调理牛排是以牛肉为原料，添加适量调味料或辅料，经过适当加工，未经杀菌处理的冷冻产品。因其具有食用方便、附加值高和营养均衡等优点，深受消费者喜爱，具有较好的发展前景[1]。市场上，调理牛排主要以冷冻形式销售，因为冷冻不仅能够显著抑制腐败微生物快速生长，而且可以减缓生物化学反应进程[2]。然而，肉制品在冷冻过程中肌纤维（肌肉细胞）内会形成大量冰晶，致使细胞损伤，引起肉制品解冻损失严重、汁液营养损失、感官和质构劣变等问题[3]。此外，传统冷冻方式能耗大、冻结时间较长，不仅会增加成本，还浪费时间[4]。这些问题严重限制了调理牛排发展。
为减少解冻损失、保持肉制品品质，许多研究在肉制品中添加适量抗冻剂[5-6]。糖类和多元醇中含有大量羟基，因此具有吸水性强的特点，能够降低冷冻肉制品中水分迁移以减少汁液损失，是较常用的抗冻剂[7]。相较于传统冷冻方式，浸渍冻结具有冻结速率快、能耗低、冻结质量好等优点，是一种较理想的新型冷冻加工技术[8]。近年来研究发现，我国冷冻食品厂将从日本进口的浸渍式快速冷冻机投入到鱼贝类等水产品速冻中，最终实现生产规模化。还有学者研发了新型浸渍式冻结设备，即通过将食品包装后再浸渍冻结，可以用于冷冻蟹棒等即食食品。然而，浸渍式冻结过程仍然存在缺陷，如载冷剂质量下降和载冷剂溶质渗入被冻物料等现象[4]，导致浸渍式快速冻结技术至今无法得到广泛应用；并且浸渍冻结主要应用于速冻水产品和生鲜果蔬，但在调理肉制品领域的应用较单一[8-9]。
基于此，有学者对冰柜冻结、浸渍冻结和平板冻结法对调理牛排在冻藏期内品质的影响进行了研究。结果表明，经过浸渍冻结处理的调理牛排，其色泽、保水能力、质构特性等方面均优于冰柜冻结组和平板冻结组[10]。此外，针对调理牛排研制了新型功能性抗冻剂配方（海藻糖1.8%（m/m）、聚葡萄糖3.3%（m/m）、黄原胶0.5%（m/m））[11]。为更好地保持调理牛排品质，本研究通过抗冻剂和浸渍冻结联合技术对调理牛排进行冻藏处理，研究该冷冻方式对调理牛排品质的影响，旨在为工业研发调理牛排冻藏新技术提供理论支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牛后臀肉（乌拉圭牛，2 岁龄，雄性，n＝5）购自南京苏果超市，置于冰盒中40 min内运回实验室。
海藻糖、真空包装袋（聚乙烯塑料袋） 上海万利达食化有限公司；食用盐、白砂糖、异抗坏血酸钠雨润集团工厂；氯化钾、碳酸氢钠和碳酸钠等试剂 国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
VT50真空滚揉机 瑞士Suhner AG公司；DZ-400/2S真空包装机 山东小康机械有限公司；CR21G Ⅲ高速冷冻离心机 日本Hitachi Koki公司；C-LM3B数显式肌肉嫩度仪 东北农业大学食品学院；TA.XT Plus质构仪 美国FTC公司；飞纳台式扫描电子显微镜复纳科学仪器（上海）有限公司；HH-6数显恒温水浴锅 江苏国华电器有限公司；DW-60W308超低温保存箱 浙江捷盛低温设备有限公司；U-5100比率光束分光光度计 长沙科美分析仪器有限公司；CR-400色差计日本柯尼卡美能达公司。
1.3 方法
1.3.1 腌制液配制
参考谢勇[12]的方法，并稍作修改。腌制液配方（以样品质量分数计）：食盐2%、白砂糖0.4%、异抗坏血酸钠0.12%、碳酸氢钠0.6%、碳酸钠0.4%和冰水20%。
1.3.2 调理牛排制作工艺流程
参考谢勇[12]的流程，稍作改进。将后臀肉进行修整，剔除脂肪、肌膜、结缔组织等，沿肌纤维方向将肉分割成质量（100±5）g、体积8 cm×6 cm×2 cm的肉块进行腌制，共48 块。将分割后的原料肉和腌制液添加到真空滚揉机内，腌制2 h。其中滚揉过程中每20 min间歇10 min，设置参数为0～4 ℃、真空度小于-0.7 bar、转速20 r/min。得到调理牛排后用于后续处理。
