烟熏是最古老的肉制品贮藏方式之一[1-2],由于其制品具有鲜艳的烟熏色泽及独特的烟熏风味,在世界各地广受欢迎[3]。研究[4]表明,发烟木屑的选择对熏制产品的风味有重要影响,这些风味来源于木屑中木质素、纤维素、半纤维素等生物质的热解及热解产物与食品中化合物的进一步反应[5],然而,关于木屑生物质构成与烟熏肉制品风味的相关性却鲜有报道。
在传统烟熏制品加工中,用于发烟的木屑通常就近获得,因此各地常用发烟木屑的差异形成了不同地域特色的烟熏制品。如山毛榉是欧洲最常见发烟木屑[2];在巴西,桉树等再造林木常用于培根的熏制[4];在一些沿海地区,椰子壳常被用于熏鱼干的加工[6];而在我国贵州通常使用香樟木、核桃木和甘蔗皮等一种或多种材料进行烟熏加工[7]。柏木和松木是我国西南地区荒山绿化造林的主要树种[8],其锯末常被作为商品发烟木屑使用,尤其柏叶常以闷燃发烟工艺用于四川传统腊肉加工中[9],然而这些材料在工业化烟熏上的研究较少,它们与其他商品木屑烟熏产品的挥发性化合物分布差异也尚不明确。
基于此,采用电子鼻结合气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)技术,以苹果木作为参照,从木屑生物质组分差异出发,对比不同发烟木屑在闷燃条件下对腊肉感官及风味的影响,并通过主成分分析(principal component analysis,PCA)和相关性分析探究四川再造林木烟熏腊肉与其他腊肉在挥发性化合物分布上的差异,为四川再造林木在烟熏工业中的应用提供参考依据。
柏叶屑采集于四川省巴中市;苹果木屑、柏木屑购于淘宝;松木屑购于巴中市巴山牧业股份有限公司;鲜猪后腿肉购于当地市场。
酚酞 西陇科学股份有限公司;硫酸铜 成都长联化工试剂有限公司;正构烷烃C7~C25标准品 西格玛奥德里奇贸易有限公司;氯化钠、苔黑酚、D-木糖、甲基红、溴甲酚绿 国药集团化学试剂有限公司;蒽酮北京沃凯生物科技有限公司;浓硫酸、浓盐酸、硫酸钾、氢氧化钠、氯化铁、葡萄糖、硼酸 成都市科隆化学品有限公司;以上试剂均为分析纯。
PEN3电子鼻 德国Airsence公司;GCMS-QP2010 Ultra GC-MS仪 日本岛津公司;DVB/CAR/PDMS 65 μm萃取头 美国Supelco公司;SGC酶标仪 赛默飞世尔(上海)仪器有限公司;KL-100B纯水仪 青岛精诚仪器仪表有限公司;ZFD-A5140鼓风干燥箱 上海智城分析仪器制造有限公司;HWS-26水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司;LDZX-50FBS高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂;KDN-04C消化炉 上海昕瑞仪器仪表有限公司;KDN定氮仪 杭州卓器电子科技有限公司;FA-2004分析天平 上海精密科学仪器有限公司;L1.6GB1热泵干燥箱 成都一恒科技有限公司;MS-H-Pro+磁力搅拌器 大龙兴创实验仪器(北京)股份公司。
1.3.1 烟熏腊肉加工方法
新鲜猪后腿肉切为厚3 cm左右、质量250 g左右的肉块,然后按肉质量的3%称取食盐均匀涂抹于肉块上,在4 ℃条件下腌制5 d,腌制过程中每隔24 h翻面一次。烟熏炉中加入1 kg木屑,木屑水分质量分数提前调整为10%~13%,以天然气喷火枪点燃木屑发烟,盖上炉盖,当炉盖出烟孔稳定出烟时进行烟熏。经过腌制的原料肉垂直悬挂于烟熏炉支架上烟熏4 h,烟熏结束后转入烘箱,在55 ℃条件下干制24 h,未经烟熏的对照组腌制后直接进行干制,干制后样品经晾挂自然冷却至室温后真空包装并分别编号为PM(苹果木屑)、SM(松木屑)、BM(柏木屑)、BY(柏叶屑)、B+P(柏叶屑与苹果木屑质量比1∶1混合木屑)及NS(对照组),所有样品于4 ℃条件下贮藏。
1.3.2 木屑中木质素、蛋白质及粗脂肪含量测定
