鹅肉营养价值丰富，富含人体所需氨基酸、维生素及微量元素，同时脂肪含量较低，脂肪酸构成平衡，这对于人体非常有益[1-2]。2002年，联合国粮农组织认定鹅肉为21世纪需要优先发展的绿色食品之一[3]。在目前鹅产业体系中，鹅肉的贮运销售仍然采用冷冻方式，而新鲜鹅肉的市场销售存在明显的限制。工厂成批收购鹅肉或鹅肉“从农场到餐桌”过程中，难免会出现环境温度波动变化，导致鹅肉经历反复冻融，鹅肉中的营养元素、蛋白质和肌纤维会在反复冻融过程中发生损失，引发一系列生理和生化反应，最终会对鹅肉的整体质量产生影响并降低其食用价值。
为提高肉制品冷冻和冷藏性能，添加抗冻剂被认为是一种有效的方法[4]。根据成分和化学性质的不同，抗冻剂可以分为四大类：糖类、蛋白类、盐类和多酚类[5]。磷酸盐类抗冻剂添加量过高不仅会有苦涩味，也会影响人体对钙的吸收，还会加重肾脏负担[6]。蛋白类抗冻剂效果虽好，但成本过高。因此，本研究选用糖类和多酚类抗冻剂。糖类抗冻剂能够使食品中自由水向结合水转化，这种转化能明显抑制水分的迁移[7]，并有效抑制冰晶的形成，还能促进蛋白质、多糖等天然大分子在冷冻过程中的玻璃态转化[8]。多酚类抗冻剂不仅具有抗氧化特性，而且能够作为蛋白质的交联剂，与蛋白质形成络合物，有助于维持蛋白质的构象稳定性，可以在肉类及肉制品中发挥一定的冷冻保护效果[9]。海藻糖和山梨糖醇是常用的低糖、低热量糖类抗冻剂，茶多酚是天然植物来源、安全且抗氧化作用较好的多酚类抗冻剂。研究表明，复合抗冻剂比单一抗冻剂具有更佳的效果。已有天然抗冻剂在猪肉、牛肉和水产品中较多的研究报道，但应用于鹅肉的研究较缺乏，而不同畜禽肉由于水分、蛋白质、脂肪等成分的构成和含量不同，对抗冻剂的效应有所不同。因此，本研究选用海藻糖、山梨糖醇和茶多酚进行复配，探究复合抗冻剂对反复冻融鹅肉品质的影响，旨在为实际生产中冻鹅肉的品质提升提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
固始白鹅购自本地市场。
海藻糖（食品级） 日本株式会社林原；山梨糖醇（食品级） 石家庄瑞雪制药有限公司；茶多酚（食品级） 安徽红星药业股份有限公司；氯化钠、三氯乙酸、硼酸、五水硫酸铜、氢氧化钠（均为分析纯）郑州派尼化学试剂厂；2-硫代巴比妥酸（分析纯）上海麦克林生化科技有限公司；氧化镁、磷酸氢二钠、酒石酸钾钠（均为分析纯） 天津科密欧化学试剂有限公司；乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（ethylene glycol bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid，EGTA）（分析纯） 合肥千盛生物科技有限公司；氯化镁（分析纯） 天津恒兴化学试剂制造有限公司；牛血清白蛋白 上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
MS-PA磁力搅拌器 大龙兴创实验仪器（北京）股份公司；雷磁PHS-3C pH计 上海仪电科学仪器有限公司；A390紫外分光光度计 翱艺仪器（上海）有限公司；TDL-40B低速离心机 上海安亭科学仪器厂；TGL-16B台式高速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；CP214分析天平 上海奥豪斯仪器有限公司；DZKW-0-2电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 鹅肉样品处理
对鹅肉进行分割处理，取鹅胸脯肉，去皮，剔除筋膜及可见脂肪，切成5.0 cm×3.0 cm×1.2 cm大小的块状若干份，用于后续实验。
1.3.2 抗冻剂单因素试验设计
根据已有研究[10-12]，将3 种抗冻剂配制成不同质量浓度的溶液：海藻糖1、2、3、4、5 g/100 mL，山梨糖醇0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/100 mL，茶多酚0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/100 mL。将分割好的鹅肉样品分别置于不同抗冻液中浸泡30 min，先放置于4 ℃冰箱中预冷，之后放入-18 ℃冰箱冷冻，立即测定冰点，在冻藏第2天测定解冻损失率。
