可食性膜以天然高分子材料为基料，以分子间或分子内作用力成膜[1]，通过浸渍[2-3]、喷涂[4]和涂渍等方式将可食性材料覆盖于食品表面，从而实现在贮存、流通[5]、销售等环节保持食品良好物理状态和食用口感的目的。可食性膜作为阻隔层能够有效减少食品水分流失和降低化学反应速率[6-7]、避免微生物与食物接触，减少食品在贮藏和流通环节的损耗[8]。因此，可食性膜的应用研究对罗非鱼等易腐食品货架期的延长有重要意义。
近年来越来越多的研究集中在含有特殊组分（如抗菌剂等）的功能性可食性膜的制备。刘津延[9]利用蓝鲨鱼皮提取胃蛋白酶可溶性胶原蛋白，并添加抑菌能力较强的壳聚糖，制成可食性复合涂膜用于鱼肉的保鲜。张琮等[10]以果胶、壳聚糖为成膜材料，甘油为增塑剂，蓝莓提取物为抑菌剂，制备蓝莓可食性保鲜膜用于包裹三文鱼，该薄膜能够延长冰鲜三文鱼货架期6 d。单梦圆等[11]以鱼鳞明胶为主料，添加1%柠檬精油和质量分数1%薄荷粉制备可食性保鲜膜，可将金枪鱼肉的货架期延长至8 d。
以天然高分子聚合物作为可食用包装材料，由于单一的聚合物性能具有局限性，可以采用共混的方式将不同聚合物的优点集合，使可食用包装材料达到更为优良的性能。普鲁兰多糖水溶液有较好的成膜性，且薄膜热稳定性高，热封性能良好，安全环保，但单独使用普鲁兰多糖制作可食性膜力学性能不佳、脆性大，且价格偏高，而将纯普鲁兰多糖与其他高分子材料进行多元共混[12-13]，不仅可以改善性能，增加其柔韧性，还可以降低成本，更适于食品包装的生产使用。海藻酸钠来源于褐藻类植物[14]，无毒性，凝胶性和成膜性良好[15]，价格低廉。羧甲基纤维素是天然纤维经过化学改性后获得的一种水溶性良好的聚阴离子化合物[16]，具有阻止水分迁移、提高膜的机械强度[17]、保持食品结构等作用。李秋莹等[18]评估没食子酸和ε-聚赖氨酸盐酸盐单独或复合添加普鲁兰多糖-羧甲基纤维素钠涂膜对冷藏海鲈鱼鱼片品质的影响，结果表明，普鲁兰多糖-羧甲基纤维素钠-没食子酸和ε-聚赖氨酸盐酸盐处理显著抑制了海鲈鱼片中微生物的生长，能够有效维持鱼片的持水性和不易流动水含量，延缓其硬度、弹性、咀嚼性及回复性等质构指标的下降。根据前期研究[19]可以得知，壳聚糖、鱼精蛋白、大蒜、生姜均能对耐冷革兰氏阴性假单胞菌和希瓦氏菌进行有效抑制，是罗非鱼专用复合天然防腐剂。本研究添加罗非鱼专用复合天然防腐剂和天然高分子聚合物共混制备可食性膜，进行罗非鱼保鲜，多元共混制备可食性膜可以降低成本，更适于生产使用，对食品包装行业有较大意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
海藻酸钠 青岛明月海藻集团有限公司；普鲁兰多糖 东京化成工业株式会社；壳聚糖 上海伯奥生物科技有限公司；鱼精蛋白 郑州食代添骄化工产品有限公司；生姜、大蒜 裕隆购物广场超市；羧甲基纤维素钠 上海嘉禾生物科技有限公司；氯化钙 上海鑫泰生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
DHG-90电热鼓风干燥箱 上海三发科学仪器有限公司；TA-XT2i物性测试仪 北京微讯超技仪器技术有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 江苏金坛荣华仪器制造有限公司；SHZ-D真空泵 巩义市英峪予华仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 可食性膜的制备
称取一定量海藻酸钠、普鲁兰多糖、羧甲基纤维素钠粉末加入去离子水中，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，用移液枪吸取1%甘油加入其中，搅拌至完全混合，然后加入复合防腐剂（20%生姜溶液、20%大蒜溶液、0.6 g/100 mL鱼精蛋白、1.2 g/100 mL壳聚糖）[19]，搅拌混合均匀，放置过夜，除去膜液中的气泡[20-21]，然后将膜液均匀倾倒在塑料平皿内，放入50 ℃烘箱，干燥4 h后取出，加入适量质量分数5%氯化钙溶液浸泡5 min，将可食性膜用水清洗后室温通风干燥24 h即可。
