图1 不同食盐添加量酸鱼发酵过程中水分含量（A）和氯化物含量（B）的变化
Fig. 1 Changes of water (A) and chloride content (B) in Suanyu with different levels of salt addition during fermentation
Effect of Salt Addition on Physicochemical Properties and Safety during Fermentation of Suanyu, a Traditional Chinese Fermented Fish Product
闫子康, 周杨凯鸣, 林颖, 等. 食盐添加量对酸鱼发酵过程中理化特性和安全性的影响[J]. 肉类研究, 2024, 38(3): 10-17.DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20240304-048. http://www.rlyj.net.cn
YAN Zikang, ZHOU Yangkaiming, LIN Ying, et al. Effect of salt addition on physicochemical properties and safety during fermentation of Suanyu, a traditional Chinese fermented fish product[J]. Meat Research, 2024, 38(3): 10-17. (in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20240304-048. http://www.rlyj.net.cn
酸鱼是我国苗族、侗族等少数民族采用长期厌氧发酵制成的一种传统发酵鱼制品，与其他发酵鱼制品相比，其鱼腥味较低，发酵风味浓郁，同时具有较长的贮藏期，不仅营养丰富，还具有一定的保健功能，在我国南方特别是少数民族聚集地广受欢迎。
食盐作为传统发酵食品中必不可少的调味剂，不仅可以起到提升咸度和增鲜作用，还可以降低产品的水分活度，抑制腐败微生物的生长繁殖[1]，从而提高产品的安全性和延长贮藏期。传统酸鱼的制作以家庭式生产为主，一次只做一坛，一年可以多次食用，为了达到长期保存的目的，通常在加工过程中加入大量食盐。大量研究表明长期食用高盐食物会增加肥胖症、心血管疾病、肾脏疾病等诸多慢性疾病的患病风险[2-3]。低盐饮食逐渐被大众所接受，公众饮食观念的改变势必对酸鱼传统加工产业的发展带来影响。
目前国内外针对动物性食品的减盐工艺已有较多研究，降低食盐用量可以提高微生物蛋白酶活性，从而加快产品发酵周期，解决传统发酵存在的弊端，但也有研究[4]表明，较低的食盐添加量会使蛋白过度水解，肉质发生软化，导致食用性变差。同时低盐发酵的肉制品中通常含有大量生物胺[5]，这也暴露了降低食盐用量所带来的风险。因此控制食盐添加量的同时生产出高品质的产品是发酵肉制品领域发展的新趋势，张东等[6]分析不同食盐用量对腊肉的品质得出，食盐添加量4%的腊肉游离氨基酸含量最高，感官品质最好。陈佳新等[7]研究不同食盐添加量的哈尔滨风干肠发现，2%食盐添加量既保证了产品的质量和感官接受度，还有效降低了食盐含量。
目前关于酸鱼的研究主要集中在对其发酵过程中特征性风味形成的探索以及对酸鱼中优势微生物的挖掘，但关于食盐添加量对酸鱼发酵过程中的品质形成规律还没有进行系统、深入的研究。食盐能够直接影响肉制品的微生物群落结构和多样性[8]，进而影响最终的风味和食用性。虽然国内外就食盐添加量对发酵肉制品的品质影响已有较多研究，但与传统酸鱼相比发酵周期普遍较短，其研究结论并不具有普适性，难以应用于指导传统酸鱼的生产。传统发酵酸鱼由于其较长的发酵周期，易受加工条件和发酵环境中微生物等多种因素的影响，从而导致产品质量极不稳定，因此探究食盐添加量对传统酸鱼产品品质的影响极为重要。