1.3.3 抗冻剂正交试验设计
基于单因素试验结果，选择各抗冻剂效果最佳的3 个质量浓度，进行3因素3水平的正交试验，以冰点为主要指标，解冻损失率为次要指标，确定最优的复合抗冻剂配比。
1.3.4 鹅肉的冻融处理
参考张帆[13]的方法，将鹅肉样品放入复合抗冻剂中浸泡30 min，将浸泡好的肉块放置30 min，晾至无抗冻液滴落后，放在-40 ℃冰箱中冷冻48 h后在4 ℃冰箱中解冻24 h。取冻融1 次的样品进行理化指标测定，其余样品继续冷冻，48 h之后再次解冻，如此循环，分别制备出反复冻融3 次和5 次的样品，以未处理的新鲜肉作为对照。
1.3.5 鹅肉品质指标的测定
1.3.5.1 冰点
参考黄晓红[10]的方法，将鹅肉样品放置在4 ℃冰箱中预冷。将温度计电极置于鹅肉内部中心，放入-18 ℃冰箱内，每隔1 min记录一次温度变化。当鹅肉块内部中心温度降至0 ℃以下，出现轻微回升后再次缓慢下降时，此温度转折点被认定为鹅肉块的冰点温度。
1.3.5.2 解冻损失率
分别取冻融1、3、5 次的鹅肉样品20 g，用滤纸吸干解冻后鹅肉样品表面残留的水分后称质量。解冻损失率按式（1）计算：
式中：m0为冻结后质量/g；m1为解冻后质量/g。
1.3.5.3 汁液损失率
参照邓钰蓱等[14]的方法并进行修改，分别取冻融1、3、5 次的鹅肉样品10 g放置于带有滤纸桶的离心管中，在4 ℃下以3 500 r/min离心20 min后称质量。汁液损失率按式（2）计算：
式中：m2为离心前质量/g；m3为离心后质量/g。
1.3.5.4 感官评定
参考黄晓红[10]、董家旺[11]等的方法，略作修改。由10 名经过培训的食品专业同学进行现场感官评定，评分标准见表1。感官评定结果：一级鲜度感官评分为80～100，二级鲜度为60～80，变质肉为0～60。
表1 鹅肉感官品质评分标准
Table 1 Criteria for sensory evaluation of of goose meat
感官评分色泽气味黏度弹性21～25肌肉色泽鲜红均匀，有光泽指压后的凹陷立即恢复16～20肌肉色泽较鲜红，有光泽具有新鲜鹅肉的气味，无异味外表微干或微湿润，不黏手指压后的凹陷恢复慢11～15肌肉色泽较暗红，无光泽具有鹅肉的气味，无异味外表干燥或稍黏手，切面湿润指压后的凹陷不能完全恢复0～10肌肉色泽呈暗褐色，稍有异味，但不明显外表干燥或黏手，切面黏手无光泽有明显异味外表极度干燥或黏手，切面非常黏手指压后凹陷不能恢复，有时手指还可刺穿肉
1.3.5.5 pH值
参照GB 5009.237—2016《食品pH值的测定》进行测定。
1.3.5.6 硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值
参照周枫等[15]的方法，将5.0 g绞碎后的鹅肉样本称取至250 mL烧杯中，倒入50 mL 7.5 g/100 mL三氯乙酸溶液，用玻璃棒充分搅拌。将烧杯放置于50 ℃水浴锅中水浴加热30 min，之后进行过滤处理。使用移液管移取15 mL过滤后的液体，加入15 mL 0.02 mol/L 2-硫代巴比妥酸溶液，并充分振摇以使混合均匀。随后将烧杯放置于90 ℃水浴锅中继续加热30 min，取出室温冷却，在532 nm波长处测定溶液的吸光度。TBARS值按式（3）计算：
式中：A532 nm为样液在532 nm波长处的吸光度；m为鹅肉样品质量/g；9.24为由样品稀释和摩尔消光系数得到的常数/μg。
1.3.5.7 总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量
参照GB 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》进行测定。
1.3.5.8 肌原纤维蛋白含量