1.3.2 单因素试验
成膜复合溶液采用海藻酸钠质量浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/100 mL，普鲁兰多糖质量浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/100 mL；羧甲基纤维素钠质量浓度分别为0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 g/100 mL；复合防腐剂质量浓度分别为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/100 mL，进行单因素试验。
1.3.3 响应面试验
响应面试验因素水平表如表1所示。
表1 响应面试验因素水平
Table 1 Code and level of independent variables used in response surface design
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1.3.4 水蒸气透过率测定
取40 mL去离子水装入干燥烧杯，将待测保鲜膜完全覆盖于瓶口，使用橡皮筋密封住烧杯口，并称量烧杯去离子水和复合薄膜的总质量。在密闭干燥器底部放入变色硅胶，将烧杯在干燥器中放置均匀，每隔2 h测定一次烧杯去离子水和复合薄膜的总质量，然后快速将烧杯放入干燥器中。共测定8 次，按式（1）计算水蒸气透过率[22-23]。
式中：m为烧杯质量增加量/g；d为膜厚度/m；S为水蒸气透过有效膜面积/m2；t为测定时间/s；ΔP为膜上下两侧的压力差/Pa。
1.3.5 拉伸强度和断裂伸长率的测定
根据GB 1040-79《塑料拉伸性能试验方法》将膜裁成2 cm×8 cm的长条，在物性测试仪上测定，测定速率1 m m/s[2 4-2 5]。薄膜拉伸强度和断裂伸长率分别按式（2）、（3）计算。
式中：F为试样断裂时承受的最大张力/N；L为试样厚度/m；W为试样宽度/m。
式中：L’为试样断裂时的膜长度/m；L为膜初始长度/m。
1.3.6 保鲜效果测定
将所制备可食性保鲜膜包装生鲜罗非鱼片，作为实验组，未做任何包装的生鲜罗非鱼片为对照组，置于4 ℃冰箱中，定期取样进行感官评价、菌落总数和挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量的测定。
1.3.6.1 感官评价
挑选12 名经验丰富的小组成员（6男、6女，年龄20～30 岁），根据色泽、气味、质地、黏液外观4 个方面对不同处理方式的生鲜罗非鱼片进行综合评分，感官评分标准见表2。
表2 感官评分标准
Table 2 Criteria for sensory evaluation of tilapia fillets
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1.3.6.2 TVB-N含量的测定
按照GB/T 5009.44—2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》的微量扩散法，以每100 g样品中所含氮含量表示，单位为mg/100 g。
1.3.6.3 菌落总数的测定
无菌条件下剪取10 g鱼肉加入90 mL灭菌生理盐水，120 r/min振摇30 min。取1 mL上清液梯度稀释后采用计数培养基置于30 ℃培养48 h，计算菌落数。
1.4 数据处理
采用Microsoft Excel 2007进行数据处理和绘制图表，用SPSS 18进行方差分析，利用Design-Expert 10进行试验设计及响应面分析。所有实验均平行测定3 次，结果取平均值。
2 结果与分析
2.1 海藻酸钠质量浓度对可食性膜性能的影响
