肉制品中的脂肪是人体生长发育所需的营养来源之一，但摄入过多的脂肪可能会导致高血压、肥胖、心脑血管疾病的发生[1]，世界卫生组织建议将脂肪摄入量控制在每日总能量的15%～30%[2]，因此低脂肉制品的研究备受关注。现在越来越多的脂肪替代物用于肉制品中以替代部分脂肪，包括碳水化合物基脂肪替代物（菊粉等）、脂质基脂肪替代物（菜籽油、椰子油等）、蛋白质基脂肪替代物（明胶（gelatin，GN）、大豆蛋白等）和复合型脂肪替代物（魔芋胶-橄榄油等）[3]。Niu Yuge等[4]用双交联的黑豆皮可溶性膳食纤维-GN复合凝胶替代肉丸中的脂肪，制备低脂肉丸，发现复合凝胶能够改善肉丸的质地。
多糖和蛋白质是食品凝胶体系中最常用的组成成分，往往被同时使用[5]。研究表明，多糖和蛋白质可以通过共价键、氢键、范德华力等相互作用形成稳定复合物[6]，这种复合物结构致密、均匀、稳定[7]。蛋白质中常使用GN、胶原蛋白、大豆蛋白等。GN是从动物皮肤和骨骼中提取的动物蛋白，属于水胶体蛋白质[8]。GN安全无毒，具有许多优良的性质，并且可以自组装形成凝胶[9]，研究表明，以GN为原料制备的凝胶存在一定缺陷，其结构稳定性和热稳定性较差[10]。多糖包括结冷胶（gellan gum，GG）、纤维素及其衍生物、黄原胶、果胶等。GG是由植物假单胞菌发酵产生的微生物胞外阴离子多糖[11]，由1,3-β-D-葡萄糖、1,4-β-D-葡萄糖醛酸、1,4-β-D-葡萄糖、1,4-α-L-鼠李糖4 种多糖组成[12]，在较低浓度下具有较好的胶凝性能[13]。许多研究以蛋白质和多糖为基质制备复合凝胶。张慧敏等[14]以大豆分离蛋白和高脂柑橘果胶为原料制备复合凝胶，发现当大豆分离蛋白与高脂柑橘果胶比例为1∶1时，体系稳定性最好。潘泓杉等[15]以金针菇多糖和大豆分离蛋白为原料制备金针菇多糖-大豆分离蛋白凝胶，发现添加5%金针菇多糖时，凝胶具有良好的稳定性。
金针菇在加工时往往会将根部丢弃，而金针菇根部含有大量膳食纤维。膳食纤维具有多种特殊功能和生理作用，因而被誉为“第七大营养素”[16]。如果将膳食纤维经物理、化学处理，通过破坏纤维素的无定形区，则可得到直径小于100 nm、长度为几十至几百纳米的纳米纤维素（cellulose nanofibril，CNF）[17]。CNF具有较多优点，如大长径比、强亲水性、易形成纤维网络结构等[18]，能够通过无机酸水解法、有机酸水解法、离子液体法和低共熔溶剂法等制备而成[19]。2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基（2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxoradical，TEMPO）氧化法是一种化学处理方法，能够将纤维的C6羟基氧化成C6羧基，并且反应效率高、条件温和[20]。高羧基含量的纤维素在水溶液或有机溶剂中易分散[21]。CNF表面具有较多的羟基和羧基，能够形成较强的氢键，而氢键决定了纤维素的多种特性，能够提高聚合物的热稳定性、柔韧性和力学强度等[22]。郑勰等[23]以N-异丙基丙烯酰胺和N-羟甲基丙烯酰胺为原料制备CNF，通过冷冻干燥和热处理制备CNF水凝胶，这种水凝胶具有多级多孔结构，并且在水中具有良好的稳定性、压缩回弹性和温度响应性。
研究表明，在凝胶制备中，GG与蛋白质具有良好的协同效应[24]，但仍存在一定缺陷。本研究以GN、GG为原料，制备GN-GG复合凝胶，通过测定GN-GG复合凝胶的持水性（water holding capacity，WHC）和溶胀性，确定GN、GG的最适添加量；为进一步提高凝胶强度，在此基础上加入CNF，通过测定CNF-GN-GG复合凝胶的WHC、溶胀性、质构特性、流变特性确定CNF的最适添加量；通过ζ电位、傅里叶变换红外（Fourier transform infrared，FTIR）光谱和扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）分析添加CNF对复合凝胶结构的影响，为金针菇CNF复合凝胶的高质量制备提供技术参数及理论依据，有望将其作为脂肪替代品应用于低脂类肉制品。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