参考吴丹璇[16]的方法并略作修改，将绞碎后的鹅肉样品与磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L NaCl、1 mmol/L EGTA、2 mmol/L MgCl2、10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0，4 ℃）以1∶4（g/mL）比例混匀，匀浆（12 000 r/min、30 s）后用双层纱布过滤，滤液3 500 r/min离心20 min，弃去上清液，取沉淀重复上述操作2 次，沉淀加入4 倍体积的0.1 mol/L NaCl洗涤、离心（3 500 r/min、20 min），重复2 次，上清液即为肌原纤维蛋白溶液，采用双缩脲法测定肌原纤维蛋白质量浓度。
1.4 数据处理
所有实验最少重复3 次，结果以平均值±标准差表示，采用Excel 2016和SPSS 20软件进行数据处理分析，采用最小显著性差异检验法和Ducan法评估数据的显著性，采用Origin 2022软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 抗冻剂单因素试验结果
海藻糖通过与水分子形成氢键从而降低冰点[17]，提高保水性。如图1A所示，随海藻糖添加量的增加，冰点先下降后上升，解冻损失率先减少随后增加并再次减少。这可能是因为海藻糖添加量过高可能会促使鹅肉的细胞膜及细胞器破裂，从而导致持水性下降[18]。其中2 g/100 mL海藻糖抗冻效果最好，能有效防止汁液损失，而1 g/100 mL海藻糖冷冻保护作用较差。
图1 不同抗冻剂对鹅肉冰点和解冻损失率的影响
Fig. 1 Effect of different antifreeze agents on freezing point and thawing loss rate of goose meat
山梨糖醇的多羟基结构使其具有持水性，可以与肉制品中的水分强力结合[19]，冰晶的形成也会受到抑制，从而降低冰点。如图1B所示，随着山梨糖醇添加量的增加，鹅肉冰点和解冻损失率均呈先下降后上升的趋势，均在0.15 g/100 mL的添加量达到最低值，冰点和解冻损失率分别为-2.63 ℃和4.45%。多酚类化合物能够降低冰点，其立体结构中极性氨基酸的距离恰到好处，能够减少冰晶形成[20]。如图1C所示，随着茶多酚添加量的增加，鹅肉冰点整体呈先下降后上升的趋势，解冻损失率也呈现先下降后上升的趋势，在添加量为0.20 g/100 mL时，鹅肉冰点和解冻损失率均最低。
2.2 正交试验结果
在单因素试验的基础上，对海藻糖、山梨糖醇、茶多酚3 种抗冻剂添加量进行正交试验，正交试验因素及水平如表2所示。
表2 正交试验因素及水平
Table 2 Factors and levels used in orthogonal array design
水平A海藻糖添加量/（g/100 mL）C茶多酚添加量/（g/100 mL）1 2 0.100.15 B山梨糖醇添加量/（g/100 mL）0.150.20 3 4 0.200.25 2 3
正交试验结果见表3，各抗冻剂对冰点影响的顺序依次为海藻糖＞茶多酚＞山梨糖醇，分析各抗冻剂对冰点的影响，降低冰点的最优组合为A1B1C1。各抗冻剂对解冻损失率影响的顺序依次为茶多酚＞海藻糖＞山梨糖醇，减少解冻损失率的最优组合为A1B1C2。考虑到茶多酚的颜色影响，最终确定最优抗冻剂组合为A1B1C1，即2 g/100 mL海藻糖、0.10 g/100 mL山梨糖醇、0.15 g/100 mL茶多酚。
表3 正交试验结果
Table 3 Orthogonal array design with experimental results
项目试验号A海藻糖添加量B山梨糖醇添加量C茶多酚添加量冰点/℃解冻损失率/%1 111-2.40±0.024.20±0.03 2 122-2.16±0.033.51±0.05 3 133-2.13±0.024.83±0.04 4 212-2.20±0.014.56±0.04 5 223-1.90±0.025.44±0.06 6 231-2.06±0.024.19±0.04 7 313-2.00±0.013.93±0.06 8 321-2.10±0.014.87±0.06 9 332-1.93±0.024.32±0.06冰点/℃K1-2.23-2.20-2.19 K2-2.05-2.05-2.10 K3-2.01-2.04-2.01 R0.220.160.18解冻损失率/%K14.184.234.42 K24.734.604.13 K34.374.454.73 R0.550.370.60
