随着生活水平的不断提高，人们对肉类的需求逐渐变高，部分商家为了较高的商业利润，使用廉价的猪肉来代替昂贵的牛羊肉[1]。这种以次充好、以假乱真的现象损害了消费者的合法权益，扰乱了市场秩序[2]。尽管许多国家建立了肉制品的相关食品安全标准，要求肉制品标签需标注物种信息类别和含量[3]，但是消费者从外观上还是很难分辨出掺假肉。因此，为了确保市场秩序的稳定和食品安全，需要一种简单实用、成本低廉的快速检测方法对肉及肉制品掺假进行检测。
目前肉类掺假检测方法主要分为基于蛋白质分子和基于DNA分子的检测技术[4]。其中基于蛋白质的检测技术有电泳法[5-6]、质谱技术[7-8]、酶联免疫吸附法[9-10]和蛋白质组学[11]等。但蛋白质在加工过程中易发生变性，在对热加工处理的食品进行检测时有很大的局限性[12]。而基于D NA 分子的实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）[13-14]、数字PCR[15-16]、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术[17-18]、滚环扩增技术[19-20]及重组酶聚合酶扩增技术[21-22]等检测方法凭借特异性强、灵敏度高等优点已成为目前肉类掺假的主要检测方法[23]。但这些技术存在引物设计困难、易产生假阳性、扩增时间长、对靶序列长度要求高等缺点，导致这些方法不能够得到更广泛的应用。因此，亟需建立一种快速、高效、操作简单、成本较低的检测新技术，以满足市场的需求。
Wang Deguo等[24]在解决LAMP技术中的假阳性问题并阐明了单链模板的产生机理后，开发了一种新型核酸等温扩增技术——梯型熔解温度等温扩增（ladder-shape melting temperature isothermal amplification，LMTIA）技术。该技术引物设计简单、反应时间迅速、灵敏度高、所需靶序列短等[25]，已应用于食品掺假检测[26-27]和病毒检测[28]中。本研究以猪细胞核中的催乳素受体（prolactin receptor，PRLR）[29]基因为靶标，将一种新型荧光杂交探针，即Proofman探针（proofreading enzyme-mediated probe cleavage）[30]与LMTIA技术相结合，其检测原理如图1所示。Proofman探针是根据LMTIA的环引物所设计，在Proofman探针的3＇端设计1 个错配碱基，将荧光基团标记在该错配碱基上，猝灭基团标记在探针的5＇端。反应开始时，在引物F和B的作用下，形成茎环结构DNA；Proofman探针与茎环结构进行互补配对，3＇端发生碱基错配，在超保真DNA聚合酶的作用下切除错配碱基，释放荧光基团，通过收集荧光信号即可对目标物质进行检测。旨在建立一种简单、快速的Proofman-LMTIA方法检测肉制品中的猪肉源基因，以期为市场上肉制品掺假提供一种快速、简便的检测方法。
图1 Proofman探针原理
Fig. 1 Principle of Proofman probe
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲜肉（鸡肉、鸭肉、猪肉、羊肉、牛肉）、淀粉制品（玉米淀粉、红薯淀粉、木薯淀粉、绿豆淀粉、小麦粉）及加工肉制品（熟牛肉、熟羊肉、牛肉卷、羊肉卷）购于许昌各大超市；猫肉、狗肉购于淘宝网。
血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司；Nucleo Spin®Food试剂盒德国Macherey-Nagel公司；通用型LMTIA反应预混液德歌生物技术有限公司；GPV8超保真DNA聚合酶（2 U/µL） 通用生物系统有限公司。
1.2 仪器与设备
Gentier 96E全自动医用PCR分析系统 西安天隆科技有限公司；Nano Drop One超微量核酸蛋白测定仪、SCI-VS可调式混匀仪 美国Thermo公司；1-15K高速冷冻离心机 德国Sigma公司；F6/10匀浆机 上海净信科技有限公司；Archimed时间分辨荧光定量PCR系统鲲鹏基因（北京）科技有限责任公司。
1.3 方法
1.3.1 模拟样品的制备
将所购鸡肉、鸭肉、猪肉、羊肉、牛肉、猫肉、狗肉等肉类去除表皮、脂肪和骨头后使用匀浆机打成肉糜，于-20 ℃保存。
