中国传统酸肉是一种熟食、发酵时间较长的发酵肉制品。耿马酸肉是云南省临沧市耿马县当地特色的发酵肉制品，当地居民主要以生食为主，也可蒸熟后食用。耿马酸肉是由剁碎的猪瘦肉、熟猪皮条及辅料混匀后，用新鲜柊叶包裹发酵2～6 d而成。据报道，一些即食发酵肉制品可能存在生物胺中毒和致病菌致病的风险[1-2]，某些传统酸肉中也检出较高含量的生物胺和较多数量的致病菌[3-5]。目前，接种发酵是提高酸肉食用品质和安全性常见的方法之一，如Zhang Yunlong等[6]研究表明，湘西酸肉接种弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）可减少成品中的大肠菌群数、生物胺和总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量。牦牛酸肉接种植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）M1和异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y26可提高氨基酸含量，同时降低大肠菌群数、TVB-N含量和亚硝酸盐残留量[7]。上述研究结果均表明，人工接种发酵可提高酸肉的食用品质和安全性，而目前关于乳酸菌对耿马酸肉的食用品质和安全性的影响相关报道较少。因此，本研究选用从传统耿马酸肉中筛选出的3 株乳酸菌经复配后接种于耿马酸肉中进行发酵，并以自然发酵的耿马酸肉为对照，通过分析其理化指标、微生物和感官品质的变化，探究人工接种发酵对耿马酸肉品质和安全性的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
猪瘦肉、猪皮、味精、食盐购于云南省昆明市朗悦湾尚购超市；糯米、新鲜柊叶购于耿马县农贸市场。本研究所采用的菌株（植物乳植杆菌GMSR-4、戊糖乳杆菌（Lactiplantibacillus pentosus）GMSR-20、植物乳植杆菌GMSR-35）由实验室前期从传统耿马酸肉中筛选所得。
8 种生物胺标准品（纯度≥98%） 南通飞宇生物科技有限公司；17 种游离氨基酸标准品（纯度≥99%）美国Sigma-Aldrich公司；衍生试剂盒 美国沃特世科技有限公司；乙腈、甲醇、甲酸、磺基水杨酸、柠檬酸三钠（均为分析纯） 上海安谱实验科技股份有限公司；四硫磺酸钠亮绿培养基、亚硒酸盐胱氨酸增菌培养基、沙门氏菌显色培养基、赖氨酸脱酸酶肉汤培养基、李斯特氏菌显色培养基 青岛海博生物技术有限公司；结晶紫中性红胆盐琼脂培养基、煌绿乳糖胆盐肉汤培养基、MRS肉汤、MRS培养基、平板计数琼脂 广东环凯微生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
Vanquish超高压液相色谱仪、Q Exactive质谱仪美国赛默飞世尔科技公司；5430R低温高速离心机德国艾本德公司；Tissuelyser-48组织破碎仪 上海净信实业发展有限公司；LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌器上海博迅实业有限公司；SHP-350生化培养箱 北京中兴伟业仪器有限公司；Biochrom 30+氨基酸自动分析仪英国柏楉有限公司；HD-3A智能水分活度测定仪 无锡市华科仪器仪表有限公司；U-2910紫外-可见分光光度计日本日立公司；TA-2XJP细菌浊度计 北京天安联合科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株的活化与制备
将3 株乳酸菌从-80 ℃冰箱取出，在无菌条件下，取200 μL菌液接入MRS肉汤中活化，连续培养3 代，将第3代菌液在4 ℃、10 000×g下离心15 min，沉淀物用无菌生理盐水洗涤3 次，再用无菌生理盐水和细菌浊度计将菌液的浓度调整为107 CFU/mL，备用[8]。
1.3.2 耿马酸肉的制作
耿马酸肉基本配方：剁碎的猪瘦肉、熟猪皮条质量比7∶3，5%食盐、5%糯米饭、0.01%亚硝酸钠、0.05%味精，均以剁碎的猪瘦肉和熟猪皮条总质量计，新鲜柊叶若干，制作流程见图1。
图1 耿马酸肉制作流程
Fig. 1 Process flow chart for Gengma sour meat production
1.3.3 耿马酸肉的分组与采样
实验分组：1）接种发酵（inoculation fermentation，IF）组：接种3% 107 CFU/mL的复配菌液（植物乳植杆菌GMSR-4、戊糖乳杆菌GMSR-20、植物乳植杆菌GMSR-35菌液体积比1∶2∶2，该比例由前期实验筛选得出，在此比例下，耿马酸肉的品质和安全性最高）；2）对照（control check，CK）组：不接种菌液。2 组均在25 ℃下发酵6 d。