依据NY/T 3494—2019《农业生物质原料 纤维素、半纤维素、木质素测定》[10]对木质素含量进行测定;依据GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》[11]第一法对蛋白质含量进行测定,其中,氮折算为蛋白质的系数取6.25;依据GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》[12]第一法对粗脂肪含量进行测定。所有样品重复测定3 次。
1.3.3 木屑中纤维素、半纤维素及总糖含量测定
参考张文博等[13]的方法并进行修改。样品水解:取1.3.2节脱脂后的干燥样品0.800 g移入250 mL试剂瓶中,加入8 mL 72%浓硫酸于30 ℃条件下保温1 h,保温结束后向试剂瓶中加入蒸馏水224 mL稀释,转入高压灭菌锅中于121 ℃保温1 h,样品液用玻璃砂芯坩埚G4过滤并清洗滤渣,清洗液与滤液合并后定容至500 mL备用。
半纤维素的测定:样品水解滤液稀释50 倍,取1 mL稀释液加入2 mL苔黑酚试剂(0.1 g FeCl3和0.2 g苔黑酚溶于100 mL 36%~38%浓盐酸中),于100 ℃沸水保温20 min,冷却至室温,于660 nm处测定吸光度,以木糖绘制标准曲线,横坐标为木糖含量,纵坐标为吸光度,得标准曲线方程为y=0.021 9x+0.013 2(R2=0.999 2),由标准曲线得到样品中木糖含量(C1/μg),样品中半纤维素含量按式(1)计算,所有样品重复测定3 次。
式中:m为脱脂前干燥样品质量/g。
纤维素的测定:样品水解液稀释20 倍,取1 mL稀释液加入2 mL蒽酮试剂(0.2 g蒽酮溶于100 mL 95%~98%浓硫酸中),混匀后于100 ℃沸水保温5 min,冷却至室温后于620 nm处测定吸光度,以葡萄糖绘制标准曲线,横坐标为葡萄糖含量,纵坐标为吸光度,得标准曲线方程为y=0.007 3x+0.012 1(R2=0.999 4),由标准曲线得到样品中葡萄糖含量(C2/μg),样品中纤维素含量按式(2)计算,所有样品重复测定3 次。
总糖含量为纤维素与半纤维素含量之和。
1.3.4 烟熏腊肉感官评价
感官评价小组由20 位从事食品加工相关研究的研究生组成,且所有小组成员按照Sivendiran等[14]的方法进行腊肉4 个感官属性(色泽、风味、滋味、组织状态)的评价培训。评价在饭后2 h进行,评价样品随机抽取,每次评价结束后用清水进行漱口并等待15 min后再对其他样品进行评价。腊肉于沸水条件下蒸制40 min,沿垂直于肌肉纤维方向切为厚薄均匀的薄片作为评价样品。具体评价标准如表1所示。
表1 烟熏腊肉感官评价标准
Table 1 Sensory scoring criteria for smoked bacon
感官属性评价标准分值色泽具有鲜艳烟熏色,瘦肉红润,脂肪亮黄17~25烟熏色较淡或过浓,焦黑,表面存在少许焦油沉积9~16无可辨识的烟熏色特征0~8风味具有浓郁烟熏风味及腊香味,无异味17~25烟熏味较淡或有轻微刺激性烟熏气味9~16无可辨识烟熏味或有严重异味0~8滋味烟熏滋味明显,无烟熏的苦味、焦炭味及脂肪哈败味17~25烟熏滋味较淡或有轻微烟熏的苦味、焦炭味9~16无可辨识的烟熏滋味或有严重异味0~8组织状态软硬适中,组织结构紧密,有弹性17~25组织结构完整,较硬或较软9~16组织状态不完整,过硬或过软0~8
1.3.5 烟熏腊肉电子鼻风味分析
检样前电子鼻预热1 h,预热后对传感器清洗3 000 s至雷达图充盈。称量粉碎腊肉样品2.0 g至25 mL顶空瓶中,加盖密封,顶空温度25 ℃,气体流量600 mL/min,测定时间120 s,每次样品检测间传感器清洗120 s,等待时间5 s。所有样品重复测定3 次,电子鼻传感器及主要响应物质见表2。
表2 电子鼻传感器及主要响应物质
Table 2 Electronic nose sensors and primary response substances
序号传感器敏感化合物1W1C芳香成分、苯类2W5S对广泛化合物敏感、对氮氧化合物特别敏感3W3C芳香成分4W6S主要对氢气有选择性5W5C烷烃芳香成分6W1S短链烷烃7W1W硫化物8W2S醇、醚、醛、酮类9W2W芳香成分、有机硫化物10W3S长链烷烃