以牛羊肉为基质，向其中加入质量分数分别为0%、0.1%、1.0%、5.0%、10.0%、20.0%、100.0%的猪肉。参考Chen Xiaoyu等[31]的方法进行模拟样品的制备：以牛肉为例，使用高速匀浆机将肉糜状的牛肉（80 g）与猪肉（20 g）间歇性混合5 min，得到猪肉质量分数为20.0%的样品（编号为A1）；将50 g牛肉糜与50 g A1间歇性混合5 min，得到猪肉质量分数为10.0%的样品（编号为A2）；将50 g牛肉糜与50 g A2间歇性混合5 min，得到猪肉质量分数为5.0%的样品（编号为A3）；用上述方法依次制备质量分数为1.0%（A4）、0.1%（A5）的混合肉样。再以同样的方法制备以羊肉为基质的猪肉混合肉样。其中在进行肉糜混合时加入了不影响反应的有色染料，混合至颜色均匀，每组实验设置5 个平行。所有样品保存于-20 ℃备用。
1.3.2 DNA提取
称取100 mg各样品的肉糜及1.3.1节所制备的模拟肉样，使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取肉样DNA。称取玉米淀粉、红薯淀粉、木薯淀粉、绿豆淀粉等样品各200 mg，使用Nucleo Spin®Food试剂盒提取各植物淀粉DNA。提取完成后使用超微量核酸蛋白测定仪测定DNA的浓度和纯度，A260 nm/A280 nm为1.6～2.0可用于LMTIA。所提取的DNA均于-20 ℃保存。
1.3.3 LMTIA引物和Proofman探针设计
根据GenBank数据库中公布的猪源基因，本研究选取猪细胞核中的高度保守序列PRLR（GenBank ID：DQ453511.1）为靶标，将该段序列使用Oligo 7软件进行分析，选取具有梯型熔解温度的片段，再使用Primer 3 Plus在线软件（http://www.primer3plus.com）进行LMTIA引物设计。根据环引物来设计Proofman探针，荧光基团标记在3＇端错配的碱基上，猝灭基团标记在5＇端碱基末端。用于LMTIA的引物序列和Proofman探针序列见表1。引物及探针均由通用生物系统（安徽）有限公司合成。
表1 引物及探针序列
Table 1 Sequences of LMTIA primers and Proofman probe
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1.3.4 反应温度优化
使用10 µL的反应体系进行LMTIA反应温度的优化，反应体系为：1.3 μmol/L引物F、B，0.6 μmol/L引物LF、0.3 μmol/L引物LB和探针、1×通用型LMTIA反应预混液1 μL（20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、10 mmol/L KCl、10 mmol/L (NH4)2SO4、6 mmol/L MgSO4、0.1% TritonTM X-100）、0.32 U/μL Bst DNA聚合酶和2 μL提取的猪肉基因组DNA。反应温度设置为57、58、59、60 ℃，反应条件为90 s采集一次荧光信号，共40 个循环。
1.3.5 灵敏度测定
将提取的猪肉基因组DNA梯度稀释至10、1 ng/μL和100、10、1 pg/μL，测定所建立的Proofman-LMTIA检测方法的灵敏度。由于样品新鲜度、人为因素和DNA降解等原因都有可能造成检测结果不一致，故每次实验进行5 次重复，以保证检测结果的准确性。
1.3.6 特异性分析
以H2O为阴性对照，猪肉基因组DNA为阳性对照，向优化好的LMTIA反应体系中加入从鸡肉、鸭肉、牛肉、羊肉、猫肉、狗肉、玉米淀粉、红薯淀粉、木薯淀粉、绿豆淀粉、小麦粉中提取的基因组DNA，观察扩增结果。
1.3.7 猪肉样品检测限测定
将所提取的猪肉质量分数分别为0%、0.1%、1.0%、5.0%、10.0%、20.0%、100.0%的混合肉样DNA分别加入到优化的Proofman-LMTIA反应体系中，每组实验重复2 次，观察扩增结果。
1.3.8 实际样品猪肉源成分检测
利用本研究建立的Proofman-LMTIA检测方法与实时荧光定量PCR检测方法（猪肉源实时荧光定量PCR检测试剂盒）对市售牛羊肉及其制品进行猪肉源成分检测，对检测结果进行分析比较。
