Optimized Preparation and Flavor Analysis of Mutton-like Flavoring Base
刘慧, 邢佳浩, 范敏, 等. 羊肉风味基料的工艺优化及风味分析[J]. 肉类研究, 2023, 37(5): 57-65. DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20221230-162. http://www.rlyj.net.cn
LIU Hui, XING Jiahao, FAN Min, et al. Optimized preparation and flavor analysis of mutton-like flavoring base[J]. Meat Research, 2023, 37(5): 57-65. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20221230-162. http://www.rlyj.net.cn
我国是羊肉生产和消费大国，截至2022年，羊出栏量33 624 万只，羊肉人均年消费量高达18.80 kg，约占全球1/3[1-2]。羊骨是畜产品加工过程中重要的副产品，营养丰富[3]，含有人体所必需的营养物质。羊骨中的胶原蛋白约占体内总蛋白的30%[4]，可促进代谢，延缓机体衰老[5]。胶原蛋白是三螺旋结构，不易被机体吸收利用，所以可对羊骨粉进行水解，增加其生物利用度，不仅可以获得较多的游离氨基酸和多肽，而且可以促进钙、磷等无机盐离子的释放，大大提高其营养价值[6]。张琪等[7]以羊骨粉为原料，利用双酶水解法对羊骨粉的工艺进行研究；冯雅蓉等[8]制备出降血压活性较高的羊骨肽；李晓叶等[9]以羊骨粉为原料，利用碱性蛋白酶酶解制备具有抗氧化活性的酶解多肽液，为制备羊肉风味基料提供了技术参考。王雪琦等[10]以酶解-发酵法制备羊骨胶原蛋白肽-钙螯合物，对其结构表征和稳定性进行分析，为开发新型钙补充剂和促进羊骨的利用提供了理论依据。因此，利用禽骨开发新型、天然和绿色的营养食品及食品添加剂，提高肉品加工企业的综合效益，具有广阔的应用前景。
风味基料可以赋予食品良好的色、香、味，从而提高食品的感官品质。随着生活水平的提高，消费者对于风味基料的品质要求越来越高。以往那些成分单一、口感单一的传统风味基料不能满足消费者的需求，而以动物骨或肉原料，通过现代加工技术制备的具有特殊风味、营养价值高、方便等优点的食品风味基料深受消费者喜爱[11-12]，因此复合风味基料的制备工艺研究逐渐成为行业热点。很多研究以羊骨为原料，通过酶解法对羊骨进行预处理，利用美拉德反应制备羊肉风味基料[13-14]。张婷等[15]通过固相微萃取-气相色谱-质谱联用（solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）和电子舌对制备的羊肉复合风味基料进行分析，确定美拉德反应可以增强复合风味基料的整体风味。因此，羊骨风味基料对获得高附加值的产品具有重要意义。
本研究将羊骨粉进行二次酶解，外加L-半胱氨酸、L-谷氨酸、D-木糖和葡萄糖高温制备羊肉风味基料，通过单因素试验和响应面试验进行反应工艺优化，对反应产生的风味物质进行SPME-GC-MS分析，从而制备出羊肉香味突出的风味基料。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
羊骨粉 青岛佰旭食品有限公司；风味蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶 广州嘉业食品配料有限公司；L-半胱氨酸、L-谷氨酸、D-木糖 上海麦克林生物有限公司；葡萄糖 天津市大茂化学试剂厂；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
PHSJ-3F pH计 上海雷磁仪器有限公司；PL203电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；ZNCL-GS190*90集热式磁力搅拌器 巩义市科瑞仪器有限公司；UV1901分光光度计 上海奥析科学仪器有限公司；8860-5977B气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司；L550高速离心机 湘仪离心机仪器有限公司；WSF分光测色仪 上海仪电物理光学仪器有限公司；HH-1水浴锅 常州国华电器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 羊骨素酶解液的制备
