目前,我国是鸭肉生产、消费第一大国,产量占全球一半以上[1]。研究发现,鸭肉中含有丰富的维生素、矿物质、必需脂肪酸等营养元素,具有极高的营养价值[2]。然而我国鸭肉深加工行业起步较晚,相关企业数量少,且多数规模较小,存在加工工艺不完善、产品种类单一等问题[3]。因此,有必要开发新型鸭肉制品,并优化加工工艺,以满足更多消费者对鸭肉制品种类及风味的需求。鸭肉脯作为一种以鸭肉为主要原料,经腌制、晾干、熟化等步骤制成的肉制品,以其独特的口感和风味深受消费者喜爱[4],因此,对其进行研究可为鸭肉制品的创新与生产提供重要参考。
乳酸菌发酵是一种传统的食品加工技术,将其应用于鸭肉脯加工可以丰富新型鸭肉制品种类,不仅可以解决传统鸭肉脯质地较硬、口感不佳、营养价值较低等问题[5],还可以同时赋予产品良好的风味、色泽及较高营养价值[6]。嗜酸乳杆菌是革兰氏阳性菌,可以发酵碳水化合物产生乳酸,是一种常见的益生菌[7-8],其具有调节肠道菌群、增强免疫力等功效[9-10]。已有研究表明,嗜酸乳杆菌可以用于发酵肉制品,通过分解蛋白质和脂肪提高游离氨基酸和脂肪酸含量,从而改善肉制品的质构及风味[11-13]。然而,将嗜酸乳杆菌应用于鸭肉脯生产仍面临发酵工艺不明确、产品品质难控制等技术挑战。因此,本研究选用嗜酸乳杆菌为发酵菌,对鸭肉脯加工工艺进行优化,并对优化后的发酵鸭肉脯进行品质分析,以期为发酵鸭肉脯的工业化生产提供理论依据。
鸭肉 郑州市丹尼斯超市;嗜酸乳杆菌NCFM郑州科技学院微生物实验室;MRS液体培养基 上海阿拉丁生物科技有限公司。
戊二醛、乙醇、氢氧化钠、氯化钠(均为分析纯)山东品高化学试剂有限公司。
HVE-50高压灭菌锅 上海纤检仪器有限公司;HWS-250P恒温恒湿培养箱 广东省医疗器械厂;PHS-3 pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;H1850R高速冷冻离心机、CT3质构仪 美国博腾仪器有限公司;LSM710共聚焦激光扫描显微镜 上海Zeiss光学仪器有限公司;722N分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;6890N-G5795B气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)仪 美国Agilent公司。
1.3.1 发酵剂制备
参考柴利等[14]的方法,并稍作修改。在MRS液体培养基中培养嗜酸乳杆菌(37 ℃、18 h),经2 次活化后,菌液离心(6 000 r/min、4 ℃、10 min)后去上清液,沉淀先使用无菌生理盐水洗涤3 次,然后使用无菌超纯水洗涤2 次,备用。
1.3.2 鸭肉脯制作
鸭肉脯配方:以鸭肉质量为基准添加玉米淀粉4%、食盐2%、料酒2.5%、白糖3%、卡拉胶0.6%、生姜粉0.5%、鸡精0.5%、胡椒粉0.05%、五香粉0.05%、红曲红0.03%。
工艺流程参考文献[15]方法:原料肉清洗→整理、修割→绞碎→配料→腌制→接种→发酵→摊筛成片→低温脱水→高温熟化→冷却→切片→真空包装→成品。
1.3.3 单因素试验
按照发酵鸭肉脯的制作工艺流程,通过改变发酵时间、发酵温度及嗜酸乳杆菌接种量,以感官评分和pH值为响应值,确定各因素对发酵鸭肉脯品质的影响[16],发酵温度分别为15、20、25、30、35 ℃,发酵时间分别为20、22、24、26、28 h,嗜酸乳杆菌接种量分别为105、106、107、108、109 CFU/g。
1.3.4 响应面优化试验
依据单因素试验结果,以发酵鸭肉脯感官评分和pH值为响应值,选择发酵温度、发酵时间、嗜酸乳杆菌接种量3 个因素,进行3因素3水平的响应面试验,表1为因素水平及编码,采用Design Expert 13软件进行数据分析,确定最优发酵工艺参数。
表1 因素水平及编码
Table 1 Code and level of independent variables
因素水平-101 A发酵温度/℃202530 B发酵时间/h222426 C嗜酸乳杆菌接种量/(CFU/g)106107108