样品采集：选取发酵结束后的耿马酸肉样品进行采样。感官评分和pH值在取样后1 h内测定；用于测定微生物的样品在无菌操作台上取样并置于-80 ℃贮藏，用于其他理化指标、游离氨基酸和生物胺含量测定的样品置于-20 ℃贮藏，备用，所有指标的样品重复数为4。
1.3.4 耿马酸肉理化指标测定
pH值：参照GB 5009.237—2016《食品pH值的测定》；水分含量：参照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》；亚硝酸盐残留量：参照GB 5009.33—2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》；TVB-N含量：参照GB 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》。
1.3.5 耿马酸肉中游离氨基酸含量测定
游离氨基酸：参考Zhong Aiai等[9]的方法，稍作修改。准确称取2.0 g耿马酸肉样品，加20 mL纯水均质后移至50 mL容量瓶，定容至刻度，混匀，4 ℃放置24 h。取20 mL上清液于100 mL离心管中，加入20 mL 5 g/100 mL磺基水杨酸溶液，混匀，4 ℃、6 000×g离心10 min，取20 mL上清液于旋转蒸发仪中蒸干，加入1 mL 0.2 mol/L柠檬酸钠缓冲液溶解后用0.45 μm滤膜过滤，滤液用氨基酸自动分析仪测定。
1.3.6 耿马酸肉中微生物测定
菌落总数：参照GB 4789.2—2022《食品微生物学检验 菌落总数测定》；乳酸菌：参照GB 4789.35—2023《食品微生物学检验 乳酸菌检验》；大肠菌群：参照GB 4789.3—2016《食品微生物学检验 大肠菌群计数》；沙门氏菌：参照GB 4789.4—2016《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》；单核细胞增生李斯特氏菌（以下简称李斯特菌）：参照GB 4789.30—2016《食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》；金黄色葡萄球菌：参照GB 4789.10—2016《食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》。
1.3.7 耿马酸肉中生物胺含量测定
参考Guba[10]、Armenta[11]等的方法，稍作修改。取0.1 g耿马酸肉于离心管中，加入0.5 mL 0.1 mol/L盐酸，涡旋混匀，室温提取1 h；在4 ℃、12 000 r/min下离心10 min，上清液稀释3 倍；取10 μL稀释液到2 mL EP管中，加入70 uL AccQ·Tag Ultra Borate缓冲液和20 μL AccQ·Tag试剂，混匀；将混合物于55 ℃金属加热器上加热10 min，冷却至室温，用超高压液相色谱仪进行检测。仪器参数：Water BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱温55 ℃；进样量1 μL，流速0.5 mL/min，流动相A：超纯水（含0.1%甲酸）；流动相B：乙腈（含0.1%甲酸）。洗脱程序：0 min，流动相A体积分数95%，0～5.5 min，流动相A体积分数由95%降至90%，5.5～7.5 min，流动相A体积分数由90%降至75%，7.5～8 min，流动相A体积分数由75%降至40%，8～8.5 min，流动相A体积分数由40%升至95%，8.5～9.5 min，流动相A体积分数95%。质谱条件：采用电喷雾离子源；鞘气压力40 arb；辅助气压力10 arb；离子喷雾电压3 000 V；温度350 ℃；离子传输管温度320 ℃；扫描模式为全扫描模式，扫描方式为正离子，扫描范围150～700 Da。
1.3.8 耿马酸肉感官评定
2 组样品用蒸汽锅蒸煮30 min，剥开柊叶切成薄片。评分人员由15 名食品专业在读硕士研究生组成，在进行感官评分时不得相互交谈，更换样品时用矿泉水漱口，满分为10 分，评定标准见表1。
表1 耿马酸肉感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation criteria for Gengma sour meat