1.3.1.1 一次酶解法
参照余江泳等[16]的方法制备。准确称取羊骨粉样品，加入一定量的水，按表1条件进行酶解，水浴1 h后，升温至90 ℃水浴灭酶10 min，制得4 种酶解液。
表1 羊骨粉一次酶解条件
Table1 Conditions for hydrolysis of sheep bone meal by individual proteases
酶种类底物质量浓度/（g/100 mL）酶添加量/（g/100 mL）pH温度/℃碱性蛋白酶6510.050复合蛋白酶657.555风味蛋白酶657.055胰蛋白酶658.037
1.3.1.2 二次酶解法
参照詹萍等[13]的方法。称取羊骨粉样品，加入一定量的水，按表2的酶解条件先调至碱性蛋白酶的最适酶解条件进行酶解，后再调至风味蛋白酶的最适酶解条件二次酶解，酶解完毕，于90 ℃水浴灭酶10 min，冷却至室温，4 000 r/min离心20 min后取上清液待用。
表2 羊骨粉二次酶解条件
Table2 Conditions for sequential hydrolysis of sheep bone meal by alcalase and flavourzyme
酶种类底物质量浓度/（g/100 mL）酶添加量/（g/100 mL）pH 温度/℃风味蛋白酶657.055碱性蛋白酶6510.050
1.3.2 羊骨粉水解度的测定
参照韩克光等[17]的方法。二次酶解液4 000 r/min离心20 min，进行水解度测定。游离氨基酸含量采用甲醛滴定法进行测定[18]。总氮含量采用凯氏定氮法进行测定[19]。水解度按下式计算。
1.3.3 美拉德反应
在预实验的基础上，以50 mL羊骨二次酶解液为反应底物，添加2 g/100 mL L-半胱氨酸、3 g/100 mL L-谷氨酸、2 g/100 mL D-木糖和1 g/100 mL葡萄糖[20-21]，在不同反应温度、初始pH值及反应时间条件下进行单因素试验，以褐变度、色差及感官评分为指标。
1.3.3.1 温度对褐变度、感官评分和色差的影响
取酶解液50 mL，初始pH值为6，反应时间50 min，研究不同反应温度（80、90、100、110、120 ℃）对褐变度、色差及感官评分的影响。
1.3.3.2 初始pH值对褐变度、感官评分和色差的影响
取酶解液50 mL，反应时间50 min，反应温度100 ℃，研究不同初始pH值（4、5、6、7、8）对褐变度、色差及感官评分的影响。
1.3.3.3 加热时间对褐变度、感官评分和色差的影响
取酶解液50 mL，初始pH值为6，反应温度100 ℃，研究不同加热时间（30、40、50、60、70 min）对褐变度、色差及感官评分的影响。
1.3.4 褐变度的测定
参照Chen Kangni等[22]的方法，将美拉德反应液稀释50 倍，于420 nm波长处测定吸光度。
1.3.5 色差的测定
参考Chen Xiao等[23]的方法稍加修改。将反应液倒于比色皿中，用分光光度计测定亮度值（L*）、红度值（a*）和黄度值（b*）。每个样品测定3 次，取平均值。
1.3.6 感官评价
挑选1 5 名（其中8 名男性、7 名女性，年龄20～40 岁）具有食品专业基础的人员对样品进行感官评价[24]，采用盲评的方式评价，最终结果取平均值。感官评价标准见表3。
表3 感官评分标准
Table3 Criteria for sensory evaluation of mutton-like flavoring base
指标等级优（9～10 分）良（7～8 分） 中（5～6 分）差（1～4 分）色泽（10 分）色泽金黄，澄清透明色泽较浅，呈浅黄色色泽很浅，不易察觉无色，基本无反应气味（10 分）肉香逼真，保留时间长肉香浓郁，保留时间较长肉香味不明显，不易察觉无明显肉香味，且有硫臭味、焦糊味等不良气味
1.3.7 响应面试验
在单因素试验的基础上，以反应时间、反应温度、初始pH值为响应因素，感官评分为响应值进行响应面试验设计，响应面试验设计因素和水平见表4。