本研究分析不同食盐添加量对酸鱼发酵过程中的理化特征及安全性的影响，揭示不同食盐添加量的酸鱼在发酵过程中的品质变化规律，为酸鱼的工业化生产提供理论依据。
鲜活鲤鱼（体质量约500 g） 当地生鲜市场。
食盐、白砂糖、甜酒、玉米粉 湖南农业大学东之源超市；氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠、硝酸银、盐酸、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、碳酸氢钠、丹磺酰氯、酚酞、乙醇、铬酸钾、氢氧化铵（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；乙腈、甲醇、磷酸二氢钾（均为色谱级） 美国天地试剂公司；生物胺（色胺、苯乙胺、组胺、腐胺、尸胺、酪胺、精胺、亚精胺）标准品、有机酸（草酸、酒石酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸）标准品 广州佳途科技股份有限公司。
YP B5002电子天平 上海光正医疗仪器设备有限公司；TVT-6700食品物性测试仪 英国Stable Micro Systems公司；NR200高品质电脑色差仪 深圳市三恩时科技有限公司；TG16MW高速冷冻离心机 湖南赫西仪器装备有限公司；PHS-3E pH仪 上海仪电科学仪器股份有限公司；DZKW-S-8电热恒温水浴锅 北京光明医疗器械有限公司；SpectraMax ABS Plus酶标仪 上海美谷分子仪器有限公司；1260高效液相色谱仪 美国安捷伦公司。
1.3.1 样品制备
酸鱼的制备按照Zeng Xuefeng等[9]的方法并稍作修改，将洗净处理好的鲤鱼切块，按照质量分数3%、6%、9%添加食盐，分别命名为K3、K6、K9组，分别加入白砂糖（质量分数1%）和甜酒（质量分数2%）搅拌均匀，放置在4 ℃冰箱中腌制24 h；腌制好的鱼块放至室温后与炒熟的玉米粉按质量比4∶1充分混匀；将混合物置于发酵坛中，在容器底部先铺上一层玉米粉，按一层鱼一层玉米粉放置，最后顶部铺上一层玉米粉后压紧、加盖、水封；发酵过程在恒温室中进行，以确保温度恒定在20 ℃。分别对原料鱼及发酵0（腌制后）、15、30、45、60、90 d的样品进行取样，样品真空包装后于-80 ℃冰箱保存。
1.3.2 水分含量的测定
参照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》的直接干燥法测定。
1.3.3 氯化物含量的测定
参照GB 5009.44—2016《食品中的氯化物的测定》的银量法测定。
1.3.4 pH值的测定
参照赵跃等[10]的方法测定。将5 g鱼肉与50 mL超纯水混合，10 000×g离心10 min，使用pH计测定上清液的pH值。
1.3.5 总酸含量的测定
参照邹大维等[11]的方法测定酸鱼的总酸含量，结果以乳酸计。
1.3.6 总挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量的测定
参照Sun Yingying等[12]的方法测定，称取2 g样品，加入18 mL超纯水，8 000 r/min均质2 min后离心（10 000×g、10 min），取上清液采用半微量定氮法测定。
1.3.7 硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）值的测定
参照黄金枝等[13]的方法测定。
1.3.8 质构和色差的测定
将鱼背侧肌肉切成2.0 cm×2.0 cm×1.0 cm大小。参照周迎芹等[14]的方法，通过食品物性分析仪测定样品的硬度、弹性和咀嚼性。测试条件：P/36圆柱形测试探头；测前速率2 mm/s，测试速率1 mm/s，测后速率2 mm/s；压缩形变50%；触发力5 g。使用色差仪测定样品色差。
1.3.9 有机酸含量的测定