金针菇（产自太谷，采后48 h） 太谷家家利超市。
GG 上海源叶生物科技有限公司；GN（从牛皮中提取）、α-淀粉酶（酶活力3 000～5 000 U/g）、碱性蛋白酶（酶活力≥200 000 U/g） 北京索莱宝科技有限公司；TEMPO（纯度98%）、次氯酸钠溶液 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氢氧化钠（分析纯）、无水乙醇 天津致远化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；5801R冷冻离心机 德国Eppendorf公司；SMATA TA.XT Plus质构仪 英国Stable Micro Systems有限公司；Zetasizer Nano ZS90电位仪 英国Malvern公司。
1.3 方法
1.3.1 不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）和CNF的制备
参考高小娜[25]的方法提取金针菇中的IDF。将干燥的金针菇粉和蒸馏水以料液比1∶20混合，调节pH值为6.0后加入0.3% α-淀粉酶，70 ℃酶解35 min，冷却至室温，调节pH值为9.6后加入0.6%碱性蛋白酶，50 ℃酶解90 min，超声20 min，100 ℃灭酶10 min。5 000 r/min离心10 min，结束后弃去上清液，沉淀用体积分数95%乙醇洗涤后冷冻干燥，得IDF。
将5 g IDF分散于500 mL超纯水中进行水合作用24 h，将0.08 g TEMPO、0.5 g NaBr与用0.1 mol/L HCl溶液调节pH值为10的0.89 mL NaClO加入IDF悬浮液中，搅拌均匀后室温下反应，反应过程中需维持体系pH值为10，5 h后加入10 mL无水乙醇终止反应，并将pH值调节为中性。5 000 r/min离心10 min后取下层沉淀，用超纯水洗涤以除去体系中多余的盐，冷冻干燥后，即得CNF。
1.3.2 复合凝胶的制备
参考夏琪[26]、赵若冰[27]等的方法进行改进。根据实验设计称取不同质量的GN溶解于蒸馏水中，于55 ℃磁力搅拌15 min使之完全溶解；然后加入不同质量GG，在95 ℃水浴中磁力搅拌15 min，将制得的复合溶液在4 ℃贮藏过夜得到复合凝胶。
1.3.3 实验设计
1.3.3.1 GN添加量的确定
称取3、4、5、6 g GN分别溶解于适量蒸馏水中，使其添加量为3%、4%、5%、6%（m/m），将GG添加量固定为0.3%，根据1.3.2节制备复合凝胶，测定WHC、溶胀度等指标，确定GN的最适添加量。
1.3.3.2 GG添加量的确定
将GN添加量固定为5%，称取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g GG分别溶解于适量GN溶液中，使其添加量分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%（m/m），根据1.3.2节制备复合凝胶，测定WHC、溶胀度等指标，确定GG的最适添加量。
1.3.3.3 CNF添加量的确定
分别称取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g金针菇CNF分散于适量蒸馏水中，使其添加量为0.0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%（m/m），然后加入优化比例的GN和GG，按照1.3.2节制备复合凝胶，测定WHC、溶胀度、质构特性等指标，确定CNF的最适添加量。
1.3.4 指标测定
1.3.4.1 溶胀度
精密称取0.5 g整块复合凝胶，放入蒸馏水中，使其在室温下吸水溶胀24 h，吸去表面水分，称质量。复合凝胶的溶胀度按式（1）计算：
式中：m1为复合凝胶初始质量/g；m2为复合凝胶溶胀后质量/g。
1.3.4.2 WHC
将复合凝胶装入1.5 mL空离心管中，用冷冻离心机4 000 r/min离心20 min。然后将水分除去，并记录剩余复合凝胶的质量。WHC按式（2）计算：
式中：m0为离心管质量/g；m1为离心前复合凝胶和离心管总质量/g；m2为离心后复合凝胶和离心管总质量/g。
1.3.4.3 质构特性