表4 响应面试验设计因素和水平
Table4 Factors and levels used for response surface design
因素水平－101反应时间/min405060反应温度/℃100110120初始pH567
1.3.8 挥发性化合物的测定
1.3.8.1 SPME
参照丁晔等[25]的方法，修改如下：取5 mL样品加入20 mL顶空瓶中，通过CAR/PDMS纤维头对每个样品进行SPME，样品在50 ℃平衡10 min，顶空吸附20 min，待GC-MS分析。
1.3.8.2 GC-MS条件
G C 条件参照张同刚等[2 6]的方法，修改如下：HP-5MSUI毛细管柱（30 m×250 μm，0.25 μm），进样口温度250 ℃，柱初温40 ℃，保持2 min，40～100 ℃升温速率为2 ℃/min，100～150 ℃升温速率为4 ℃/min，保持2 min，150～280 ℃升温速率为20 ℃/min；用氦气作为载气，流速1.0 mL/min，不分流。
MS条件参照Wei Chaokun等[27]的方法，修改如下：电子能量70 eV；四极杆温度150 ℃；离子源温度230 ℃；质量扫描范围40～450 u，全扫描模式。
1.4 数据处理
实验均重复3 次，结果取平均值±标准差。采用Excel 2020软件进行数据处理分析，SPSS 26.0软件进行方差分析和显著性检验（Duncan’s检验，P＜0.05），采用Design Expert 11.0软件进行Box-Behnken响应面优化试验设计。
2 结果与分析
2.1 不同单酶对水解度的影响
在酶解过程中，蛋白质被水解为多肽和氨基酸，可以提高美拉德风味。不同蛋白酶由于酶切位点不同，所以蛋白质被水解的程度不同[28]。由图1可知，水解度随着时间的延长而增加，2～4 h水解度增加比较明显，4 种蛋白酶在4 h后水解度呈缓慢上升趋势，5 h后胰蛋白酶水解度增加趋势缓慢，这可能是由于随着水解时间的延长，酶的活性会受到损失，同时底物的减少及产物的增加会造成对酶的反馈抑制作用增强，从而使得酶的水解速率下降[29]。
图1 不同单酶一次酶解羊骨粉水解度
Fig. 1 Hydrolysis degree of sheep bone meal with different single enzymes
在一次酶解的基础上，选取风味蛋白酶和碱性蛋白酶2 种水解效果较好的酶进行二次酶解。二次酶解法的优点在于可以使2 种酶分别在各自的最优条件下进行水解，从而最大限度提高羊骨粉的水解度。先将羊骨酶解液调至碱性蛋白酶的最适反应条件进行水解，然后再调至风味蛋白酶的最适反应条件进行水解[30]。
由图2可知，在碱性蛋白酶水解5 h后加入风味蛋白酶使其水解速率提高，水解至8 h后水解度达到最大，为40.25%，相比于单酶水解，其水解度提高。碱性蛋白酶属于内切酶的一种，对肽键两端发生的氨基酸水解产生大量疏水键，从而导致酶解液产生苦味，不利于后续产品的制备。先使用碱性蛋白酶酶解样品后，再使用外切酶风味蛋白酶酶解，酶解液带有骨香味，苦味降低，且经碱性蛋白酶酶解后酶解液pH值约为6.8，接近风味蛋白酶的最适pH值，可避免二次调节pH值[30]。综合考虑，实验选用碱性蛋白酶和风味蛋白酶对羊骨粉进行二次酶解。
图2 不同单酶二次酶解羊骨粉水解度
Fig. 2 Hydrolysis degree of sheep bone meal by combined use of alcalase and flavourzyme
2.2 单因素试验结果
2.2.1 反应温度对美拉德反应的影响
由图3可知，随着反应温度的提高，美拉德体系褐变度呈显著上升的趋势。在80～100 ℃，温度对美拉德反应的影响十分显著，随着温度的上升，酶解液中的羰基化合物和氨基化合物迅速发生反应产生类黑精类物质，使得体系褐变度迅速上升[31]。当温度上升到100 ℃以后时，褐变度的上升速率略微下降，体系吸光度上升较缓慢，这可能是由于体系中反应物消耗殆尽的缘故。
图3 反应温度对褐变度的影响
Fig. 3 Effect of reaction temperature on browning degree