前处理参照常荣[15]的方法，称取2 g样品加入20 mL超纯水，8 000 r/min均质2 min，超声萃取5 min，10 000×g离心20 min，随后将上清液定容至25 mL，吸取1 mL样品溶液过0.22 μm水系滤膜，注入高效液相色谱仪，采用外标法计算各有机酸的含量。
1.3.10 生物胺含量的测定
参照Xu Yanshun等[16]的方法进行。
所有实验均重复3 次，结果表示为平均值±标准差，使用SPSS 26.0软件（IBM公司）对数据进行统计和方差分析（P＜0.05），使用Origin 2023软件（OriginLab公司）作图。
如图1A所示，各组样品的水分含量在发酵过程中持续下降且差异明显。发酵前期（0～15 d）降幅较大，K3～K9组由最初的75.43%分别降低至67.49%、61.39%和60.65%。这是由于食盐的解离作用增大了鱼肉细胞内外的渗透压，使鱼肉中的游离水逐渐减少，干燥的玉米粉也吸附了鱼肉中部分水分，导致水分含量在发酵初期急剧减少，在同一时期的各组样品中，食盐添加量越高，水分含量越低，这与Tian Xing等[17]的研究结果一致。食盐添加量的增加造成钠离子的迁移速率增大，促使鱼肉更快脱水，而在发酵中后期由于发酵罐中密闭的环境，水分难以蒸发，因此各组酸鱼的水分含量变化较为平缓。如图1B所示，食盐添加量能显著影响酸鱼中的氯化物含量，食盐添加量越高，其氯化物含量越大。由于发酵所添加的玉米粉辅料中并不含食盐，发酵底物总体质量增加，玉米粉辅料也可以在发酵过程中通过等压渗透作用吸收部分食盐，导致K3、K6、K9组最终的氯化物含量低于其食盐添加量，分别达到2.62%、4.77%和6.09%。顾赛麒等[18]采用不同的食盐添加量对草鱼腌制5 d，其氯化物含量的变化趋势与本研究一致。
图1 不同食盐添加量酸鱼发酵过程中水分含量（A）和氯化物含量（B）的变化
Fig. 1 Changes of water (A) and chloride content (B) in Suanyu with different levels of salt addition during fermentation
如图2A所示，各组酸鱼的pH值从新鲜样品的6.70下降至发酵终点的4.20～4.53，发酵前期各组样品pH值的下降速率与食盐添加量成反比，K3和K6组酸鱼的pH值在发酵15 d迅速下降至4.76和5.00，而食盐添加量最高的K9组pH值仅下降至5.77，传统发酵酸鱼中存在大量乳酸菌[19]，以上各组pH值的变化差异可能是由于食盐添加量的增加抑制了乳酸菌的增长速率及产酸能力[20]，图2B中各组样品中总酸含量的变化趋势也印证了这一现象，在发酵90 d后，K3组酸鱼的总酸质量分数为3.54%，分别为K6组和K9组的1.18、1.45 倍，表明加盐量越低的酸鱼产酸量越大。
图2 不同食盐添加量酸鱼发酵过程中pH值（A）和总酸含量（B）的变化
Fig. 2 Changes of pH (A) and total acid content (B) of Suanyu with different levels of salt addition during fermentation
TVB-N含量反映蛋白质分解产生氨和碱性含氮物质的程度，也作为衡量肉制品新鲜度的指标[21]。如图3A所示，新鲜样品中TVB-N含量为5.46 mg/100 g，在发酵后，酸鱼的TVB-N含量随发酵时间延长逐渐增加。发酵15 d以前，各组的TVB-N含量差异不明显，在此之后，K9组和K6组均明显低于K3组，这表明增加食盐添加量会抑制蛋白质的水解，进而延缓鱼肉的腐败。付浩华等[22]比较1%、2%、4%和6%食盐用量的腊肉在贮藏过程中的品质变化，结果表明，6%食盐添加量的腊肉TVB-N含量显著低于其他3 组，这与本研究的结果一致。TVB-N含量与内源酶和腐败菌的活性有关[23]，本研究中高食盐添加量组显著延缓了酸鱼发酵过程中TVB-N含量的增长幅度，这种影响可能是食盐可以抑制酸鱼中腐败微生物的生长所导致的。