1.3.6 烟熏腊肉中风味物质测定
样品前处理:称取10.0 g样品于40 mL顶空瓶中,加入20 mL饱和氯化钠溶液,均质1~2 min,放入一颗磁力搅拌子,加盖密封,插入固相微萃取头,调整并固定萃取头在顶空瓶中的位置,搅拌速率800 r/min左右,于80 ℃恒温萃取30 min后取出萃取头,插入GC-MS进样口于250 ℃解吸5 min。GC-MS工作条件:HP-5ms弹性毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);程序升温:柱初温60 ℃,保持4 min,以5 ℃/min升至160 ℃,然后再以6 ℃/min升至270 ℃,保持10 min;进样口温度250 ℃,载气(He)流速1 mL/min;手动进样。传输线温度280 ℃;电子电离源;电子能量70 eV;电子倍增器电压1 560 V;离子源温度230 ℃;四极杆温度150 ℃;扫描方式:全扫描,质量扫描范围:35~550 amu。定性方法:将各组分的MS碎片模式与NIST 20谱库进行比对,以C7~C25的正构烷烃作为标准参照,人工辅助解析图谱,保留正反匹配度≥750的挥发性组分。定量方法:通过面积归一化法求得样品中各挥发性风味组分的相对含量。
使用SPSS 26统计分析软件进行数据处理,使用Origin 2018C及ChiPlot(网页)进行绘图,电子鼻PCA由设备自带软件完成。
由表3可知,柏叶屑中木质素、油脂及蛋白质含量均显著高于其他木屑(P<0.05),木质素是由愈创木酰基、丁香基及对羟基苯单体构成的一种复杂酚类聚合物[15-16],在热解过程中可产生大量酚类[17],是烟熏风味的主要来源[18-19];油脂含量高的木屑发烟时易产生浓烟,并伴随焦油与多环芳烃污染的风险[20],但木屑的精油能赋予烟熏产品特有的木屑香气[21],蛋白质在发烟过程中形成N-杂环化合物[22],通常为吡咯、吡嗪和卡巴唑,吡咯具有甜的烟熏味和烧焦味,而吡嗪则有类似于爆米花的香味[20]。因此,相较于其他木屑,采用柏叶屑作为发烟材料时,烟熏制品可能具备更强烈的烟熏风味,也可能伴随更高的污染风险。在糖类组成方面,柏叶屑的纤维素、半纤维素及总糖含量均显著低于其他木屑(P<0.05)。Zong Peijie等[23]研究认为,由于多糖结构和反应途径相似,其热解产物含量及碳原子数分布呈现相似的趋势,热解过程主要产物为羰基化合物,其次为氧杂环化合物,由于烟熏色泽的形成依赖于羰氨反应,故相较于木屑,采用柏叶屑作为发烟材料时,烟熏制品可能烟熏色呈现较差。
表3 4 种木屑的生物质组成
Table 3 Biomass composition of four kinds of wood chips
注:同行小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。
生物质质量分数/%柏叶屑松木屑苹果木屑柏木屑半纤维素17.65±0.86c18.93±0.39b24.57±0.30a19.39±0.49b纤维素11.03±0.04d41.06±0.91a28.39±0.06c34.97±0.53b总糖28.68±0.85c59.99±0.78a52.96±0.35b54.36±1.01b油脂8.54±0.23a6.19±0.48b4.79±0.32c3.96±0.59d蛋白质16.65±0.23a1.94±0.02c6.40±0.14b1.78±0.28c木质素42.84±0.06a32.49±1.49d34.12±0.26c38.85±0.47b
如图1所示,烟熏腊肉与非烟熏腊肉外观呈现明显差异,烟熏腊肉表面整体具有光泽,呈现棕褐色,而非烟熏腊肉表面则呈现玫瑰红色。如表4所示,烟熏并未对腊肉组织状态产生显著影响(P>0.05),不同发烟木屑对烟熏腊肉滋味无显著影响(P>0.05)。与其他烟熏腊肉相比,BM组色泽更深,呈现焦褐感,从而导致色泽评分显著低于其他组烟熏腊肉(P<0.05),BY组烟熏风味评分高于其他组,这可能与柏叶屑的木质素、蛋白质和油脂含量显著高于其他木屑(P<0.05)从而形成更多风味物质有关。PM、SM、BM组的风味、滋味评分无显著差异(P>0.05)。