由图4可知，随着反应温度的上升，感官评分先上升后下降，在110 ℃时感官评分达到最高。这是因为在较低的温度时，氨基酸和还原糖反应不充分，产生具有肉香味的风味物质较少。随着温度的升高，半胱氨酸、木糖、谷氨酸热降解形成具有挥发性的物质，从而形成肉味[32]。当高于110 ℃时，美拉德反应产生焦糊味，可能是由于反应温度升高使得美拉德反应剧烈，从而产生一些不良风味物质[33]。
图4 反应温度对感官评分的影响
Fig. 4 Effect of reaction temperature on sensory evaluation
由图5可知，随着温度的上升，L*逐渐下降，体系的亮度逐渐变暗，说明随着反应温度的增加，美拉德反应越来越剧烈，产生了大量有色物质，这与褐变度的测定结果相符。a*先下降后上升，于100 ℃时达到最低，说明红色度先下降后上升。b*逐渐上升，说明黄色度逐渐上升。综合反应温度对体系褐变度、感官评价及色差的影响，加热温度在100～120 ℃最佳。
图5 反应温度对色差的影响
Fig. 5 Effect of reaction temperature on color difference
2.2.2 初始pH值对美拉德反应的影响
由图6可知，随着初始pH值的上升，褐变度呈显著上升趋势，说明美拉德反应越来越剧烈，这表明偏酸性的环境不利于美拉德反应的进行，而偏碱性的环境有利于美拉德反应的进行，且碱性越强，反应越剧烈[34]。
图6 初始pH值对褐变度的影响
Fig. 6 Effect of initial pH on browning degree
由图7可知，随着初始pH值的上升，感官评分先上升后下降，初始pH值为6时达到最高值。研究[35]表明，在较低pH值条件下，多肽和游离氨基酸的氨基会发生质子化，从而阻碍美拉德反应的进行，使得产生的风味物较少；pH值较高时，美拉德反应剧烈，产生的风味化合物容易发生环化反应，生成杂味物质，导致美拉德反应感官评分降低。
图7 初始p
值对感官评分的影响
Fig. 7 Effect of initial pH on sensory score
由图8可知，L*随初始pH值的上升呈下降趋势，体系色泽逐渐变暗。a*和b*呈逐渐上升趋势，即红色度和黄色度逐渐增加，可能是由于碱性环境加快了美拉德反应中深色物质的形成，在初始pH值较高时，体系颜色浑浊无亮度，考虑到亮黄色的物质更容易为人所接受，综合以上分析，初始pH值在5～7时最佳。
图8 初始pH值对色差的影响
Fig. 8 of initial pH on color difference
2.2.3 反应时间对美拉德反应的影响
由图9～10综合分析可知，反应时间达到50 min时，感官评分最高，反应时间低于或高于50 min时，感官评分均下降。这是由于短时间反应，美拉德反应不充分，产生的风味物质较少；而长时间反应会导致产生的类黑素发生环化，生成吡啶等含氮化合物，产生的糊味和硫臭味会掩盖产生的肉香味[36]。
图9 反应时间对褐变度的影响
Fig. 9 Effect of reaction time on browning degree
图10 反应时间对感官评分的影响
Fig. 10 Effect of reaction time on sensory score
由图11可知，随着反应时间的延长L*逐渐下降，说明体系的亮度逐渐变暗，a*和b*呈先下降后上升的趋势，即红色度和黄色度先下降后上升，分别于50 min和40 min达到最低。综合褐变度、感官评价及色差相关测定结果，反应时间在40～60 min最佳，此时制得的产品晶莹透明、呈亮黄色。
图11 反应时间对色差的影响
Fig. 11 Effect of reaction time on color difference
2.3 响应面试验优化结果
2.3.1 优化试验结果及分析
在单因素试验的基础上，用Design Expert 11.0软件对反应时间、反应温度和初始pH值进行的Box-Behnken响应面试验设计及结果如表5所示。对实验数据进行多元回归拟合，得到感官评分对反应时间（A）、反应温度（B）、初始p H 值（C）的二次回归方程为：Y=1 6.0 8 ＋0.29A＋0.40B＋1.11C－1.03AB＋0.55AC－0.77BC－3.19A2－2.02B2－1.89C2。
表5 响应面试验设计及结果
Table5 Design and results of response surface test