图3 不同食盐添加量酸鱼发酵过程中TVB-N含量（A）和TBARS值（B）的变化
Fig. 3 Changes of TVB-N content (A) and TBARS value (B) during the fermentation of Suanyu with different levels of salt addition
TBARS值是用来衡量肉制品中脂质氧化的重要指标。肉制品中的最大TBARS值不超过5 mg/kg[24]，如图3B所示，新鲜样品的TBARS值最低，仅为0.39 mg/kg，在发酵后逐渐增大，不同食盐添加量酸鱼的TBARS值在腌制后已有明显差异，在发酵90 d后，K3～K9组的TBARS值均达到最大值，分别为1.75、2.84、4.58 mg/kg，表明酸鱼的TBARS值随着食盐添加量的增加而增大。瞿丞等[25]分析不同食盐添加量的腌制鸡胸肉也得到了类似的结果。虽然适度的脂质氧化有助于形成肉制品的特征性风味，但过度氧化可能导致不良风味的产生。因此，在酸鱼的发酵过程中，控制食盐添加量以调控脂质氧化程度对于获得理想的风味至关重要。
如图4所示，新鲜样品的硬度、弹性和咀嚼性均最低，分别为4 716.2 g、0.35 mm和717.22 g。发酵0～45 d是酸鱼硬度和咀嚼性的剧烈上升阶段，酸鱼因不断失水和酸化导致的蛋白质变性使其质地变得坚硬，因此酸鱼的硬度与咀嚼性在发酵后明显增加，并且食盐添加量越高，酸鱼的硬度和咀嚼性就越大，这与张秋会等[26]的研究结果一致。硬度和咀嚼性的增加对酸鱼的整体感官评价也会产生一定的影响。适度的硬度和咀嚼性可以增加适口性，但过高的硬度可能导致产品口感过于粗糙，影响产品的接受度。各组样品的弹性在发酵过程中一直处于动态变化中，均为0.42～0.57，但弹性的变化与食盐添加量无明显相关性，黄梅香等[27]也发现降低食盐添加量对火腿肠的弹性影响不大，这与本研究结果一致，但极低的食盐添加量（0.5%）会显著降低火腿肠的弹性。
图4 不同食盐添加量酸鱼发酵过程中质构的变化
Fig. 4 Changes in texture of Suanyu with different levels of salt addition during fermentation
如表1所示，在整个发酵阶段，酸鱼的色泽从亮白色向金黄色逐渐过渡。新鲜鱼肉的亮度值（L*）为61.51，在发酵后缓慢降低，在同一发酵时期食盐添加量越低，L*相对越高（P＜0.05），Yang Wenxian等[28]比较不同浓度的盐卤对草鱼腌制过程的影响，发现低盐草鱼具有更高的L*，这与本研究结果一致。K3～K6组样品在腌制后红绿度值（a*）由原料的2.45分别上升至2.59、2.59和2.57，这可能是由于腌制期间的温度较低，皮下血管收缩，血液被挤压成型，导致鱼肉呈现浅红色，而血红色素在发酵初期因氧化消失导致a*快速降低，但各组的a*变化较小，均在0.27～0.46，且无显著性差异。黄蓝度值（b*）主要与鱼肉发酵过程中的脂肪氧化有关，酸鱼的b*自发酵开始逐渐上升，发酵后期上升较为剧烈，发酵90 d后，K3～K9组由最初的2.35分别上升至10.11、11.97和17.73，推测由于发酵前期样品堆积紧密，坛内空隙狭小，b*上升较为缓慢，而在发酵过程中不断取样后造成物料减少，导致剩余的样品与坛内空气接触面增大，因此发酵后期氧化程度加剧，导致b*急速上升。韦诚[29]对酸肉发酵过程中的色泽进行分析发现，发酵0～80 d期间酸肉的b*变化不大，为8.95～10.84，而发酵后期急剧上升，180 d后达到19.67，肉质严重发黄，这与本研究的变化趋势相似。在同一时期各组酸鱼的b*差异显著（P＜0.05），食盐添加量越高，b*越大，这与图3中TBARS值的变化呈现极显著正相关（r＝0.907，P＜0.01）。
表1 不同食盐添加量酸鱼发酵过程中色泽的变化
Table 1 Color change of Suanyu with different levels of salt addition during fermentation