1.3.5 鸭肉脯感官评价
参考吕伟等[17]的方法,并根据鸭肉脯特性进行调整。感官评分采用百分制,成立10 人评价小组,要求小组成员均经过专业感官评价训练,并通过相应考核。各评价标准权重为:色泽20%、组织状态30%、香气20%、口感30%。评分标准如表2所示。
表2 发酵鸭肉脯感官评分标准
Table 2 Criteria for sensory evaluation of fermented duck jerky
项目评分标准得分香气(20%)香味浓郁、有发酵肉特有风味16~20香味一般、无异味13~15香味较差、基本无发酵风味10~12无香味、有明显酸败味<10口感(30%)咸淡适中、带有柔和的发酵酸味、硬度适中26~30咸淡适中、带有少许发酵酸味、硬度较大21~25咸味较重、发酵酸味较大、硬度大16~20咸味重、酸味突出、硬度大、难以咀嚼<15色泽(20%)呈酱红色、油润有光泽16~20呈棕红色、光泽一般13~15呈暗褐色、光泽暗淡10~12呈酱黑色,无光泽度<10组织状态(30%)纤维细腻、质地均匀、富有弹性26~30偶尔可见纤维状颗粒、质地基本均匀、有弹性21~25纤维状颗粒分布较多、质地不均匀、弹性较小16~20纤维粗糙、质地不均匀、缺乏弹性<15
1.3.6 鸭肉脯pH值测定
参考柴利[18]的方法,稍作修改。称取2 g鸭肉脯,剪碎成小块后加入30 mL 0.1 mol/L NaCl溶液,以5 000 r/min均质1 min,过滤后取上清液,校准pH计后进行测定,待读数稳定后开始计数,进行3 次平行实验,并求平均值。
1.3.7 鸭肉脯质构特性测定
参考Wang Yueqi等[19]的方法,并稍作修改。将鸭肉脯切成边长1 cm的正方体,使用P50A探头,测定参数为:50 kg力量感应元;压缩率50%;测前、测中、测后速率分别为2、5、2 mm/s。测定指标为硬度、弹性、内聚性、咀嚼性。
1.3.8 鸭肉脯微观结构观察
参照Franco等[20]的方法,使用扫描电子显微镜观察发酵前后微观结构变化,并依据样品特性作一定修改。取5 g鸭肉脯成品,用体积分数3%戊二醛溶液固定,然后使用0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗,用乙醇脱水并置于-80 ℃冰箱预冻,样品稳定之后,在-80 ℃下进行真空冷冻干燥,最后使用离子溅射仪镀膜,分别观察1 000、5 000 倍下发酵组与未发酵组鸭肉脯的微观结构。
1.3.9 鸭肉脯挥发性风味物质测定
参考Cai Yujuan等[21]的方法,并进行修改,采用顶空-GC-MS对鸭肉脯风味物质进行测定与分析。将5 g样品置于20 mL顶空瓶中,加入5 mL饱和氯化钠溶液后密封。于60 ℃平衡10 min、50 ℃吸附30 min、250 ℃解吸5 min。
GC条件:使用HP-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 µm);载气为He(纯度99.999%),流速1.0 mL/min;不分流;进样温度设置为250 ℃,升温程序:初始温度为35 ℃并保温2 min,以2 ℃/min升温至45 ℃,保持2 min,以3 ℃/min升温至120 ℃,保持2 min,最后以6 ℃/min升温至230 ℃,保温5 min。
MS条件:选用电子电离离子源;温度230 ℃;四极杆温度150 ℃;电子能量70 eV;质量扫描范围30~400 m/z。根据相对保留指数(retention index,RI)与WILEY138数据库比对结果对风味物质进行定性。
采用Design-Expert 13、SPSS 26和Excel 2016软件对数据进行整理和计算,利用Origin 2021软件进行绘图,所有实验进行3 次平行测定,测定结果用平均值±标准差表示。
肉制品在发酵过程中pH值降低对产品品质有非常重要的影响,有助于肉制品凝胶结构及发酵风味形成,同时,较低pH值还能够抑制腐败和致病微生物生长和繁殖,提升产品食用安全性[22]。由图1可知,随着发酵温度升高、发酵时间延长和嗜酸乳杆菌接种量增加,鸭肉脯感官评分均呈现先上升后下降的趋势,pH值呈现不同变化趋势,具体如下:
图1 不同发酵条件对鸭肉脯感官评分和pH值的影响
Fig.1 Effect of fermentation conditions on sensory score and pH value of duck jerky
小写字母不同表示相同指标组间差异显著(P<0.05)。
由图1a可知,当发酵温度为25 ℃时,鸭肉脯感官评分显著大于其他组(P<0.05),其原因为当温度较低时,乳酸菌生长缓慢,乳酸生成量不足,无法产生发酵风味,而发酵温度过高又会导致酸味过重。pH值随发酵温度的升高呈现先下降后稍有上升的趋势,且当发酵温度为30、35 ℃时无显著差异(P>0.05),原因是由于在发酵前期,随着温度升高,嗜酸乳杆菌代谢能力不断增强,通过分解碳水化合物产生大量以乳酸为代表的酸类物质[23],导致pH值降低;而随着发酵温度进一步升高,肉中蛋白质被不断降解生成多肽、胺等呈碱性的物质,使pH值稍有回升。
由图1b可知,当发酵时间为24 h时感官评分最高,且显著高于其他组(P<0.05)。发酵时间过短,发酵风味无法充分显现;而时间过长,鸭肉脯质地软烂,失去应有的咀嚼性和弹性,使鸭肉脯感官评分降低。pH值随发酵时间延长呈现先快速下降而后趋于平缓的趋势,分析原因可能是由于前期营养成分及氧气等生长条件适宜,乳酸菌得以迅速繁殖,并通过代谢产生大量酸类物质,使pH值迅速下降,而后随着养分及氧气消耗,乳酸菌繁殖速率减慢,pH值下降速率随之减慢[24]。
由图1c可知,鸭肉脯感官评分随嗜酸乳杆菌接种量增加呈现先上升后下降的趋势,当接种量为107 CFU/g时感官评分最高,且显著大于其他组(P<0.05),随着接种量继续增大,感官评分下降,原因可能是由于大量乳酸菌会消耗基质中糖类和蛋白质,影响发酵风味及口感。而随着接种量增加,鸭肉脯pH值呈现不断下降趋势,原因是由于嗜酸乳杆菌数量增多,代谢产酸随之增多所致。pH值过低会导致蛋白质变性、凝胶质构过硬,影响发酵鸭肉脯口感。
结合上述单因素试验的显著性分析结果,选择发酵温度、发酵时间、嗜酸乳杆菌接种量3 个因素进行响应面试验。
Box-Behnken响应面试验结果如表3所示。将关于感官评分及pH值的回归方程进行方差分析,由表4可知,感官评分回归模型极显著(P<0.01),模型失拟项不显著,且相关系数R2=0.993 4、R2Adj=0.990 3,说明该模型与试验的拟合程度较高[25-26],变异系数体现了试验的准确性,且其值越低,试验可靠性越高[27],本研究中变异系数为1.38,数值较小,因此表明该模型能够很好地对发酵鸭肉脯的感官评分进行预测分析。由表5可知,发酵鸭肉脯pH值的回归模型极显著(P<0.01),失拟项不显著,表明该响应面模型与pH值的实际值具有较高拟合度,且回归模型的R2=0.981 8、R2Adj=0.958 4,变异系数为2.50,因此表明该模型能够很好地对发酵鸭肉脯的pH值进行预测分析。
表3 Box-Behnken设计方案及结果
Table 3 Program and experimental results of Box-Behnken design
试验号A发酵温度B发酵时间C嗜酸乳杆菌接种量感官评分pH 1-1-10775.07 2 1-10693.82 3-110754.59 4 1 1 0 714.74 5-10-1774.43 6 1 0-1753.06 7-101785.81 8 1 0 1 695.76 0-1-1773.85 1001-1743.97 110-11735.41 12011755.91 13000864.31 14000854.60 15000854.54 16000844.64 17000864.70 9
表4 感官评分回归方程方差分析
Table 4 Analysis of variance of regression model for sensory evaluation of duck jerky
注:*.显著(P<0.05);**.极显著(P<0.01)。表5同。