评价指标评分标准得分外观柊叶无破损，瘦肉与猪皮完全嵌合柊叶稍有破损，猪皮与瘦肉的镶嵌性较差柊叶破损严重，猪皮与瘦肉无镶嵌性8～10 5～7 1～4组织形态组织状态致密，干湿适中组织状态较密，较干或较湿组织状态松散，切片难以成型8～10 5～7 1～4色泽瘦肉呈粉红或玫瑰色，猪皮呈浅黄色，有光泽瘦肉呈灰红或暗红色，猪皮呈棕褐色，有光泽瘦肉、猪皮呈色不均，色差明显8～10 5～7 1～4气味发酵肉香浓郁，无异味发酵肉香一般，无异味发酵肉香较弱，有异味8～10 5～7 1～4口感肉质软硬适中，有韧性、有嚼劲肉质略软或略硬，有一定韧性肉质过软或过硬，无韧性和咀嚼感8～10 5～7 1～4滋味酸度柔和，多滋鲜美酸度较柔和，多滋鲜美过酸或没有酸味，滋味不协调8～10 5～7 1～4整体接受度非常喜欢，各方面均可接受一般喜欢，部分接受不喜欢，难以接受8～10 5～7 1～4
1.4 数据处理
用SPSS 25.0进行方差分析和t检验，Origin 2021进行绘图，数据均以平均值±标准差的形式表示。
2 结果与讨论
2.1 人工接种发酵对耿马酸肉理化指标的影响
由表2可知，发酵结束时，CK组耿马酸肉的pH值显著高于IF组（P＜0.05）。CK组中的微生物来源于原料和环境中，发酵较为缓慢，而IF组一开始就接种了大量的乳酸菌，乳酸菌利用碳水化合物快速产生有机酸，因此发酵快，pH值较低。Lü Jing等[12]在发酵的侗族酸肉中接种酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）LXPSC1，导致pH值显著高于自然发酵，与本研究结果不一致，可能是与所接种的菌不同有关。IF组耿马酸肉的水分质量分数显著低于CK组（P＜0.05），可能与IF组的pH值显著低于CK组有关。据报道，新鲜猪肉中的蛋白质结构由氢键、疏水相互作用、静电相互作用及二硫键组成，在发酵过程中，较低的pH值使这几种作用力对蛋白三维结构的贡献比例发生变化，从而改变蛋白质与水的结合能力[13]，使耿马酸肉中的水分减少。小鼠实验表明，高剂量的亚硝酸盐可造成胎儿脑损伤、胎儿缺氧和流产等不可逆影响[14]。CK组和IF组耿马酸肉的亚硝酸盐残留量均低于GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》中发酵肉制品最大残留量（30 mg/kg），CK组耿马酸肉的亚硝酸盐残留量是IF组的2.38 倍，表明接种乳酸菌可减少亚硝酸盐在耿马酸肉中的积累，这与Hu Xinyu等[15]在发酵泡菜中的研究结果一致。TVB-N含量是评价肉制品新鲜度的指标之一，TVB-N含量越高，表明动物性食品的腐败程度越高[16]。IF组耿马酸肉的TVB-N含量显著低于CK组（P＜0.05），较低的pH值和水分含量可抑制腐败菌的生长，从而减少胺和氨类物质的生成量。
表2 耿马酸肉的理化指标
Table 2 Physicochemical indicators of Gengma sour meat
注：同行小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。表3～5同。
指标CK组IF组pH4.69±0.02a4.42±0.07b水分质量分数/%70.78±0.80a65.88±0.43b亚硝酸盐残留量/（mg/kg）5.43±0.55a2.28±0.49b TVB-N含量/（mg/100 g）4.58±0.22a3.80±0.37b
2.2 人工接种发酵对耿马酸肉游离氨基酸含量的影响
由表3可知，CK组和IF组耿马酸肉均检出17 种游离氨基酸，其中仅CK组中的精氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和游离氨基酸总量显著低于IF组（P＜0.05），其余游离氨基酸含量差异不显著。2 组间大部分游离氨基酸含量差异不显著，可能是发酵时间较短（仅为6 d）所致。一般而言，发酵食品的发酵时间越长，产品中的游离氨基酸含量越高，如发酵300 d的三川火腿中的游离氨基酸含量远高于发酵0 d的样品[17]。
表3 耿马酸肉的游离氨基酸含量
Table 3 Free animo acid content of Gengma sour meat mg/g
游离氨基酸CK组IF组谷氨酸3.20±0.04a3.34±0.14a丙氨酸0.35±0.02a0.37±0.02a丝氨酸0.11±0.05a0.15±0.04a天冬氨酸0.11±0.02a0.13±0.01a甘氨酸0.15±0.01a0.16±0.01a苏氨酸0.07±0.04a0.08±0.05a胱氨酸0.29±0.01a0.28±0.01a缬氨酸0.20±0.02a0.21±0.03a蛋氨酸0.12±0.01a0.14±0.01a异亮氨酸0.12±0.01a0.13±0.02a脯氨酸0.18±0.02a0.20±0.04a酪氨酸0.07±0.02a0.07±0.03a赖氨酸0.28±0.04a0.37±0.03a组氨酸0.09±0.02a0.11±0.02a精氨酸0.04±0.04b0.06±0.06a苯丙氨酸0.21±0.01b0.23±0.02a亮氨酸0.27±0.01b0.30±0.01a总量5.89±0.08b6.33±0.30a