由图1可知，随着海藻酸钠质量浓度逐渐增大，所制得薄膜水蒸气透过率逐渐下降，这是由于随着海藻酸钠质量浓度的增加，保鲜膜分子间隙减小，交联程度愈加紧密，使得膜结构更加致密，水蒸气透过率减小。当海藻酸钠质量浓度较低时，成膜液流动性较大，制得的膜较薄，干燥后不易揭膜，且薄膜的拉伸强度和断裂伸长率均很低。当海藻酸钠质量浓度逐渐增大，所制得薄膜的拉伸强度和断裂伸长率也随之增加，这是由于当海藻酸钠质量浓度增加，单位体积内的分子数增多，成膜时分子链间的相互作用力增强，分子交联更紧密[26]，薄膜厚度也增大，薄膜的厚度是影响膜机械性能的重要因素[27-28]，薄膜强度随之增大。但当海藻酸钠质量浓度大于1.5 g/100 mL后，在薄膜厚度增加的同时脆性增加，断裂伸长率减小，这可能是因为海藻酸钠具有高分子刚性[29-30]，刚性增加使保鲜膜变硬，延展性减小。因此，选择1.0、1.5、2.0 g/100 mL海藻酸钠进行响应面试验。
图1 海藻酸钠质量浓度对可食性膜水蒸气透过率、拉伸强度、断裂伸长率的影响
Fig. 1 Effect of sodium alginate concentration on WVP, TS and EAB of edible film
2.2 普鲁兰多糖质量浓度对可食性膜性能的影响
由图2可知，成膜液中普鲁兰含量较低时，薄膜的拉伸强度较小，水蒸气透过率较大；随着普鲁兰多糖质量浓度逐渐增大，薄膜的致密性、连续性显著增加，当普鲁兰多糖质量浓度为0.4 g/100 mL，膜的机械性能最佳，当普鲁兰多糖质量浓度大于0.4 g/100 mL时，制备的薄膜易断裂，延伸性差，这与普鲁兰多糖本身的力学性能不佳有关。因此，选择0.2、0.4、0.6 g/100 mL普鲁兰多糖进行响应面试验。
图2 普鲁兰多糖质量浓度对可食性膜水蒸气透过率、拉伸强度、断裂伸长率的影响
Fig. 2 Effects of pullulan concentration on WVP, TS and EAB of edible film
2.3 羧甲基纤维素钠质量浓度对可食性膜性能的影响
由图3可知，羧甲基纤维素钠对薄膜拉伸强度影响较大，随着羧甲基纤维素钠的加入，成膜液黏度增加，且与其中海藻酸钠、普鲁兰多糖产生协同作用[31-32]，使薄膜致密性增加，薄膜的机械性能提高，水蒸气透过率逐渐下降。当羧甲基纤维素钠量质量浓度达到0.10 g/100 mL时，成膜液黏度显著提高，这不利于将膜液中的气泡完全脱去，导致制得的可食性膜均匀性不佳[33]。因此，选择0.08、0.10、0.12 g/100 mL羧甲基纤维素钠进行响应面试验。
图3 羧甲基纤维素钠质量浓度对可食性膜水蒸气透过率、拉伸强度、断裂伸长率的影响
Fig. 3 Effect of sodium carboxymethyl cellulose concentration on WVP, TS and EAB of edible film
2.4 复合防腐剂质量浓度对可食性膜性能的影响
由图4可知，随着复合防腐剂质量浓度逐渐增大，所制得薄膜的水蒸气透过率逐渐下降，拉伸强度增加，这是由于复合防腐剂中的壳聚糖分子与其他成分发生氢键相互作用[34]，分子链排列紧密。当复合防腐剂质量浓度为0.8 g/100 mL时，薄膜机械性能最佳，当质量浓度大于0.8 g/100 mL时，壳聚糖分子上带正电的氨基相互斥力增强，分子链在空间中有较大伸展，分子排列困难，反而使膜的致密性下降，更易断裂。因此，选择0.6、0.8、1.0 g/100 mL复合防腐剂进行响应面试验。
图4 复合防腐剂质量浓度对可食性膜水蒸气透过率、拉伸强度、断裂伸长率的影响
Fig. 4 Influence of preservative mixture concentration on WVP, TS and EAB of edible film
2.5 响应面设计试验优化结果
2.5.1 响应面设计试验
以海藻酸钠质量浓度（A）、普鲁兰多糖质量浓度（B）、羧甲基纤维素钠质量浓度（C）、复合防腐剂质量浓度（D）为自变量，以薄膜的水蒸气透过率、拉伸强度和断裂伸长率为响应值进行响应面试验。Box-Behnken设计方案及试验结果见表3。
表3 响应面设计试验结果
Table 3 Box-Behnken design with response variables
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续表3