方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型534.57959.40117.12<0.000 1**A66.12166.12130.39<0.000 1**B0.1310.130.250.634 8 C8.0018.0015.770.005 4**AB4.0014.007.890.026 2*AC12.25112.2524.150.001 7**BC6.2516.2512.320.009 9**A2156.671156.67308.93<0.000 1**B2156.671156.67308.93<0.000 1**C279.67179.67157.10<0.000 1**残差3.5570.51失拟项0.7530.250.360.788 0误差2.8040.70变异系数1.3816 R2=0.993 4 R2 Adj=0.990 3
表5 pH值回归方程方差分析
Table 5 Analysis of variance of regression model for pH value of duck jerky
方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型2.460090.273 241.93<0.000 1**A0.208 010.208 031.930.000 8**B0.140 410.140 421.560.0024**C0.001 510.001 50.230.0446*AB0.027 210.027 24.180.040 2*AC0.000 110.000 1 0.02<0.000 1**BC0.030 610.030 64.70<0.000 1**A21.090011.090 0167.44<0.000 1**B20.730 410.730 4112.11<0.000 1**C20.064 710.064 79.940.016 1*残差0.045 670.006 5失拟项0.036 130.012 05.080.075 2误差0.009 540.002 4变异系数2.5016 R2=0.981 8 R2 Adj=0.958 4
将表3数据进行多元拟合,得到鸭肉脯感官评分及pH值与发酵温度(A)、发酵时间(B)和嗜酸乳杆菌接种量(C)的回归方程如下:感官评分=85.20-2.87A-0.13B-1.00C+1.00AB-1.75AC+1.25BC-6.10A2-6.10B2-4.35C2;pH值=4.56-0.16A-0.13B+0.01C-0.08AB+0.01AC-0.09BC+0.51A2+0.42B2+0.12C2。
在对发酵鸭肉脯感官评分的影响中,由F值分析结果可知:A>C>B,因此,在规定的各因素水平范围内,对鸭肉脯感官评分的影响从大到小依次为发酵温度>嗜酸乳杆菌接种量>发酵时间。
在对发酵鸭肉脯pH值的影响中,由F值可知,3 个因素对鸭肉脯pH值的影响大小为发酵温度>发酵时间>嗜酸乳杆菌接种量。
响应面可以较为直观地看出各因素之间的交互作用。由图2可知,当固定1 个因素时,随着另2 个因素数值的增大,鸭肉脯感官评分均呈现先上升后下降的趋势,3 个响应面图均呈现凸型,最高点表示感官评分达到最大值[28]。图中3 种交互作用的等高线图形状均趋近于椭圆形,说明交互作用显著[29],与方差分析结果相一致。
图2 各因素交互作用对鸭肉脯感官评分影响的响应面图和等高线图
Fig.2 Response surface and contour plots showing individual and interactive effect of variables on sensory score of fermented duck jerky
由图3可知,当固定1 个因素时,随着另2 个因素数值增大,鸭肉脯pH值显示先下降后上升的趋势。响应面图均呈现凹型,最低点表示pH值达到最小值。AB、AC、BC交互作用等高线图形状均趋近于椭圆形,说明3 个因素两两之间交互作用影响显著,与方差分析结果相一致。
图3 各因素交互作用对鸭肉脯pH值影响的响应面图和等高线图