1.4 数据处理
使用Gentier 96E全自动医用PCR分析系统（V1）对检测结果进行分析，获取扩增曲线图，再使用Excel、PowerPoint软件对结果和扩增图进行分析处理。
2 结果与分析
2.1 反应温度优化结果
图2 Proofman-LMTIA反应温度优化结果
Fig. 2 Optimization of Proofman-LMTIA reaction temperature
由图2可知，反应温度对扩增效率的影响较大，在58 ℃和59 ℃时阴性对照不扩增，阳性对照扩增效率最好，结合后续特异性和灵敏度实验选择58 ℃作为Proofman-LMTIA反应体系的最适温度。
2.2 灵敏度测定结果
图3 Proofman-LMTIA灵敏度测定结果Fig. 3 Sensitivity of Proofman-LMTIA assay
使用优化好的反应体系和最适温度对梯度稀释至10、1 ng/μL和100、10、1 pg/μL的猪肉基因组DNA进行测定。由图3可知，10 ng/μL和1 ng/μL的DNA发生扩增，而100、10、1 pg/μL和阴性对照均未出现扩增。因此，该方法对猪基因组DNA的检测灵敏度为1 ng/μL。
2.3 特异性分析结果
图4 Proofman-LMTIA特异性测定结果
Fig. 4 Specificity of the Proofman-LMTIA assay
由图4可知，只有猪DNA发生扩增，其余DNA及阴性对照均未扩增。说明该引物特异性较强，能够区分猪DNA和其他物种DNA，能够进行肉制品中猪源基因的检测。
2.4 猪肉样品检测限测定结果
图5 模拟肉样Proofman-LMTIA测定结果
Fig. 5 Results of Proofman-LMTIA for adulterated meat samples
1～6. 猪肉质量分数分别为100.0%、20.0%、10.0%、5.0%、1.0%、0.1%的混合肉样；7. 阴性对照及猪肉质量分数为0%的混合肉样。
由图5可知，所制备的猪肉质量分数分别为0%、0.1%、1.0%、5.0%、10.0%、20.0%、100.0%的混合模拟肉样在20 个循环数以内只有质量分数为0%的模拟肉样和阴性对照未发生扩增，其余均发生扩增。说明该方法能在30 min之内检出猪肉质量分数为0.1%及以上的掺假样品，即每1 kg肉制品中掺入1 g猪肉也可被检出。
2.5 实际样品检测结果
表2 样品测定结果
Table 2 Results of Proofman-LMTIA and real-time fluorescence quantitative PCR for actual samples
?
用所建立的猪肉源基因Proofman-LMTIA检测方法对24 份市售牛羊肉及其肉制品进行检测，由表2可知，本研究建立的猪肉源Proofman-LMTIA检测方法与实时荧光定量PCR检测方法的检测结果一致，总符合率为100.0%。由于目前样品数量不多，阳性样品检出数较少，后续将增加样品数量以验证2 种方法的一致性。
3 结 论
本研究建立了一种基于Proofman探针的LMTIA方法以检测肉制品中的猪肉源基因，将Proofman探针和超保真酶加入到LMTIA反应体系中，更好地实现了反应的不开盖、可视实时检测。本方法选取猪细胞核中单拷贝的PRLR基因，对所测试的十几种非目标DNA无交叉反应，具有较强的特异性，且可检测到灵敏度为1 ng/μL的猪基因组DNA。对混合模拟肉样的检测，检测限达到0.1%。较其他分子生物学检测方法具有相同或更高的检测限，如TaqMan实时荧光PCR法的检出限为5.0%[32]，可视化LAMP方法的检出限为1%[17]。但目前本研究只能够检测肉制品中的猪肉源成分，无法检测是否掺入鸡鸭肉成分，故还不能得到更好的应用，后续将致力于结合不同的荧光基团，做到高效、快速进行多物种同时检测，早日应用于肉制品掺假的市场监管中。
本研究建立的Proofman-LMTIA检测方法具有操作简单、灵敏度高、特异性强、反应时间短、适用范围广等优点，可作为肉制品掺假快速检测的有效手段，为规范肉制品市场秩序提供技术支持。
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