注：同列小写字母不同表示同一发酵时期、不同食盐添加量的样品间差异显著（P＜0.05）。
发酵时间/d组别L*a*b*新鲜61.51±0.232.45±0.112.35±0.01 0 K360.61±0.30a2.59±0.05a2.72±0.12a K659.75±0.66b2.59±0.09a2.66±0.10a K959.78±0.11b2.57±0.13a2.75±0.04a 15 K359.56±0.34a0.43±0.03a3.18±0.07a K658.32±0.31b0.46±0.01a3.48±0.07b K958.24±0.81b0.31±0.06b4.14±0.03c 30 K360.30±0.78a0.28±0.02a3.61±0.02a K659.40±0.20b0.34±0.04a4.15±0.04b K956.68±0.60c0.27±0.01a7.12±0.04c 45 K360.32±0.60a0.31±0.02a6.67±0.04a K658.41±0.24b0.31±0.03a8.15±0.03b K955.55±0.16c0.33±0.01a10.10±0.01c 60 K359.24±0.63a0.35±0.01a8.52±0.02a K658.15±1.00b0.28±0.01a10.16±0.06b K955.14±0.29c0.27±0.04a13.35±0.16c K357.33±0.36a0.27±0.02a10.11±0.03a K655.84±0.65b0.27±0.03a11.97±0.10b K953.91±0.58c0.29±0.01a17.73±0.02c 90
有机酸为酸鱼中特征性酸味的主要来源，其中多种有机酸的共同作用赋予酸鱼产品酸鲜的风味特点。如图5所示，新鲜样品中检测到5 种有机酸，其中含量最高的是酒石酸，含量为13.69 mg/g，草酸、乳酸、柠檬酸和琥珀酸的含量较少，分别为3.89、0.60、0.42、3.36 mg/g。随着发酵时间的延长，3 组样品的各有机酸含量均有不同程度的增加，并且有机酸的种类增多，乳酸和琥珀酸的含量在新鲜样品和腌制期间仅少量存在，为0.60～2.21、1.68～3.36 mg/g，在发酵15 d后显著增加，K3～K9组分别达到22.82、14.57、9.09 mg/g和35.98、35.00、35.49 mg/g，成为酸鱼中主要的呈味有机酸，这与常荣[15]的研究结果一致。Riebroy等[30]提出，发酵肉制品中含有2%～3%的乳酸将赋予产品较好的风味。琥珀酸作为有机酸中的鲜味成分，可以通过与鲜味氨基酸的协同作用起到增强鲜味的作用，乳酸和琥珀酸极大赋予了酸鱼鲜酸的口感。在同一发酵时期K3组的乳酸和乙酸含量最高，这与其较低的pH值和较高的总酸含量一致。各组样品中草酸和柠檬酸的含量在腌制后略微降低，苹果酸在发酵后被检出，发酵过程中均呈现上下波动的趋势，但含量均相对较少。
图5 不同食盐添加量酸鱼发酵过程中有机酸含量的变化
Fig. 5 Changes of organic acid content in Suanyu with different levels of salt added during fermentation
生物胺是一类广泛存在于鱼类、泡菜、腊肠、酒类等发酵食品中的含氨基的小分子有机化合物[31]。如图6所示，新鲜鱼肉中仅检出3 种生物胺，各生物胺含量为4.62～11.93 mg/kg，总生物胺含量为25.11 mg/kg，发酵15 d后，各发酵组均检测到6 种生物胺。除精胺和亚精胺外，其他生物胺含量和生物胺总量随发酵时间的延长均有明显的累积。
图6 不同食盐添加量酸鱼发酵过程中生物胺含量的变化
Fig. 6 Changes of biogenic amine content during the fermentation of Suanyu with different levels of salt addition