Fig.3 Response surface and contour plots showing individual and interactive effect of variables on pH value of duck jerky
对响应面试验结果进行拟合,得到发酵鸭肉脯的最佳加工工艺参数为:发酵温度25.31 ℃、发酵时间24.04 h、接种量106.87 CFU/g,此条件下感官评分为86.54、pH值为4.53,考虑到实际工艺操作的可行性,将参数调整为:发酵温度25 ℃、发酵时间24 h、接种量107 CFU/g。根据该工艺参数重复3 次实验,测得发酵鸭肉脯感官评分为86.21±0.74,pH值为4.59±0.11,与理论结果接近,因此该响应面模型可信度较高,具有实用价值。
质构是测定肉制品品质的重要指标之一[30],包括硬度、弹性、内聚性、咀嚼性等。由表6可知,经嗜酸乳杆菌发酵的鸭肉脯与未发酵组相比硬度和咀嚼性显著降低(P<0.05),同时,发酵后的鸭肉脯弹性和内聚性稍有下降,分析原因可能是由于在发酵过程中乳酸菌产生的蛋白酶对肌球蛋白、肌动蛋白等肌原纤维蛋白产生了分解作用[31-32],使鸭肉脯硬度降低、嫩度增强,易于咀嚼。
表6 鸭肉脯质构测定结果
Table 6 Texture characteristics of duck jerky
注:同列小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。
组别硬度/N弹性内聚性咀嚼性/N未发酵组89.31±0.20a0.28±0.05a0.24±0.03a5.22±0.17a发酵组74.40±0.51b0.27±0.02a0.22±0.06a5.01±0.28b
由图4a、c可知,未发酵鸭肉脯表面基本无裂缝和孔洞、结构平整且组织连接紧密;由图4b、d可知,发酵后的鸭肉脯表面有明显裂缝、孔洞数量较多、组织结构稍有疏松。分析原因,可能是由于鸭肉脯经发酵之后乳酸菌分泌的蛋白酶导致肌原纤维中蛋白质发生水解,组织结构遭到破坏[33],同时,乳酸菌发酵产酸能激发肉中内源蛋白酶活性,加速肌原纤维蛋白和肌浆蛋白分解,降低鸭肉脯硬度,改善产品口感。该变化与质构检测中发酵鸭肉脯硬度和咀嚼性显著降低的结果一致。
图4 鸭肉脯微观结构图
Fig.4 Microstructure of duck jerky
a、c.未发酵组;b、d.发酵组。
由表7可知,发酵组鸭肉脯检出风味物质共38 种,其中醇类5 种、酯类15 种、酸类8 种、醛类4 种、碳氢化合物6 种,未发酵组检出风味物质37 种,未检出棕榈酸。在这些化合物中,醇类、酯类和酸类化合物是最常见的挥发性物质。其中,醇类化合物是酯类化合物的前体物质,主要由微生物代谢糖类产生,可赋予肉脯一定醇香味,对风味起修饰作用[34-35]。发酵组鸭肉脯中检出的醇类物质中乙醇、2,3-丁二醇、2-甲基-1-丁醇含量均显著高于未发酵组(P<0.05),表明发酵有利于改善鸭肉脯风味。酯类物质由醇类和酸类通过酯化形成,具有芳香风味,含有短链脂肪酸的酯类物质大多带有水果香气,含有长链脂肪酸的酯类物质大多带有较淡的油脂香[36]。除异戊酸乙酯、棕榈酸甲酯、1,2-丙二醇二甲酸酯,发酵组的其他酯类物质相对含量均显著高于未发酵组(P<0.05),与Zhao Ruixiang等[37]的研究结果一致。酸类物质对酯类物质的生成有促进作用,其中乙酸和丁酸分别赋予鸭肉脯酸醋味和奶香风味,发酵组中乙酸和丁酸相对含量显著高于未发酵组(P<0.05),说明乳酸菌发酵对鸭肉脯风味的形成具有一定贡献。醛类物质主要由脂质氧化降解产生,也可能来自Strecker降解反应[38-39]。其中庚醛、己醛是常见的醛类风味化合物,可使肉脯呈现独特的油脂香[5],对甲氧基苯甲醛能够增强肉脯的茴香味[40-41]。发酵组鸭肉脯中上述3 种醛类化合物的相对含量均高于未发酵组。综上,嗜酸乳杆菌发酵可增加鸭肉脯的风味组成成分,且赋予鸭肉脯更加浓郁的香气。
表7 鸭肉脯挥发性风味物质测定结果