图1 不同木屑烟熏腊肉的外观图
Fig. 1 Visual appearance of smoked bacon with different wood chips
表4 不同木屑烟熏腊肉的感官评分
Table 4 Sensory scores of smoked bacon with different wood chips
注:同列小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。
组别色泽评分风味评分滋味评分组织状态评分总分PM17.40±1.82b17.85±2.03b19.25±2.47a19.80±1.47a74.30±3.61a SM19.75±1.97a18.55±2.28ab18.45±1.10a19.65±2.13a76.40±3.72a BM14.80±1.20c18.20±1.82b18.90±2.02a19.05±1.76a70.95±3.46b BY17.85±1.66b19.95±1.73a18.75±1.89a19.85±1.53a76.40±4.08a B+P18.15±1.73b19.10±1.52ab19.25±1.71a19.35±1.42a75.85±2.72a NS9.95±1.47d9.55±1.57c10.50±0.95b18.55±1.32a48.55±3.50c
由图2可知,在W5S、W1S、W1W、W2W 4 个传感器上,6 组腊肉响应值差异反映了烟熏腊肉与非烟熏腊肉之间、不同发烟材料烟熏腊肉之间的风味差异,其中W5S、W1W、W2W传感器响应值最高,故6 组腊肉主要风味物质可能为氮氧化合物、短链烷烃、硫化物、芳烃化合物和有机硫化物,这与吴靖娜等[24]的研究结果相似。通过6 组腊肉电子鼻响应值雷达图轮廓可知,BY、B+P组腊肉风味最强,PM、SM、BM组次之,NS组最差,说明烟熏明显增强了腊肉的风味,而在相同的烟熏条件下,与其他木屑相比,采用柏叶屑作为发烟材料能获得更强的烟熏风味。
图2 不同木屑烟熏腊肉的电子鼻响应值雷达图
Fig. 2 Radar plot of electronic nose response data of smoked bacon with different wood chips
对6 组腊肉电子鼻检测结果进行PCA,其PCA样品区域如图3所示,传感器矩阵如图4所示。由图3可知,PC1方差贡献率为75.39%,PC2方差贡献率为24.17%,累计方差贡献率为99.56%,说明PC1和PC2较好地反映了6 组腊肉气味信息。烟熏组与非烟熏组主要差异体现在PC2上,因此PC2反映烟熏腊肉与非烟熏腊肉的风味差异,PC1主要反映各烟熏组之间的差异。在PC1上,BM、SM、PM组较为接近,即柏木屑、松木屑风味特征与苹果木屑差异不明显,BY组处于PC1最右侧,B+P组存在向BY组靠近的趋势,因此,当在苹果木屑中添加柏叶屑,可使腊肉获得一定的柏叶屑熏烟特征风味。由图4可知,PC2主要受W1S、W2S、W2W的影响,PC1主要受W1W、W5S的影响,因此本实验中烟熏腊肉短链烷烃、醇类和醛酮类化合物、芳香族成分、有机硫化物含量比非烟熏腊肉更高,而柏叶屑烟熏腊肉中硫化物和氮氧化物含量高于木屑烟熏腊肉。
图3 不同木屑烟熏腊肉的电子鼻PCA图
Fig. 3 PCA plot of smoked bacon with different wood chips based on electronic nose signals
图4 不同木屑烟熏腊肉电子鼻传感器的矩阵图
Fig. 4 Matrix plot of smoked bacon with different wood chips based on electronic nose signals