试验号A反应时间/min B反应温度/℃C初始pH感官评分1 4010069.3±0.57 2 60100611.5±0.98 3 40120612.3±1.01 4 60120610.4±0.75 5 4011059.6±0.88 6 6011059.5±1.23 7 40110711.4±1.65 8 60110713.5±0.65 9 50100510.3±0.55 1050120512.5±0.16 1150100713.4±1.24 1250120712.5±0.54 1350110615.5±0.98 1450110616.6±1.22 1550110616.5±0.51 1650110616.5±1.24 1750110615.3±0.78
由表6可知，模型P＜0.01，说明该模型极显著。根据均方项可知，影响美拉德反应产物感官评价的因素按重要性进行排序为初始pH值（C）＞反应温度（B）＞反应时间（A），并且初始pH值（C）对模型有极显著影响（P＜0.01）。失拟项P=0.44＞0.05，说明未知因素对模型的影响较小。该模型R2=0.972 7，说明该模型能够解释97.27%的响应模型变化。同时该模型的
=0.937 6，
=0.777 2，二者的差值小于0.2，说明模型与实验拟合程度较好，可以用此模型来进行预测分析。
表6 美拉德反应产物感官评价中心组合试验结果方差分析
Table6 Analysis of variance of the effect of reaction conditions on sensory evaluation of Maillard reaction products
注：*. 显著（P＜0.05）；**. 极显著（P＜0.01）。
变异来源平方和自由度均方F值P值模型102.74911.4227.690.000 1**A 0.6610.661.600.245 8 B1.2811.283.110.121 4 C9.9019.9024.020.001 8**AB4.2014.2010.190.015 2*AC1.2111.212.940.130 4 BC2.4012.405.830.046 5*A242.85142.85103.94＜0.000 1 B217.10117.1041.470.000 4**C215.04115.0436.490.000 5**失拟项1.3230.441.120.440 0纯误差1.5740.39总变异105.6216
2.3.2 不同因素交互作用分析
响应面图是响应值与两交互因素构成的3D曲面图，曲面图的陡峭程度可用来反映因素交互作用对响应值的影响，曲面越陡，说明该因素对感官评分的影响越显著。等高线趋近于椭圆则表示两因素间交互作用显著。由图12可知，AB、AC对羊肉风味基料感官评分影响交互作用明显，AC之间交互作用不明显。
图12 两因素交互作用对羊肉风味基料感官评分影响的响应面图及等高线
Fig. 12 Response surface and contour plots showing the individual and interactive effects of reaction conditions on sensory score of mutton-like flavoring base
2.3.3 参数优化及验证实验
用Design Expert 11.0软件对试验结果进行响应面优化，得到羊肉风味基料的最佳工艺参数为反应温度110.44 ℃、反应时间50 min、初始pH值6.28，在此条件下羊肉风味基料感官评分最高，为16.25 分。为了便于操作，实际工艺参数为反应温度110 ℃、反应时间50 min、初始pH值6.0，按照优化后的实际工艺进行重复验证，所得的感官评分测定值与预测值的相对偏差小于5%，说明该工艺条件具有可行性。
2.4 羊肉风味基料挥发性成分分析