参考江连洲等[28]的方法并作修改。将制备好的复合凝胶置于质构仪上进行全质构测试，测试条件：探头P/0.5，测定速率60 mm/min，测后速率200 mm/min，触发力0.3 N，测定距离为复合凝胶高度的1/2。
1.3.4.4 流变特性
参考刘凤华等[29]的方法。振荡剪切-温度扫描测定：应变1%，频率1 Hz，测定复合凝胶在25～80 ℃下储能模量（G′）和损耗模量（G″）的变化情况。
1.3.4.5 ζ电位
参考蔺家成等[30]的方法，将样品溶液进行100 倍稀释，使用Zeta电位仪测定。
1.3.4.6 FTIR光谱
参考徐璐等[31]的方法，将样品与溴化钾以1∶100的质量比混合，于研钵中研磨成粉末后进行压片，于FTIR仪中，在400～4 000 cm-1范围内以4 cm-1的分辨率进行检测。
1.3.4.7 SEM观察
参考张勉羚等[32]的方法，将复合凝胶切成厚度约3 mm的薄片，进行冷冻干燥处理，将冻干后的样品固定在样品台上，经喷金处理后置于SEM载物台上，在加速电压5 kV、放大倍数100 倍的条件下观察复合凝胶微观结构。
1.4 数据处理
实验均重复3 次，结果表示为平均值±标准差。通过Microsoft Excel 2013软件处理数据，差异显著性用Statistix 8.1软件进行分析，显著水平为P＜0.05，采用Origin 2021软件绘图。
2 结果与分析
2.1 GN添加量对复合凝胶WHC和溶胀度的影响
由图1A可知，随着GN添加量的增加，复合凝胶的WHC显著升高（P＜0.05）。当GN添加量为3%时，复合凝胶的WHC为69.97%；当添加量增加到4%时，WHC增加至73.92%，而当GN添加量达到5%～6%时，WHC显著增加至80.96%～81.42%（P＜0.05），由于GN具有较好的亲水性，使凝胶网络能够维持较多的水分[33]。郭元博等[34]将GN添加到奶冻中发现GN能够降低奶冻的析水率，当GN添加量为1.8%时，奶冻具有较好的WHC。
图1 GN添加量对复合凝胶WHC（A）和溶胀度（B）的影响
Fig. 1 Effect of GN addition on WHC (A) and SD (B) of composite gel
小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。
由图1B可知，随着GN添加量增加，复合凝胶的溶胀度也随之增大。GN添加量为3%和4%时，复合凝胶溶胀度分别为35.19、35.71 g/g，添加量为5%时，溶胀度显著增加至44.43 g/g，并且与添加量6%时无显著差异（P＞0.05）。Liu Ruixuan等[35]研究发现，GN能够提高细菌纤维素-GN-肝素水凝胶的溶胀能力。通过WHC和溶胀度测定可知，GN添加量为5%～6%时，对复合凝胶的持水能力有较强的增加作用。
2.2 GG添加量对复合凝胶WHC和溶胀度的影响
由图2A可知，复合凝胶的WHC随着GG添加量的增加而增大。当GG添加量从0.1%增加至0.4%时，凝胶的WHC由76.77%显著升高至86.06%（P＜0.05）；当GG添加量为0.5%时，WHC达到最大值（86.21%）。这表明GG可以提高复合凝胶的WHC，原因是GG能够通过氢键结合较多水分，这些水分被束缚在GG-GN复合凝胶的网络结构中，提高了凝胶的持水能力[36]。Du Yinan等[13]研究也发现，GG能够提高姜黄素负载的大黄鱼卵分离蛋白二元凝胶的持水能力。
图2 GG添加量对复合凝胶WHC（A）和溶胀度（B）的影响
Fig. 2 Effect of GG addition on WHC (A) and SD (B) of composite gel
由图2B可知，随着GG添加量的增加，复合凝胶的溶胀度随之增大。当GG添加量为0.1%时，溶胀度为33.40 g/g。当GG添加量为0.4%时，溶胀度增加至1.7 倍，且与添加量0.5%组（58.47 g/g）无显著差异（P＞0.05）。这可能是因为凝胶的交联度增大，致使继续增加GG含量，溶胀度的增速明显趋于缓慢[37]。王飞[38]研究发现，GG可以增加水凝胶的溶胀速率常数和溶胀平衡常数，从而使复合凝胶具有较好的溶胀能力。通过WHC和溶胀度测定可知，0.4%～0.5% GG对复合凝胶的持水能力有较强的增加作用。