6 组腊肉共检出187 种挥发性化合物,化合物信息如表5所示。在肉制品中烃、醛、酮类化合物的形成均与脂肪和蛋白质的氧化有关[25-27],以上化合物在非烟熏腊肉中的相对含量高于烟熏组,可能与烟熏引入大量挥发性化合物及抑制了脂肪和蛋白质的氧化有关。含氮化合物和萘及其衍生物仅在烟熏组中被检出,且BY、B+P组中含氮化合物含量较高,这可能与其发烟木屑中蛋白质含量较高有关,Zong Peijie等[23]认为蛋白质在热解过程中形成的N-杂环、吡咯、吡啶、腈和胺等物质是熏烟中含氮化合物的主要来源。酚类化合物对烟熏肉制品的烟熏风味形成有重要影响[18],其主要来源于木质素的热解[17],在烟熏组中,酚类化合物构成所有检出挥发性物质的主体,PM、SM、BM、BY、B+P组检出酚类化合物相对含量分别为65.36%、66.22%、55.87%、53.06%、53.68%,而非烟熏组NS组中仅检出5 种,相对含量为3.20%,高含量的酚类化合物除能为腊肉提供特征烟熏风味外,同时具有较好的抗氧化活性[28-29],这与非烟熏组腊肉烃、醛、酮类化合物含量高于烟熏组相印证,推测是烟熏组高含量的酚类化合物的抗氧化活性造成了这一结果。PM组与SM组酚类化合物相对含量接近且高于其他烟熏组,故在本实验条件下,高木质素含量木屑并未产生高相对含量的酚类化合物。与NS组情况相似,毛永强等[30]在非烟熏腊肉中也少量检出酚类化合物,这些酚类化合物可能来源于蛋白质的热解[31]。
表5 不同木屑烟熏腊肉的挥发性化合物组成
Table 5 Composition of volatile compounds of smoked bacon with different wood chips
含量/%数量相对含量/%醇类64.82105.96912.7354.5144.4467.42酚类2065.361766.221555.871653.062053.6853.20含氮化合物52.7510.1810.1696.3273.9100醚类42.2431.414232.8820.9714.19萘及其衍生物10.140032.2897.561112.2800醛类58.02610.3458.7855.2532.58416.11酸类65.8774.451210.7474.7286.3776.77烃类62.31105.0882.26146.91158.641720.99酮类73.4153.1072.14106.4973.56612.72酯类63.5151.9641.1310.2720.551525.97总计6698.436498.706898.097997.977996.986197.37化合物种类PMSMBMBYB+PNS数量相对含量/%数量相对含量/%数量相对含量/%数量相对含量/%数量相对
对表5中各类挥发性化合物总相对含量进行PCA,提取特征值大于1的PC,如表6所示,前3 个PC解释了总变异的93.909%:PC1解释54.803%,PC2解释26.872%,PC3解释12.235%,因此以上PC能较好地反映各腊肉中挥发性风味物质变化趋势。
表6 PC方差贡献率
Table 6 Contribution rates of principal components to total variance
初始特征值提取载荷平方和PC总计方差贡献率/%累计方差贡献率/%总计方差贡献率/%累计方差贡献率/%15.48054.80354.8035.48054.80354.803 22.68726.87281.6752.68726.87281.675 31.22312.23593.9091.22312.23593.909
各类挥发性化合物在3 个PC上的载荷如表7所示,载荷绝对值大于0.4表示该类化合物对PC呈主要相关,则醚类、醛类、烃类、酮类、酯类对PC1呈主要正相关,酚类、萘及其衍生物、含氮化合物对PC1呈主要负相关;含氮化合物、萘及其衍生物、烃类、酮类对PC2呈主要正相关,醇类、酸类对PC2呈主要负相关;萘及其衍生物、酸类对PC3呈主要正相关。
表7 因子载荷矩阵
Table 7 Factor loading matrix