优化后的羊肉风味基料进行SPME-GC-MS分析，结合NIST数据库鉴定，确定羊肉风味基料香气化合物，选出匹配率较高的物质[37]。由表7可知，该调味基料共检测出51 种挥发性成分，其中醛类14 种、醇类7 种、酮类6 种、酸类7 种、酯类3 种、醚类1 种、烃类7 种、含硫化合物3 种、杂环类3 种。醛类化合物阈值一般较低，可能形成羊肉的特征风味物质，如检测出产生具有独特肉香风味的(E,E)-2,4-癸二烯醛和(E)-2-壬烯醛[38]，这可能是脂质降解后与美拉德反应相互作用产生的[39]，(E,E)-2,4-癸二烯醛逆羟醛缩合反应可以产生其他烯醛类物质，如检测出具有肉香味的(E)-2-辛烯醛[40]；醇类物质风味阈值与醛类相比较高，如检测出与肉味形成相关的1-辛烯-3-醇；酮类物质的阈值一般较高，所以其对羊肉风味的影响较小[38]，本实验中检出有肉香的2-庚酮；酸类物质中正辛酸、丁酸和2-甲基丁酸是形成肉香味的重要物质；酯类物质的阈值较低，常温下易挥发，赋予食物一定的香气，但对羊肉风味的形成作用较小；烃类化合物阈值较高，对羊肉风味的贡献一般不大，但部分烃类可以进一步形成杂环芳烃，对风味形成有一定作用；含硫化合物的存在使风味基料具有一定的羊肉香味，这是由于半胱氨酸通过Strecker降解产生硫化氢等物质，通过美拉德反应进一步生成具有香气的风味物质。
表7 羊肉风味基料中挥发性成分汇总表
Table7 Volatile components of mutton-like flavoring base
物质类别物质名称风味相对含量/%醛类(E,E)-2,4-辛二醛果香、脂肪香0.51±0.03正庚醛脂肪香0.41±0.02壬醛油脂香、坚果香0.64±0.03己醛青香、水果香0.63±0.03(E)-2-壬烯醛肉香0.43±0.02苯甲醛杏仁香1.08±0.02 2-十一烯醛煮肉香、脂肪香0.13±0.01癸醛柑橘香2.03±0.07十四醛脂香、奶香2.68±0.02 3-甲基丁醛水果香0.13±0.01(E,E)-2,4-癸二烯醛脂肪香0.49±0.03(E)-2-辛烯醛脂肪香0.09±0.02庚醛坚果味、水果香1.89±0.04 2-甲基辛二醛0.91±0.02
续表7
物质类别物质名称风味相对含量/%醇类2-乙基-1-己醇蘑菇香0.11±0.02 1-庚醇3.85±0.13 1-辛醇0.07±0.01 1-辛烯-3-醇蘑菇香、青草香0.98±0.03 1-丁醇1.37±0.15 6-甲基-2,5-庚二醇1.06±0.08酮类丙酮2.04±0.06 2-庚酮肉香0.44±0.02 2-十一烷酮0.23±0.02 2-十五酮1.13±0.03甲基庚烯酮2.13±0.06 2-辛酮果香0.03±0.01酯类丙烯酸正丙酯0.07±0.01十二酸乙酯0.17±0.02邻苯二甲酸二甲酯芳香味0.27±0.01酸类丁酸奶香0.85±0.02戊酸脂肪香、油脂香0.03±0.01己酸羊肉味0.28±0.02 4-甲基壬酸膻味0.14±0.01 4-乙基辛酸0.76±0.03正辛酸肉香0.64±0.03 2-甲基丁酸肉香0.05±0.01烃类2-乙基-1,4-二甲基苯0.14±0.02邻异丙基苯0.43±0.02十一烷10.11±0.16 3,5-辛二烯果香5.87±0.12 3-甲基十三烷0.11±0.01十四烷0.29±0.02硫醇糠基硫醇肉香0.03±0.01十二烷基硫醇0.28±0.03 1-庚硫醇肉香0.14±0.01 1-甲基丁硫醇葱蒜香1.23±0.05杂环类4-甲基吡嗪坚果香0.12±0.01 2,6-甲基吡嗪烤香0.29±0.01 2,3,5,6-四甲基吡嗪坚果香1.03±0.08 2-戊基呋喃青香0.32±0.02醚类苄基甲基硫醚烤香1.67±0.05
3 结 论
通过对比一次酶解法和二次酶解法对羊骨粉的水解度，发现采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶进行二次酶解的效果优于单酶。以羊骨酶解液为原料通过美拉德反应制备羊肉风味基料的最佳工艺参数为：2 g/100 mL L-半胱氨酸、3 g/100 mL L-谷氨酸、2 g/100 mL D-木糖和1 g/100 mL葡萄糖，反应温度110 ℃、反应时间50 min、初始pH值6.0。在此条件下得到整体风味良好的羊肉风味基料，感官得分为16.25 分。对该风味基料进行SPMEGC-MC挥发性成分分析，共检测出51 种挥发性物质，其中(E)-2-辛烯醛、1-辛烯-3-醇、(E)-2-壬烯醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛对羊肉风味基料的产生有重要作用。
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