综上所述，当GN添加量为5%～6%、GG添加量为0.4%～0.5%时，复合凝胶具有良好的WHC和溶胀能力，考虑到节省资源，故将GN添加量为5%、GG添加量为0.4%用于制备复合胶体，并进行下一步CNF添加量的确定。
2.3 CNF添加量对复合凝胶性质的影响
2.3.1 CNF添加量对复合凝胶WHC和溶胀度的影响
由图3A可知，随着CNF添加量的增加，复合凝胶的WHC也随之增大，且添加CNF的复合凝胶WHC显著高于未添加CNF的对照组（P＜0.05）。当CNF添加量从0.2%升至0.6%时，复合凝胶的WHC从83.92%显著增加至85.05%（P＜0.05），当CNF添加量为1.0%时，复合凝胶的WHC（85.56%）最高。这可能是由于添加CNF后，凝胶内部的孔隙减小，凝胶的网络结构趋于致密[39]，使凝胶能够保留较多水分。WHC是食品的重要特性之一，复合凝胶的WHC高则可将其用于肉制品生产中，能够减少产品脱水，保持食品的多汁性[40]。
图3 CNF添加量对复合凝胶WHC（A）和溶胀度（B）的影响
Fig. 3 Effect of CNF addition on WHC (A) and SD (B) of composite gel
由图3B可知，复合凝胶的溶胀度随CNF添加量的增加而增大，高于0.0% CNF组（14.76 g/g）。当添加量从0.2%增至0.6%时，溶胀度从16.28 g/g显著增加至最高值19.45 g/g，而再增加CNF添加量，溶胀度则略有下降。李泓等[41]研究发现，添加适量的羟基磷灰石CNF会增大水凝胶的溶胀度，而过量的CNF会导致凝胶交联度增加并降低凝胶的溶胀能力。
2.3.2 CNF添加量对复合凝胶流变特性的影响
由图4可知，随着温度的升高，复合凝胶的G′和G′′逐渐降低，这可能是因为随着温度的上升，胶体体系中的分子运动加剧，使体系内部结构的相互联结被打乱，弹性发生变化[42]。但所有样品的G′始终大于G″，这表明样品具有明显固体样凝胶的弹性流变特性。添加CNF复合凝胶的G′和G″均高于0.0% CNF组。不同实验组的G′和G″有相同的排序，均为0.6%＞0.8%＞1.0%＞0.4%＞0.2%＞0.0%。这可能是因为适量添加CNF会增强复合凝胶的内部网络结构，而过量加入CNF可能会发生纤维丝缠绕、分布不均匀等情况，使凝胶的内部网络结构不均匀，从而导致G′和G″的下降[22]。Zhang Zhen等[43]研究也发现，适量添加纤维素可以提高纤维素凝胶的G′和G″。
图4 CNF添加量对复合凝胶流变特性的影响
Fig. 4 Effect of CNF addition on the rheological properties of composite gel
2.3.3 CNF添加量对复合凝胶质构的影响
由图5可知，复合凝胶的硬度随着CNF添加量的增加而显著增大（P＜0.05）。当添加量为1.0%时，复合凝胶的硬度增加至添加量0.0%组的1.5 倍。这可能是因为CNF与GN-GG复合凝胶之间形成了较多的氢键和二硫键，使CNF-GN-GG凝胶变得更为坚韧，提高了复合凝胶的硬度[44]。添加CNF并未使复合凝胶的弹性发生显著变化，但显著提高复合凝胶的胶黏性（P＜0.05），与添加量0.0%组（3.44 N）相比，添加CNF组的胶黏性（3.77～4.65 N）是其1.10～1.35 倍。随着CNF添加量的增加，复合凝胶的咀嚼性逐渐增大，当CNF添加量为1.0%时，咀嚼性达到最大值（40.42 mJ）。
图5 CNF添加量对复合凝胶质构的影响
Fig. 5 Effect of CNF addition on the texture of composite gel
综上所述，通过WHC、溶胀度、质构和流变学性质的测定，发现添加0.6% CNF能够显著提高复合凝胶的性能。为进一步探究其机理，以不添加CNF为对照，以添加0.6% CNF为实验组，分析CNF对复合凝胶ζ电位、FTIR光谱及微观结构的影响。
2.4 CNF对复合凝胶结构的影响
2.4.1 CNF对复合凝胶ζ电位的影响