1.3.3 调理牛排冻藏处理
将腌制完成后的牛排用聚乙烯袋单独包装，调理牛排随机分成4 组，每组12 块，冻藏90 d。每30 d测定相应指标，每个时间点检测3 块。具体处理如下：1）空气冻结组（对照组）：牛排真空包装后置于-30 ℃冰箱冻藏；2）抗冻剂组：将抗冻剂（海藻糖1.8%、聚葡萄糖3.3%、黄原胶0.5%，以牛排质量计）滚揉添加入牛排中，真空包装后置于-30 ℃冰箱冻藏；3）浸渍冻结组：牛排真空包装后置于冻结液（含28%乙醇、10%甜菜碱、8%丙二醇、4%氯化钠，m/m）中，于-30 ℃浸渍12 h后，置于-30 ℃冰箱冻藏；4）抗冻剂联合浸渍冻结组：将上述抗冻剂滚揉添加入牛排中，真空包装后放入上述冻结液中，于-30 ℃浸渍速冻12 h，后置于-30 ℃冰箱冻藏。
1.3.4 调理牛排指标测定
每组调理牛排分别在贮藏0、30、60、90 d时取出3 块样品，置于4 ℃冰箱进行解冻。待样品中心温度达到2 ℃左右时，取出测定以下实验指标[13]。
1.3.4.1 剪切力和质构特性测定
剪切力测定参照张萌等[14]的方法，并稍作修改。将肉块放入蒸煮袋后，插入热电偶温度计，当肉样内部中心温度达到75 ℃后，沿肌纤维方向切成1 cm×1 cm×2 cm的肉样，使用数显示肌肉嫩度仪测定剪切力。剪切力测定时，沿样品肌纤维垂直方向切割样品，测前、测后速率均为2.0 mm/s，测试速率为1.0 mm/s，下压距离为0.5 cm。每组样品做5 个平行实验，结果取平均值。
质构测定参照谢勇[12]的方法，稍作修改。采用全质构特性分析模式，采用平底柱状探头P50，将样品放置于台面，探头以1 mm/s的速率向下移动，将样品压缩2 次（间隔5 s），每次压缩至原始厚度的50%，触发力5 g、测试速率和返回速率均为5 mm/s。每组样品做5 个平行实验。
1.3.4.2 色泽测定
参照Wang Ying等[3]的方法。首先对样品进行处理，调理牛排解冻后，用滤纸吸取表面水分。色差计测定前用白板进行校准，选用D65光源（10°）、测量区域8 mm进行测量，平行测定5 个测定点。测定结果用亮度值（L*）、红度值（a*）和黄度值（b*）表示。
1.3.4.3 解冻损失率测定
取冷冻牛排，称质量。待解冻后，使用滤纸吸取表面水分，并称质量。调理牛排解冻损失率按式（1）计算。
1.3.4.4 汁液损失率测定
参照Stika等[15]描述的方法。取（2.0±0.2）g样品于离心管（带有滤纸）中，称肉样和离心管总质量；离心（4 ℃、500 r/min）10 min后称肉样和离心管总质量。调理牛排汁液损失率按式（2）计算。
1.3.4.5 蒸煮损失率测定
取样品（5.0±0.5）g，解冻后的样品用滤纸吸取表面水分，置于烧杯中，称质量；80 ℃水浴加热至肉样中心温度达到75 ℃取出，冷却至室温后称其质量。调理牛排蒸煮损失率按式（3）计算。
1.3.4.6 硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值测定
参考Faustman等[16]的方法并改进。取10 g调理牛排样品切碎于烧杯中，向烧杯中加入20 mL蒸馏水（被测样品），向不含牛排样品的烧杯中加入1 mL蒸馏水作为空白样品。用均质机高速均质（30 s、10 000 r/min）后，向被测样品中加入25 mL体积分数25%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，空白样品中加入1 mL TCA溶液，然后将被测样品与空白样品离心（4 ℃、3 000×g、20 min），用滤纸过滤后取2 mL上清液，向其中加入2 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液，在沸水浴中加热20 min，再流水冷却5 min，最后于532 nm波长处测定样品吸光度。TBARS值按式（4）计算。