挥发性成分载荷值PC1PC2PC3醇类0.247-0.8730.365酚类-0.923-0.213-0.310含氮化合物-0.5170.7290.224醚类0.8610.1940.037萘及其衍生物-0.5210.5230.641醛类0.900-0.289-0.320酸类0.122-0.7570.618烃类0.8470.4150.196酮类0.8880.4410.095酯类0.9780.1130.004
如图5所示,在PC1上烟熏组与非烟熏组得到良好区分,NS组在PC1正向端得分较高,在PC2、PC3轴上趋近于零点,即对非烟熏腊肉风味构成起主要影响的挥发性化合物为醚类、醛类、烃类、酮类、酯类,以上化合物在肉制品中的产生均与脂肪或氨基酸氧化相关[25-27],因此非烟熏腊肉主要风味形成可能以脂肪氧化为主。各烟熏组在PC2、PC3上的不同体现了不同烟熏材料对烟熏腊肉风味构成的差异,BY与B+P组处于PC1负向端,PC2、PC3正向端,因此它们的风味构成受含氮化合物、萘及其衍生物影响较大,这与电子鼻分析结果一致。由于柏叶屑蛋白质、油脂含量较高,故此区域可近似代表一类高油脂、高蛋白木屑烟熏肉的风味结构特征,BM处于PC2负向端,故其主要受酸类、醇类影响较大,SM、PM在3 个PC上得分均相似,因此松木屑、苹果木屑熏制腊肉风味特征类似,这与电子鼻分析结果一致。
图5 不同木屑烟熏腊肉PCA得分图
Fig. 5 Score plots of PCA for smoked bacon with different wood chips
如图6所示,醚类、醛类、酸类、烃类、酮类、酯类相对含量与各生物质含量均呈负相关,这可能是由于烟熏向腊肉中引入大量的酚类、含氮化合物等风味物质或抑制了脂肪氧化。酚类相对含量与半纤维素、纤维素及木质素的含量呈显著正相关(r=0.96、0.82、0.89,P<0.05),虽然普遍认为熏烟中的酚类主要来源于木质素的热解[32],但闷燃烟熏中,半纤维素对风味物质中酚类相对含量的作用大于木质素,这可能是由于半纤维素降低了木质素热解所需能量,或由于木材燃烧温度低,降低了木质素热解效率[23]。含氮化合物与木屑中蛋白质含量呈高度显著正相关(r=0.99,P<0.001),而其他生物质与含氮化合物含量相关性较小。萘及其衍生物是唯一通过GC-MS被检出的多环芳烃及其衍生物,相关性热图显示,其相对含量与油脂、蛋白质、木质素含量均呈正相关,但相关性均不显著(r=0.59、0.78、0.49,P>0.05),故木屑种类对闷燃中萘及其衍生物产生的影响可能大于木屑生物质组成对其的影响。
图6 木屑生物质组成与腊肉挥发性物质相关性热图
Fig. 6 Correlation heatmap between biomass composition of wood chips and volatile substances of bacon
本研究对比柏叶屑、松木屑、柏木屑、苹果木屑生物质组分的差异,并分析在闷燃条件下不同发烟木屑对烟熏腊肉的品质及挥发性化合物组成的影响。结果表明:柏叶屑木质素、油脂及蛋白质含量高于其他木屑;电子鼻分析结果显示,烟熏提升了腊肉风味强度,柏叶屑烟熏增强腊肉风味强度的能力高于其他木屑,柏木屑、松木屑与苹果木屑烟熏风味特征类似,向苹果木屑中添加柏叶屑增强了终产品的风味强度;GC-MS分析结果显示,酚类构成了烟熏腊肉风味的主体,在烟熏腊肉中相对含量为53.06%~65.36%,而非烟熏腊肉中仅为3.2%,采用柏叶屑烟熏的腊肉终产品挥发性物质中含氮化合物、萘及其衍生物相对含量较高;相关性分析显示,酚类相对含量与半纤维素、纤维素及木质素的含量呈正相关,且半纤维素相关性大于木质素,含氮化合物相对含量与木屑中蛋白质含量呈正相关,萘及其衍生物相对含量与油脂、蛋白质、木质素含量均呈正相关,但相关性均不显著(P>0.05),因此木屑种类对闷燃中萘及其衍生物产生的影响可能大于木屑生物质组成对其的影响。本研究结论为四川再造林木在烟熏加工中的应用提供了参考依据。
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