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2.5.2 水蒸气透过率回归方程方差分析
以海藻酸钠质量浓度（A）、普鲁兰多糖质量浓度（B）、羧甲基纤维素钠质量浓度（C）、复合防腐剂质量浓度（D）作为响应变量，水蒸气透过率作为响应值，利用软件进行模型拟合，预测的模型如下：
水蒸气透过率=2.31+0.027A-0.054B+0.10C+0.002 8D-0.002 2AB-0.028AC-0.006 4AD-0.14BC-0.058BD-0.12CD-0.22A2-0.21B2-0.15C2-0.23D2。
如表4所示，该模型回归显著（P＜0.05），失拟项不显著，R2=0.931 6，说明该模型与实际生产结果拟合性良好。由方差分析可知，方程的一次项B、C，交互项BC、CD以及二次项A2、B2、C2、D2对响应值的影响显著，FA=1.63、FB=6.47、FC=22.59、FD=0.018，即各因素对薄膜水蒸气透过率的影响程度依次为：羧甲基纤维素钠质量浓度＞普鲁兰多糖质量浓度＞海藻酸钠质量浓度＞复合防腐剂质量浓度。
表4 水蒸气透过率回归模型方差分析
Table 4 Analysis of variance of regression model for WVP
注：*.显著（P＜0.05）；**.极显著（P＜0.01）。表5、6同。
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2.5.3 拉伸强度回归方程方差分析
以海藻酸钠质量浓度（A）、普鲁兰多糖质量浓度（B）、羧甲基纤维素钠质量浓度（C）、复合防腐剂质量浓度（D）作为响应变量，拉伸强度作为响应值，利用软件进行模型拟合，预测的模型如下：
拉伸强度=54.89+0.39A-1.01B+2.58C+0.58D+1.19AB-1.25AC+0.26AD-2.31BC-1.74BD-0.94CD-3.63A2-4.26B2-1.97C2-4.26D2
如表5所示，该模型回归显著（P＜0.05），失拟项不显著，R2=0.931 6，说明该模型与实际生产结果拟合性良好。由方差分析可知，方程的一次项中C、交互项BC以及二次项A2、B2、C2、D2对响应值的影响显著，FA=0.52、FB=3.44、FC=22.33、FD=1.14，即各因素对薄膜拉伸强度的影响程度依次为：羧甲基纤维素钠质量浓度＞普鲁兰多糖质量浓度＞复合防腐剂质量浓度＞海藻酸钠质量浓度。
表5 拉伸强度回归模型方差分析
Table 5 Analysis of variance of regression model for TS
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2.5.4 断裂伸长率回归方程方差分析
以海藻酸钠质量浓度（A）、普鲁兰多糖质量浓度（B）、羧甲基纤维素钠质量浓度（C）、复合防腐剂质量浓度（D）作为响应变量，断裂伸长率作为响应值，利用软件进行模型拟合，预测的模型如下：
断裂伸长率=3.13+0.007 4A+0.007 2B+0.11C+0.05D+0.022AB-0.11AC-0.059AD-0.17BC-0.16BD-0.06CD-0.21A2-0.26B2-0.14C2-0.25D2
如表6所示，该模型回归显著（P＜0.05），失拟项不显著，R2=0.931 6，说明该模型与实际生产结果拟合性良好。由方差分析可知，方程的一次项C、交互项BC、BD以及二次项A2、B2、C2、D2对响应值影响显著，FA=0.053、FB=0.049、FC=10.67、FD=2.62，即各因素对薄膜断裂伸长率的影响程度依次为：羧甲基纤维素钠质量浓度＞复合防腐剂质量浓度＞海藻酸钠质量浓度＞普鲁兰多糖质量浓度。
表6 断裂伸长率回归模型方差分析
Table 6 Analysis of variance of regression model for EAB
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2.5.5 响应曲面分析及验证