1.3.4.7 调理牛排微观结构观察
参照谢勇[12]的方法进行操作，稍作修改。取贮藏30 d的样品，切成1 mm×1 mm×1 mm大小，置于固定液（含体积分数2.5%戊二醛和1.0 g/100 mL四氧化锇，pH 7.4）中固定2 h。使用磷酸盐缓冲液漂洗3 次（每次15 min）；再依次使用体积分数30%、50%、70%、80%、90%乙醇溶液进行梯度洗脱（每次15 min）；最后，使用不同体积比（分别为1∶3、1∶1、3∶1）叔丁醇-乙醇依次漂洗样品，每次漂洗10 min。将脱水后样品置于通风橱中脱醇，然后真空冷冻干燥48 h。取出干燥样品后喷金镀膜，随后使用扫描电子显微镜观察，放大倍数500 倍。
1.4 数据处理
数据采用SPSS软件处理，对数据进行单因素方差分析和Duncan’s检验。Origin 8.0软件作图。
2 结果与分析
2.1 不同冷冻处理对调理牛排质构特性和剪切力的影响
肉制品的质构特性直接关系到肉质嫩度及其他食用品质，是评价肉制品的关键指标。由图1A可知，4 种冷冻方式处理的调理牛排硬度在冻藏90 d内均明显下降。这可能与调理牛排制作过程中的滚揉、腌制工艺相关，滚揉可以有效提高肉制品嫩度，而腌制用的盐类则可保持肉中水分，降低其硬度[17]。在冻藏期内，抗冻剂组、浸渍冻结组和抗冻剂联合浸渍冻结组调理牛排硬度明显高于对照组，抗冻剂中含有海藻糖等多种糖类，能够促使肉中形成均匀小冰晶，减小肌肉内部水分损失[10]。浸渍液具有较高冻结速率，产生冰晶较小，有助于降低冷冻对调理牛排组织的破坏[3]。此外，由图1B可知，4 组调理牛排弹性均随着贮藏时间延长而下降，这是由于调理牛排经过冻结处理后，形成的冰晶破坏了肌原纤维结构完整性，导致弹性降低[18]。
图1 不同冷冻处理对调理牛排质构特性和剪切力的影响
Fig.1 Effects of different freezing treatments on texture characteristics and shear force of prepared beef steaks
A.硬度；B.弹性；C.剪切力。
嫩度是评价肉制品的重要指标[19]。嫩度增加与冷冻贮藏时间紧密相关，剪切力越小，嫩度越高，肉制品嫩度将随冷冻和解冻处理而增加[12]。由图1C可知，4 种冷冻条件下，调理牛排的剪切力均随冻藏时间延长呈先升高后下降的趋势。原因是冻藏过程中产生的冰晶会影响肌纤维延展性及可拉伸性，降低肌肉可塑性；此外，解冻后汁液损失加大，导致肌肉纤维水分含量减少，因此，需要更大的剪切力来切断肌肉纤维，从而导致剪切力增加[20]。随着冻藏时间延长，冰晶逐渐增大，促使肌原纤维结构损坏，无法维持完整性，造成剪切力下降。空气冻结组调理牛排的剪切力在冻藏60、90 d时明显高于其他3 组，表明抗冻剂、浸渍冻结或二者联合处理均能明显提高调理牛排在冻藏期的嫩度。原因是抗冻剂含有多糖，因此含有大量羟基，吸水性较强，能够降低肉中水分迁移以减少汁液损失[7]；浸渍冻结速率快、冻结质量好、形成的冰晶较小，可以最小化肌肉内部水分损失率，并且对肌肉结构造成的机械性损伤较小[12]。
2.2 不同冷冻处理对调理牛排色泽的影响
肉色能够直接影响消费者购买欲。由图2可知，4 个处理组调理牛排L*与a*均呈逐渐降低趋势，而b*逐渐上升。原因是肉色在贮藏过程中逐渐变暗、发黄。Stika等[15]指出，冻藏期间牛排a*下降是因为肌红蛋白、氧合肌红蛋白的氧化反应以及高铁肌红蛋白还原酶活力均会被低温抑制，高铁肌红蛋白积累，感官上表现为肉制品a*下降而褐变。调理牛排b*上升可能与蛋白质降解和脂肪氧化有关。此外，冻藏60、90 d时，调理牛排经过抗冻剂联合浸渍冻结处理后，其L*明显高于其他3 组。冻藏60 d，抗冻剂联合浸渍冻结组调理牛排的a*明显大于其他3 组。原因可能是抗冻剂中糖类物质与浸渍冷冻协同作用抑制蛋白质氧化，从而达到护色作用[20]。