2.3 复合抗冻剂对不同冻融次数下鹅肉品质的影响
2.3.1 对鹅肉持水性的影响
持水性与水溶性营养成分和风味物质的保留密切相关，对鹅肉的品质有重要影响，解冻损失率和汁液流失率可作为评价持水性的指标。如图2所示，随着冻融次数的增加，解冻损失率和汁液流失率均有所增加，这是因为在冻融循环过程中，鹅肉中水分低温下形成的冰晶体在解冻后被破坏，重复形成尺寸不断增加的冰晶体，导致肌肉发生不可逆的机械损伤，从而引发水分的流失[12]。而加入抗冻剂可以显著降低冻融引起的鹅肉解冻损失率和汁液流失率（P＜0.05），提高鹅肉持水能力。复合抗冻剂中的海藻糖和山梨糖醇富含大量羟基，吸水性强，还能促进鹅肉中的自由水向结合水转化，从而降低水分的迁移[7]。糖类可通过与水或冰的相互作用与冰晶结合，防止冻融过程中大冰晶的生成，同时抑制反复冻融导致的重新凝结形成冰晶，从而有效防止水分流失[21]。另外，由于海藻糖属于亲水胶体，能与蛋白质形成凝胶结构，促进水分的保持，从而提高产品的持水性[20]。
图2 复合抗冻剂对不同冻融次数下鹅肉持水性的影响
Fig. 2 Effect of mixed antifreeze agent on the water-holding capacity of goose meat under different freeze-thaw cycles
相同冻融处理下，*.组间差异显著（P＜0.05），**.组间差异极显著（P＜0.01）。图3同。
2.3.2 对鹅肉品质的影响
由表4可知，在冻融循环中，各组鹅肉样品的感官品质随着冻融次数增加而逐渐下降，冻融5 次后的鹅肉感官评分为62.1±1.8，仍高于最低可接受限值。添加复合抗冻剂的肉样感官评分下降较缓慢，冻融5 次后感官评分为71.1±2.4，极显著高于对照组（P＜0.01）。鹅肉经历反复冻融后容易在微生物、内源酶及氧气的作用下发生腐败变质，从而发生色泽劣变、产生异味、发黏等现象，冰晶的生长会对肌肉细胞造成机械损伤，从而导致弹性等质地特性下降。复合抗冻剂的添加可通过抑制冰晶生长、减少水分流失等来抑制色泽、弹性的劣变，其中茶多酚的抗氧化功能还能抑制由于脂质氧化导致的感官品质下降。
表4 复合抗冻剂对鹅肉感官品质的影响
Table 4 Effects of mixed antifreeze agent on sensory quality of goose meat
注：相同冻融处理下，*.组间差异显著（P＜0.05），**.组间差异极显著（P＜0.01）。
冻融次数组别色泽评分气味评分黏度评分弹性评分综合评分1对照组21.9±0.920.0±0.821.0±0.621.2±0.784.1±1.4添加复合抗冻剂23.3±0.9**22.1±0.7**23.2±1.0**24.1±0.9**92.7±2.0**3对照组18.3±1.018.1±0.717.8±0.717.0±0.871.2±1.5添加复合抗冻剂21.0±0.8**21.4±0.9**20.3±0.9**20.3±0.9**83.0±2.3**5对照组15.3±0.915.7±0.916.2±0.714.9±0.762.1±1.8添加复合抗冻剂17.5±1.0**18.3±0.9**18.1±0.8**17.2±1.0**71.1±2.4**
抗冻剂不仅影响肉制品的保水能力，还能通过抑制蛋白质冷冻变性从而影响冷冻肉制品的品质。复合抗冻剂中的海藻糖可以通过羟基基团和生物膜磷脂的头部基团形成氢键，从而吸附在生物分子表面形成一层保护膜，防止生物分子在解冻过程中受到破坏[22]。茶多酚具有抗氧化作用，还可以作为蛋白质的交联剂与蛋白质络合，从而稳定蛋白质构象，对肉及肉制品起到一定的冷冻保护作用[23]。