Table 7 Relative contents of volatile flavor substances in duck jerky
注:同行小写字母不同表示差异显著(P<0.05);-.未检出。
挥发性物质RI相对含量/%未发酵组发酵组醇类乙醇4627.02±0.12b9.94±0.17a 2,3-丁二醇7574.04±0.08b6.04±0.14a 2-甲基-1-丁醇6970.55±0.13b1.04±0.14a 2-甲基-1-丙醇7110.35±0.03a0.36±0.15a苯乙醇1 1360.33±0.14a0.36±0.02a酯类乙酸乙酯8860.04±0.08b0.18±0.01a 4-羟基丁酸甲酯5740.05±0.13b0.13±0.01a 2-甲基丁酸乙酯7210.16±0.01b0.39±0.03a异戊酸乙酯1 0560.05±0.00a0.33±0.14a己酸甲酯6860.13±0.00b0.27±0.05 a 2,6,10-三甲基三烷酯1 6040.02±0.02b0.06±0.02a辛酸乙酯1 5780.19±0.03b0.27±0.19a苯丙酸甲酯1 2410.02±0.05b0.07±0.00a癸酸甲酯1 2050.90±0.10b1.09±0.18a 3-苯丙酸乙酯1 3240.24±0.04b6.98±0.15a癸酸乙酯1 5790.07±0.01b3.75±0.09a棕榈酸甲酯1 8630.02±0.11a0.03±0.06a 1,2-丙二醇二甲酸酯7680.02±0.19a0.08±0.06a苯乙酸甲酯1 1540.04±0.01b0.08±0.17a 8-甲基癸酸甲酯1 2510.02±0.02b0.14±0.16a酸类十四酸1 4630.12±0.05b0.58±0.15a十五烷酸1 5210.02±0.02a0.03±0.03a乙酸5670.15±0.00b0.27±0.02a棕榈酸1 954-0.09±0.01十七烷酸1 7610.06±0.03a0.06±0.04a丁酸7780.05±0.00b0.26±0.04a Z-8-甲基-9-十四烯酸1 5820.08±0.27a0.03±0.01a 2-甲基庚酸8690.06±0.02a0.13±0.01a醛类己醛4070.12±0.05a0.18±0.63a庚醛1 1700.32±0.00a0.52±0.24a辛醛1 2080.89±0.07a0.84±0.24a对甲氧基苯甲醛8971.19±0.11a1.36±0.03a右旋萜二烯1 0230.56±0.07a0.58±0.04a α-蒎烯1 3740.41±0.02a0.38±0.05a 1-石竹烯1 4090.26±0.12a0.23±0.15a β-水芹烯1 1320.09±0.11a0.06±0.11a α-月桂烯1 1580.06±0.14a0.05±0.02a雪松烯1 2150.39±0.11a0.35±0.13a碳氢化合物
嗜酸乳杆菌发酵鸭肉脯作为一种新型鸭肉制品,具有很好的开发与利用前景。本研究以鸭肉脯感官评分和pH值为响应值,选用Box-Behnken响应面法,从发酵温度、发酵时间、嗜酸乳杆菌接种量3 个方面对发酵鸭肉脯制作工艺进行优化,综合分析试验结果后得到最佳工艺为:发酵温度25 ℃,发酵时间24 h、嗜酸乳杆菌接种量107 CFU/g,在此条件下发酵鸭肉脯感官评分为86.21±0.74,pH值为4.59±0.11。与未发酵组相比,最优发酵条件下制作的鸭肉脯硬度、咀嚼性显著降低,弹性和内聚力稍有下降,便于咀嚼;微观结构显示,组织较为疏松、表面出现裂缝和孔洞,与质构测定结果一致,说明经嗜酸乳杆菌发酵后的鸭肉脯质构特性得到了改善。挥发性风味物质的测定结果显示,与未发酵组相比,发酵组鸭肉脯挥发性风味物质种类及含量均有所增多,其中发酵组中醇类、酸类和酯类相对含量较高,赋予鸭肉脯更浓郁的醇香、醋香和油脂香。综上,本研究不仅优化了发酵鸭肉脯的工艺条件,同时也明确了发酵对鸭肉脯品质改善的重要作用,可为鸭肉制品深加工及进一步开发提供理论参考。
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