图2 不同冷冻处理对调理牛排色泽的影响
Fig.2 Effect of different freezing treatments on color of prepared beef steaks
2.3 不同冷冻处理对调理牛排保水性的影响
由图3可知，4 组调理牛排在冻藏期的解冻损失率、汁液损失率和蒸煮损失率均呈上升趋势。这是由于在冻藏过程中，调理牛排肌纤维（肌肉细胞）中形成的冰晶使细胞膜损伤，导致细胞外液和部分内液流出；此外，冷冻使蛋白质发生变性，其保水能力下降，水分不能与蛋白质分子重新结合，最终迁移出来[21-22]。细胞中冰晶体积也会随着冻藏时间延长而变大，长时间冻藏造成肉制品中冰晶约占总水分含量的90%～95%，使肉制品可塑性减小，造成解冻损失、蒸煮损失、汁液损失等增大[23-25]。与其他3 组相比，抗冻剂联合浸渍冻结组调理牛排的解冻损失率、汁液损失率和蒸煮损失率均明显降低，这可能是因为调理牛排经过浸渍冻结联合抗冻剂处理时冻结速率较快，肌肉组织中形成的冰晶较小、数量较少，且蛋白质变性程度较低，保水能力好[26]。
图3 不同冷冻处理对调理牛排保水性的影响
Fig.3 Effect of different freezing treatments on water retention capacity of prepared beef steaks
2.4 不同冷冻处理对调理牛排TBARS值的影响
由图4可知，随着冻藏时间延长，4 组调理牛排TBARS值均增加。这是由于调理牛排贮藏过程中肌肉组织中游离脂肪酸逐渐增多，同时被缓慢氧化成醛、酮、酸等小分子物质，促使TBARS值不断上升[27-28]，因此常用TBARS值判断脂肪氧化程度。空气冻结组调理牛排的TBARS值明显高于其他3 组，说明直接冷冻能够明显促使调理牛排TBARS值增加。与其他3 组相比，抗冻剂联合浸渍冻结组的TBARS值最小，说明联合处理能够减缓调理牛排肌肉组织氧化，有利于延长调理牛排贮藏时间。
图4 不同冷冻处理对调理牛排TBARS值的影响
Fig.4 Effect of different freezing treatments on TBARS value of prepared beef steaks
2.5 不同冷冻处理对调理牛排微观结构的影响
由图5可知，与其他处理组相比，抗冻剂联合浸渍冻结处理后的调理牛排组织结构较紧密，肌纤维排列整齐。这是因为冷冻促使肌肉中冰晶生长，冰晶的产生导致调理牛排组织结构松散、间隙较大[3]。而抗冻剂联合浸渍冻结组中不仅抗冻剂能溶解冰晶、减缓冰晶生长，而且浸渍冻结时冻结速率较快，使冰晶形成较小、分布均匀。因此，2 种抗冻技术很大程度上减小了冻结对调理牛排组织细胞的损伤[29-30]。
图5 调理牛排冻藏30 d的微观结构
Fig.5 Microstructure of prepared beef steaks frozen for 30 days
A.空气冻结组；B.抗冻剂组；C.浸渍冻结组；D.抗冻剂联合浸渍冻结组。
3 结 论
本研究分析抗冻剂与浸渍冻结联合处理对调理牛排冻藏品质的影响。结果表明，与空气冻结、抗冻剂、浸渍冻结方式相比，该联合技术能够减少调理牛排在冻藏过程中的解冻损失率、汁液损失率、蒸煮损失率和TBARS值，还能促使调理牛排组织结构紧密以保持较好的保水性，而且可以保持肉色稳定性。该联合技术能够缓解各技术局限性，为工业上调理牛排冻藏技术的创新提供支持。
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