反刍动物等畜禽的养殖[24-26]。科学、合理饲喂添加苯甲酸的饲料不会造成苯甲酸在动物体内大量残留。Kristensen等[6]研究表明，在生长猪日粮中添加1.0%（m/m）苯甲酸时，苯甲酸能在8 h内被肝脏有效吸收并迅速被肾脏排出。但是过量饲喂苯甲酸会对动物机体造成损害，导致苯甲酸在动物组织器官残留。Shu Yan等[27]研究发现，日粮添加2.5%或5.0%苯甲酸组的猪肝脏和肾脏中苯甲酸残留量高于0.5%苯甲酸组；日粮添加2.5%苯甲酸、饲喂28 d后仔猪肝脏中苯甲酸残留量约20 mg/kg、肾脏中苯甲酸残留量约300 mg/kg；日粮添加5%苯甲酸、饲喂28 d后仔猪肝脏中苯甲酸残留量约200 mg/kg、肾脏中苯甲酸残留量约500 mg/kg，表明摄入过量苯甲酸会导致苯甲酸在仔猪组织器官中累积，进而导致仔猪器官受损。
2.4.2 人为非法添加苯甲酸
目前，违法添加苯甲酸的“注水牛肉”问题较为严峻，是牛肉中苯甲酸残留问题风险来源的重要因素。2020年5月，执法机构在屠宰现场发现有固体粉末，并在获取的可疑牛肉样本中检出苯甲酸及瓜尔豆胶，4 个样本含量均超过20 mg/kg，其中2 个样本检测结果甚至超过300 mg/kg。2022年8月，天津市武清区执法人员查办发现不法分子在肉牛屠宰过程中将灌注管插入牛主动脉，灌注苯甲酸钠、瓜尔豆胶、氯化镁和水的混合物，滥用添加剂制售注水牛肉，执法人员现场抽取牛肉、牛肝及不明成分液体样品共65 份，经检测其中62 份牛肉、牛肝样品检出苯甲酸钠，不明液体样品检出苯甲酸钠成分，同步检出21 份牛肉样品水分含量不合格[28]。灌注含苯甲酸钠盐的“注水牛肉”中苯甲酸钠残留量相对较高，通过监测苯甲酸钠含量更能有效打击违法注水行为。为降低动物应激反应、提高注水量，不法分子通常会在注水的同时给动物注射肾上腺素、异丙嗪、阿托品和沙丁胺醇等药物，还会注射卡拉胶和瓜尔胶等保水凝胶[29-30]。这些药物的作用主要是促进动物摄入水分并且将水分保持在动物体内。由于注水肉所用水质不卫生等问题，肉的腐败变质速率会加快，极易引发其他病原微生物污染，不法商贩在违法注水时添加苯甲酸钠等防腐剂，来降低畜肉注水后的腐败速率。宰前注水并不能使苯甲酸钠在动物体内充分代谢排出，导致大量苯甲酸钠残留在动物体内，严重危害消费者的身体健康。
通过大量实验数据，对市面上牛肉中苯甲酸含量进行研究，明确了牛肉中苯甲酸及其代谢物马尿酸的含量范围。在2 050 个牛肉样本中，94.93%的牛肉样本中苯甲酸含量小于10 mg/kg，其他104 个牛肉样本中苯甲酸含量均大于20 mg/kg，其中在屠宰场和批发市场获取的390 个牛肉样本中，94.87%的样本中苯甲酸含量小于5 mg/kg。苯甲酸代谢物马尿酸含量与苯甲酸含量相关性较差，打击非法添加行为时可重点关注畜肉中苯甲酸含量。虽然牛肉中天然存在微量苯甲酸，但其含量较低。正常饲喂含苯甲酸的饲料，苯甲酸大部分在动物体内代谢排出，较难达到高残留水平。违法“注水”导致的牛肉中苯甲酸残留含量相对较高，可能是牛肉中苯甲酸残留问题的重点风险来源之一。
我国牛肉中苯甲酸依然存在风险隐患，食品安全问题不容小觑，针对牛肉中苯甲酸高残留量的现象，建议：1）加大日常监管力度，严厉打击非法添加药物行为，加强对牛肉中苯甲酸的抽检力度，建立专项抽检任务，严厉打击违法“注水”行为，可通过检测苯甲酸含量，监测牛肉注水行为；2）加强对生产经营者的管理，制定严格的制度，加强对畜禽屠宰环节的监管，强化对养殖户的宣传教育和培训指导，普及相关法律法规和标准要求，提升养殖户的食品安全意识，促进科学、合理养殖；3）健全溯源体系，一旦发现问题能及时进行追溯；4）增强宣传力度，强化消费者从正规渠道购买农产品意识，向生产经营者宣贯食品安全法律法规，鼓励生产者、消费者和其他社会主体共同参与到食品安全监管体系中，提供有效举报平台，及时受理反馈；5）加强国家抽检数据的分析应用，充分利用监管数据，结合我国畜肉中苯甲酸监管现状，便于发现重点监管对象和场所，强化监管的针对性、靶向性和有效性。本研究阐明了牛肉中苯甲酸含量及可能风险来源，可为相关研究机构、科研项目、政府部门等提供更多资料，为市场监管提供基础数据和科学依据，从而有助于正确评估和减少我国食品安全风险，保障消费者身体健康。
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