2.3 人工接种发酵对耿马酸肉中微生物的影响
耿马酸肉富含营养物质，有利于微生物的生长繁殖，从而引发腐败，因此微生物指标是衡量耿马酸肉安全性的主要指标之一。由表4可知，CK组耿马酸肉的菌落总数和乳酸菌数显著低于IF组（P＜0.05），与Hongthong等[18]接种植物乳杆菌发酵Isan（一种发酵香肠）的结果一致。CK组和IF组均未检测到沙门氏菌和李斯特菌；CK组中检出＜10 CFU/g的金黄色葡萄球菌，IF组中未检测到。IF组的大肠菌群数显著低于CK组（P＜0.05），其中，CK组中大肠菌群数是IF组的1.47 倍。其原因可能是：1）适当的水分含量和pH值是致病菌生长繁殖的重要条件，IF组的水分含量和pH值显著低于CK组（表2），而较低的水分含量和pH值不利于金黄色葡萄球菌和大肠菌群的增殖；2）IF组中的乳酸菌数显著高于CK组，乳酸菌对金黄色葡萄球菌和大肠菌群具有抑制作用。李廷任等[4]的实验结果表明，接种发酵可有效抑制酸肉中大肠菌群的数量。Tangwatcharin等[19]在接种植物乳杆菌发酵的Moo Som中也发现了类似的结果。
表4 耿马酸肉中微生物数量
Table 4 Microbial quantity of Gengma sour meat
注：ND.未检出。表5同。
微生物数量CK组IF组菌落总数（lg（CFU/g））7.89±0.12b8.47±0.29a乳酸菌数（lg（CFU/g））6.69±0.13b7.94±0.57a沙门氏菌数/（CFU/25 g）NDND李斯特菌数/（CFU/25 g）NDND金黄色葡萄球菌数/（CFU/g）＜10ND大肠菌群数（lg（CFU/g））4.18±0.26a2.84±0.05b
2.4 人工接种发酵对耿马酸肉生物胺含量的影响
由表5可知，CK组耿马酸肉可检出组胺、精胺、腐胺、尸胺、亚精胺、酪胺、苯乙胺、色胺8 种生物胺，IF组中可检出7 种生物胺，未检测到组胺。2 组间除精胺外，所有生物胺含量均具有显著差异（P＜0.05）。据报道，精胺是发酵肉制品中天然存在的生物胺，其含量不会随环境的变化而变化[20]。CK组的生物胺总量显著高于IF组（P＜0.05），大约是IF组的2.6 倍。其原因有二：一是CK组中的乳酸菌数显著低于IF组（P＜0.05），乳酸菌产生的细菌素和有机酸可抑制产胺微生物的生长繁殖，从而抑制氨基酸脱羧酶的活性，使生物胺的生成量减少[21]；二是据报道，金黄色葡萄球菌和大肠菌群可产生多种生物胺[22-23]，而CK组的大肠菌群数和金黄色葡萄球菌数显著高于IF组（P＜0.05），表明接种发酵可以减少生物胺的积累，这与接种发酵可减少泰国发酵肉Moo Som[24]、Nham[25-26]等中生物胺积累的报道结果一致。
表5 耿马酸肉的生物胺含量
Table 5 Biogenic amine content of Gengma sour meat mg/kg
生物胺CK组IF组组胺6.52±0.30ND精胺8.62±0.44a8.52±0.66a腐胺24.82±0.91a3.67±0.21b尸胺57.79±4.31a11.81±0.67b亚精胺0.80±0.01a0.55±0.07b酪胺63.88±6.30a37.46±4.07b苯乙胺2.34±0.26a0.35±0.06b色胺0.51±0.15a0.11±0.01b总量165.27±11.21a62.47±5.15b
2.5 人工接种发酵对耿马酸肉感官品质的影响
由图2可知，IF组耿马酸肉的外观、组织形态、色泽、气味、口感、滋味和整体接受度评分均高于CK组。在接种解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）的侗族酸肉中也得出类似的结果，接种发酵的侗族酸肉色泽、组织形态、滋味和总体接受度等感官指标评分均高于自然发酵组[27]。
图2 耿马酸肉感官评分雷达图
Fig. 2 Radar map of the sensory evaluation of Gengma sour meat
3 结 论
IF组耿马酸肉产品的pH值、水分含量、亚硝酸盐残留量和TVB-N含量均显著低于CK组（P＜0.05）；菌落总数和乳酸菌数显著高于CK组（P＜0.05），大肠菌群数显著低于CK组（P＜0.05），沙门氏菌和李斯特菌在IF组和CK组均未检测到；接种发酵对大多数游离氨基酸含量影响不显著（P＜0.05），可明显减少生物胺的含量。综上，人工接种发酵可抑制致病菌的生长，减少生物胺的积累，提高耿马酸肉的食用品质和安全。
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