根据回归方程得到响应面分析图，通过观察响应曲面形状，分析选定的4 个变量对3 个响应值的影响。观察发现，羧甲基纤维素钠轴方向的弯曲程度最为明显，说明羧甲基纤维素钠质量浓度对保鲜膜水蒸气透过率、拉伸强度、断裂伸长率影响最大，是影响保鲜膜性质的主要影响因素。
图5 不同影响因素对水蒸气透过率、拉伸强度、断裂伸长率的交互作用
Fig. 5 Response surface and contour plots showing individual and interactive effects of variables on WVP, TS and EAB of edible film
通过Design-Expert软件探究各因素的最佳条件组合，使水蒸气透过率取最小值，拉伸强度、断裂伸长率取最大值，得到最佳组合条件为：海藻酸钠质量浓度1.50 g/100 mL、普鲁兰多糖质量浓度0.40 g/100 mL、羧甲基纤维素钠质量浓度0.10 g/100 mL、复合防腐剂质量浓度0.80 g/100 mL，此条件下薄膜的水蒸气透过率为1.981 5×10-12（g·m）/（m2·s·Pa）、拉伸强度为54.887 MPa、断裂伸长率为3.13%，结合实际操作性，对响应面优化所得条件的准确性进行验证，重复3 次，实际测得的水蒸气透过率、拉伸强度、断裂伸长率分别为1.978 5×10-12（g·m）/（m2·s·Pa）、55.004 MPa、3.14%，与软件分析所得结果吻合，说明响应面分析结果可靠性良好，对可食性膜性能有实际预测价值。
2.6 保鲜指标测定
采用最佳配方所制作的可食性膜包覆罗非鱼片，于4 ℃有氧低温贮藏，定期测定TVB-N含量和细菌总数，并进行感官评价。
由图6A可知，比较鱼片TVB-N含量、菌落数发现：对照组＞复合天然防腐剂处理组＞罗非鱼专用保鲜膜处理组，冷藏9 d时对照组鱼片TVB-N含量达到21.2 mg/100 g，超过国家限量标准20 mg/100 g，而复合防腐剂处理组鱼片在冷藏15 d时TVB-N含量仅为18.69 mg/100 g，罗非鱼专用保鲜膜处理组鱼片在冷藏18 d时TVB-N含量仅为19.84 mg/100 g。冷藏9 d时对照鱼片的菌落数和冷藏18 d时保鲜膜处理鱼片的菌落数接近。可见，可食性薄膜有效地抑制罗非鱼片TVB-N含量和菌落数的增加。这可能与保鲜膜多孔网络结构，具有较好地阻隔性能有关，说明罗非鱼专用保鲜膜能够有效延长罗非鱼片的保质期。由图6B可知，对照鱼片冷藏9 d、复合防腐剂处理鱼片冷藏15 d、可食性保鲜膜处理鱼片冷藏18 d时的感官雷达图无明显差异，因此，可食性保鲜膜可以用于生鲜罗非鱼片包装。
图6 罗非鱼片不同处理条件下的保鲜效果
Fig. 6 Effects of film packaging treatments on quality attributes of tilapia fillets
3 结 论
本研究以水蒸气透过率、拉伸强度、断裂伸长率值为响应值，通过单因素试验、响应面优化设计
确定罗非鱼专用可食性保鲜膜的最佳配方为海藻酸钠质量浓度1.5 0 g/1 0 0 m L、普鲁兰多糖质量浓度0.4 0 g/1 0 0 m L、羧甲基纤维素钠质量浓度0.1 0 g/1 0 0 m L、复合防腐剂质量浓度0.80 g/100 mL，此配方制备的可食性保鲜膜的水蒸气透过率、拉伸强度、断裂伸长率分别达到1.9785×10-12（g·m）/（m2·s·Pa）、55.004 MPa、3.14%，通过保鲜效果分析得出，该配方制备的可食性保鲜膜可将4 ℃有氧低温贮藏下罗非鱼的保质期由9 d延长至18 d。此方法制备的可食性保鲜薄膜具有优良的阻隔性能和抗菌能力，且由天然生物大分子物质制成，易被生物降解，可与罗非鱼片共同食用，食用安全性高，可应用于罗非鱼流通过程中的保鲜使用。此外，本研究中仅考察了薄膜的水蒸气透过率和机械强度，对于如何控制阻氧量，既能抑制罗非鱼特定腐败菌专性需氧假单胞菌的生长，又能防止可能的温度波动所引起的厌氧性肉毒梭状杆菌的繁殖，还需要进一步研究。
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