ζ电位反映了微粒分散体系的稳定性，代表粒子间的静电相互作用，ζ电位绝对值越高，体系稳定性越好[32]。研究表明，粒子之间能够通过絮凝或混凝作用产生强大的外部斥力，阻止颗粒间的聚集，提高体系的物理稳定性[45]。对照组与实验组ζ电位值均为负值，这说明体系内颗粒表面带有负电荷。由图6可知，与对照组相比，实验组的ζ电位绝对值增加至20.5 mV。这可能是由于TEMPO氧化法制备的CNF表面具有较多的羧基，阴离子基团增加，导致体系内产生较强的静电斥力[46]。吴慧等[47]采用TEMPO氧化法对竹溶解浆板（原纤维）进行纳米化，制备氧化CNF，研究发现，原纤维的羧基含量为0.01 mmol/g，经TEMPO氧化法处理的纤维羧基含量为1.27 mmol/g。
图6 CNF对复合凝胶ζ电位绝对值的影响
Fig. 6 Effect of CNF on the ζ-potential of composite gel
2.4.2 复合凝胶FTIR光谱分析
由图7可知，样品的吸收峰主要在3 430、2 950、1 645、1 550、1 250、1 080 cm-1附近。FTIR谱图在3 430 cm-1附近处有较宽的吸收峰，该峰对应的是O—H键和氢键的伸缩振动。添加CNF后样品的伸缩振动吸收峰增大，这可能是CNF表面所带的羟基或羧基与GN-GG体系内的基团之间发生了相互作用，生成更多的氢键或O—H键的原因，这可以使凝胶稳定性增强[48]。2 950 cm-1附近的峰对应C—H键的伸缩振动，实验组与对照组之间无显著差异。还观察到位于1 645、1 550、1 250 cm-1处的典型蛋白质吸收峰，分别对应蛋白质酰胺I带、酰胺II带、酰胺III带[49]。添加CNF后酰胺I带强度略有增强且略有蓝移，酰胺II带无显著变化，酰胺III带强度有所增强。蛋白质酰胺I带、酰胺II带和酰胺III带与蛋白质的二级结构相关[50]。这表明添加CNF后使蛋白质的结构发生改变，螺旋结构更加有序，提高了蛋白交联度。在1 080 cm-1附近处的吸收峰则与C—O—C键的伸缩振动相关，对比对照组的FTIR谱图，实验组凝胶在1 080 cm-1附近的吸收峰强度明显增强，这与CNF中所含金针菇多糖有关，金针菇多糖的C—O—C糖苷键在1 080 cm-1发生伸缩振动[51]。黄渫莹[52]研究发现，添加膳食纤维能够使大豆分离蛋白-壳聚糖-纤维凝胶在3 200～3 600、1 600～1 700、1 040～1 100 cm-1范围内的吸收峰强度增大。
图7 复合凝胶的FTIR图谱
Fig. 7 FTIR spectrum of composite gel
2.4.3 CNF对复合凝胶微观结构的影响
由图8可知，2 种凝胶均呈现孔状网络结构。未添加CNF的对照组凝胶网络结构疏松而不规则，孔径（90±10）μm。添加C N F 的实验组凝胶孔径为（4 0±8）μ m，并且可以在孔隙之间观察到CNF纤维丝结合在孔壁上，从而使实验组凝胶的网络结构明显比对照组凝胶的网络结构更加致密，孔径变小。这表明CNF的加入增大了凝胶网络结构的支撑作用，使凝胶强度增强，不易变形[53]。这也解释了添加CNF复合凝胶的WHC、G′、G″、硬度和咀嚼性均大于不含CNF的GN-GG复合凝胶的原因。马彦琪等[22]也发现，将CNF加入聚丙烯酰胺复合水凝胶中，复合水凝胶的微观结构相较于不含纳米纤维的结构更为致密。付宁宁等[54]以碳纳米纤维素和氧化石墨烯为原料制备气凝胶薄膜，研究发现，加入碳纳米纤维素能够减小凝胶的孔径，有助于凝胶形成连续的网状结构。
图8 CNF对复合凝胶微观结构的影响（×100）
Fig. 8 Effect of CNF on the microstructure of composite gel (× 100)
A.对照组；B.实验组。
3 结 论
制备金针菇CNF复合凝胶，并对其结构进行表征。当GN、GG添加量分别为5%和0.4%时，GN-GG复合凝胶具有较好的WHC和溶胀性。当CNF添加量为0.6%时，复合凝胶的WHC、溶胀性进一步提高，并具有较好的流变特性和质构特性。ζ电位结果显示，添加CNF后ζ电位绝对值增大，表明凝胶体系稳定性增强；由FTIR光谱可知，添加CNF后凝胶体系内的氢键、O—H键及糖苷键增多，蛋白交联度提高；SEM结果表明，添加CNF使复合凝胶的微观结构更加致密。综上，CNF-GN-GG复合凝胶具有较好的品质特性，有望作为复合型脂肪替代品应用于肉制品中生产低脂类产品。
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