pH值影响肉的色泽、嫩度、风味、持水性，是评估其新鲜度和品质的一个关键参数。如图3A所示，随着冻融次数的增加，鹅肉pH值不断降低，这与徐毓谦[12]、李孟孟[24]等的研究结果一致，出现这一趋势的原因可能是冻融循环过程中由于蛋白质变性和细胞的机械损伤造成肌肉组织水分流失，导致溶质浓度增加和氢离子的释放[25-26]。添加复合抗冻剂后，鹅肉样品的pH值极显著上升（P＜0.01），这可能是因为添加抗冻剂可以在冻融过程中减少冰晶的形成，减少细胞损伤破裂造成的水分流失，从而使pH值上升。
图3 复合抗冻剂对不同冻融次数下鹅肉品质的影响
Fig. 3 Effect of mixed antifreeze agent on the quality of goose meat under different freeze-thaw cycles
TBARS值反映脂肪酸的氧化程度。如图3B所示，鹅肉的TBARS值随冻融次数的增加而逐渐增大，这是因为多次冻融循环形成的冰晶会损伤肌肉细胞，导致促氧化剂（如氧化酶、血红素铁等）的释放，从而加速脂质氧化[27]。在冻融5 次后，复合抗冻剂组鹅肉的TBARS值（0.16 mg/kg）相比未加抗冻剂组（0.58 mg/kg）下降72.41%。由于复合抗冻剂能抑制冰晶形成，并且含有抗氧化剂茶多酚，因此能够有效抑制鹅肉中脂肪的氧化。
肉制品中的TVB-N是蛋白质在微生物和酶的作用下分解产生的氨和胺类物质，是评价肉类新鲜程度的关键参数之一[28]。如图3C所示，鹅肉的TVB-N含量随着冻融次数的增加而上升，这是因为冻融循环引起的水分和营养物质释放给微生物的繁殖提供了良好的条件，肌肉蛋白质分子间或分子内巯基之间发生氧化交联、蛋白内部巯基暴露氧化[29]，鹅肉中内源酶活性也随冻融次数的增加显著增强，并且大量氨基酸被降解，脱氨基作用增强，共同导致TVB-N含量加剧积累[30]。添加复合抗冻剂后，鹅肉样品的TVB-N含量呈下降趋势。冻融5 次后未加抗冻剂组鹅肉样品的TVB-N含量（13.14 mg/100 g）相比抗冻剂组（11.55 mg/100 g）极显著降低（P＜0.01），Gaukel等[31]认为可能是因为糖类分子存在的大量羟基能与氨基酸残基形成氢键以抑制胺类等物质生成，抑制TVB-N含量增加。
肌肉中的肌原纤维蛋白对肉制品的感官品质和工艺特性具有重要影响。如图3D所示，随着冻融次数的增加，鹅肉中肌原纤维蛋白的含量不断下降，这是因为在冻融循环中，冰晶的形成和生长导致蛋白质发生冷冻变性，也可能是蛋白质与水或小分子物质发生相互作用，影响蛋白质构象，导致肌原纤维蛋白的溶解度下降[32]，食用品质降低。添加复合抗冻剂的鹅肉在冻融1 次后肌原纤维蛋白质量浓度（7.00 mg/mL）仍与新鲜肉（6.65 mg/mL）相当，在冻融5 次后添加复合抗冻剂组鹅肉的肌原纤维蛋白质量浓度（4.78 mg/mL）相比未加抗冻剂组（2.10 mg/mL）提高56.1%。这与Du Xin等[33]的研究结果一致，可能是山梨糖醇这种小分子糖类物质可以延缓溶质迁移，降低液体的离子强度，从而抑制蛋白质的不可逆聚集，导致溶解度增加。说明复合抗冻剂对蛋白的抗冻作用较好，可以延缓肌原纤维蛋白的聚集。
3 结论
本研究优化出一种复合抗冻剂，配比为2 g/100 mL海藻糖、0.1 g/100 mL山梨糖醇、0.15 g/100 mL茶多酚，使用复合抗冻剂浸渍的鹅肉解冻损失率、汁液损失率、TBARS值和TVB-N含量显著下降（P＜0.05），pH值和肌原纤维蛋白含量极显著上升（P＜0.01），对于冻融5 次的鹅肉效果依然显著，其中添加复合抗冻剂的鹅肉TBARS值相比对照组下降72.41%，肌原纤维蛋白质量浓度升高56.1%。这表明复合抗冻剂可以有效减缓冻融循环造成的水分流失、脂肪氧化和蛋白质降解。本研究采用的复合抗冻剂能够增强鹅肉在反复冻融过程中的耐冻性，保持鹅肉食用品质，延长货架期。本研究为企业在制定科学生产流程和提升冷冻鹅肉品质方面提供了一定的理论支撑，有必要对冻结和冻藏方式进行进一步的深入研究。
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