腐胺和尸胺是衡量水产品腐败程度的指标。一些有害微生物如假单胞菌属、芽孢杆菌属都是腐胺和尸胺的主要产生者。当这2 种生物胺的含量超过一定阈值时，也会赋予鱼肉不愉快的气味，并影响鱼肉的食用安全性。由图6A、B可知，各组的腐胺和尸胺含量均呈现递增而后逐渐平缓的趋势，腐胺在初期迅速增加，K3～K9组在发酵45 d分别达到69.28、32.32、41.79 mg/kg，然后不断波动，而尸胺含量在发酵初期上升缓慢，在发酵30～45 d明显增加，K3～K9组由12.43、3.98、8.50 mg/kg快速上升至43.11、32.19、16.79 mg/kg。Zhang Yuemei等[32]比较不同食盐和糖浓度的鲤鱼贮藏过程中的品质变化，也发现了类似的现象。在同一发酵时期，K3组的腐胺和尸胺含量明显高于K6和K9组，这可能与其具有较高的微生物和蛋白酶活性有关。
组胺和酪胺是发酵肉制品中最常见也是毒性最强的2 种生物胺，过量摄入组胺会导致头晕、食物中毒等症状，严重者甚至会死亡，而食用高浓度酪胺的食物也会引起头痛、血压升高等不良反应[33]。如图6C、D所示，各组样品的组胺和酪胺含量在发酵后明显升高，K3组的组胺和酪胺含量最高，最高含量分别可达57.27、148.51 mg/kg，分别为同一时期K6组和K9组的1.42、1.20 倍和1.43、1.72 倍。
如图6E、F所示，各发酵组亚精胺和精胺的含量随着发酵时间延长并未出现规律性的变化，这可能是精胺和亚精胺这2 种生物胺易被分解所致，这与才让卓玛等[34]的研究结果一致。
如图6G所示，各组的总生物胺含量在发酵前期急剧增加，K3～K9组在45 d达到336.83、223.52、253.65 mg/kg，分别是原料的13.41、8.90、10.10 倍，而后趋于平缓。这可能是因为发酵初期鱼体蛋白质含量丰富，加工过程中鱼体本身的一些腐败微生物生长繁殖，产生大量生物胺，而发酵中后期pH值降低使一些产胺的微生物不能适应酸性厌氧的发酵环境逐渐被抑制。在同一发酵时期，K3组的总生物胺含量明显高于K6和K9组。尽管K6组在发酵15 d时的总生物胺含量略高于K9组，但在之后的发酵过程中，其含量均低于K9组。发酵食品中生物胺的积累主要是由于具有氨基酸脱羧酶活性的微生物作用[35]，Chun等[36]比较不同盐添加量对韩国传统豆酱的影响，发现低盐组（9%）的生物胺含量远高于高盐组（18%），这可能与微生物尤其是乳酸菌的生长密切相关。解双瑜等[37]通过对东北农家酱进行减盐处理后发现，减少20%以下的食盐用量对总生物胺含量的影响不大，当减少30%以上后，产品的总生物胺含量显著增加。这表明增加食盐添加量可以通过抑制氨基脱羧酶活性减少生物胺的生成，同时生物胺的产生也受到发酵体系中复杂的微生物菌群构成及不同菌株产胺特性的影响。此外也有研究[38-39]表明，通过在发酵肉制品中添加辣椒、生姜、八角、肉桂等可以有效抑制发酵体系中微生物的生长，从而减少生物胺的产生。在传统酸鱼的制作工艺中，如辣椒、桂皮、香叶等香辛料是根据自家口味按照比例添加，但为了避免这些外源因素的干扰，本研究简化了酸鱼的配方，这可能是本研究中样品生物胺含量较高于其他研究中酸鱼的原因。
研究食盐添加量对酸鱼品质形成的影响。结果表明：增加食盐添加量会加速水分流失和脂肪氧化，提高硬度和咀嚼性，导致色泽产生剧烈变化；减少食盐添加量则能降低pH值，提高总酸含量，但会加速蛋白水解形成TVB-N，从而加速腐败；发酵过程中，降低食盐添加量会提高酸鱼的乳酸和乙酸含量，但长期发酵可能导致酸鱼口感偏酸，影响产品的风味及口感；较低食盐添加量（3%）的酸鱼会在发酵过程中产生更多的生物胺，6%食盐添加量对酸鱼产生物胺的抑制效果最好；发酵0～45 d是酸鱼质构特性形成和生物胺快速产生的关键时期。合理控制食盐添加量和发酵时间，是优化酸鱼品质和提高食用安全性的关键。
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