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TU Xiaohang, LI Pengpeng, BIAN Huan, et al. Differences in volatile components of Procambarus clarkii from different co-culture modes[J]. Meat Research, 2023, 37(12): 32-38. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20240111-008. http://www.rlyj.net.cn
徐为民（1969—）（ORCID: 0000-0003-3114-3162），男，研究员，博士，研究方向为肉品加工与质量控制。E-mail: weiminxu2002@aliyun.com
王道营（1979—）（ORCID: 0000-0003-1776-5854），男，研究员，博士，研究方向为肉品加工与质量控制。E-mail: daoyingwang@yahoo.com
Differences in Volatile Components of Procambarus clarkii from Different Co-culture Modes
克氏原螯虾（Procambarus clarkii）俗称小龙虾，属节肢动物门、甲壳纲、十足目、螯虾科，是我国重要的淡水经济虾类[1]。克氏原螯虾营养丰富，胆固醇含量低，富含赖氨酸、谷氨酸、丙氨酸等多种氨基酸，以及平衡的脂肪酸组成和多种挥发性物质[2-3]。截至2022年，我国克氏原螯虾养殖面积达1.87 km2、产量289.07 万t，同比分别增长7.69%和9.76%，养殖产量首次超过鲫鱼和鲤鱼，产业综合产值达到4 580 亿元[4]。挥发性物质能客观地反映食品的风味特点，是评价食品品质的重要指标，也是被消费者接受的主要因素之一[5]。国内外对克氏原螯虾的研究主要集中在养殖模式、营养价值、副产物利用[6]等方面，但对于其挥发性成分，尤其是不同养殖模式虾肉中挥发性成分的报道较少。徐文思等[7]在小龙虾水煮液中共检出73 种挥发性物质，包括醛类、烃类、酯类等，这些物质对小龙虾水煮液风味起重要作用。Lee等[8]采用气相色谱-嗅闻（gas chromatography-olfactometry，GC-O）技术在熟制美洲龙虾尾肉中检出47 种挥发性物质，其中，2-甲基丁醛、3-辛烯-2-酮、1-(甲硫基)丙醛等8 种挥发性物质对美洲龙虾的风味做出的贡献较大。何珊等[9]在研究新鲜南、北方地区中华绒螯蟹中挥发性物质的差异时，均检出醇类、醛类和碳氢类等挥发性物质，其中乙酸乙酯、1-戊烯-3-醇等物质差异可能是造成两地中华绒螯蟹风味不同的原因。目前，对克氏原螯虾的挥发性风味成分品质的分析报道较少，共养模式对克氏原螯虾风味品质的影响机制也有待研究。
克氏原螯虾的养殖模式多样，主要有稻田养殖、蟹塘养殖、藕塘养殖、池塘主养，其他还有茭白田、泥鳅池、水泥池、大棚精养等养殖模式，稻田养殖是其中的主要模式[10-11]。Xu Qiang等[12]采用生命周期评价方法评估了3 种养殖模式（即单一水稻栽培、虾单一养殖和稻虾共养）对环境影响，研究认为稻虾共养模式可以更低的环境成本提供更多的营养，同时还能提高农民的经济收入。蟹虾、藕虾养殖模式充分利用河蟹第3次蜕壳到第4次蜕壳之间和莲藕叶茎出水后到藕收获之间的间歇开展养殖，在保证主养品种河蟹、藕产量基本不变的前提下，可多收获一定量的小龙虾，从而提高总经济效益[13]。由于地理位置、养殖模式、生产方式等不同，食品中挥发性物质、营养价值可能存在差异，如Kalogiouri等[14]通过顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技术结合层次聚类分析、主成分分析（principal component analysis，PCA），利用稀疏偏最小二乘判别分析建立稳健的分类模型，成功区分常规和有机养殖核桃油。因此，研究不同养殖模式克氏原螯虾肉的挥发性成分，不仅可以为养殖户对克氏原螯虾养殖模式的选择提供一定参考，也可以为消费者对克氏原螯虾的选择提供思路。本研究采用HS-SPME-GC-MS对4 种养殖模式克氏原螯虾肉挥发性成分进行定量分析，并采用PCA和聚类分析法进行综合评价，探讨不同养殖模式之间克氏原螯虾肉挥发性风味成分差异。
克氏原螯虾于2022年8月18日在江苏省兴化市取样，不同养殖模式各选取10 尾（25.00±5.00）g鲜活克氏原螯虾，去壳、取肉后用液氮速冻并于-80 ℃冰箱内贮藏。1 周内完成不同贮藏模式克氏原螯虾HS-SPME-GC-MS检测和分析，样品信息见表1。
表1 不同养殖模式克氏原螯虾样品信息
Table 1 Information on Procambarus clarkiisamples from different culture modes
编号 采样地点 养殖模式 虾种苗情况DX1 兴化市万颗子粮食种植家庭农场 一稻两虾 原池留塘虾DX2 兴化市七里八乡水产生态养殖专业合作社 一稻两虾 放养抱仔虾DX3 兴化市香湖粮食种植家庭农场 一稻一虾（不开沟） 原池留塘虾XX1 兴化市沙沟镇小龙虾协会 虾蟹混养 原池留塘虾XX2 兴化市银桂水产品养殖专业合作社 虾蟹混养 放养虾苗（200 只/kg）OX 兴化市谷满仓家庭农场 藕虾模式 放养抱仔虾
手动SPME进样器（50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纤维头） 美国Supelco公司；TSQ8000EVO GC-MS仪美国Thermo Fisher公司；HH-4数显恒温水浴锅 江苏国华电器有限公司；电热鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；顶空采样瓶 美国安捷伦公司。
1.3.1 样品制备
样品处理：取出样品在4 ℃条件解冻，分别称取3.00 g克氏原螯虾肉于顶空瓶中，每种养殖模式虾肉各取样3 次，加入10 μL 0.05 μg/μL 2-甲基-3庚酮（内标物），密封后，用涡旋仪混匀，60 ℃加热，将肉熟化60 min后，获取顶空成分。
1.3.2 HS-SPME-GC-MS测定挥发性物质
参照韩伟等[15]的方法进行测定。使用前，将萃取头在GC仪进样口处老化1 h。用固相微萃取头在58 ℃条件下顶空吸附50 min，然后分析挥发性化合物。
定性分析：将Xcalibur工作站与NIST 17质谱库标准质谱图对比，将峰高高于底峰3 倍且匹配度最高的成分作为鉴定结果。
定量分析：利用NIST谱图库自动结合手动积分得到的峰面积，根据内标物的添加量，求得各挥发性化合物在克氏原螯虾肉中含量。
通过SPSS 21.0统计软件对6 组养殖模式克氏原螯虾肉中的挥发性成分及其含量进行PCA及聚类分析。
由表2、3可知，6 组养殖模式克氏原螯虾中共检出31 种挥发性成分，包括8 种酮类、3 种酯类、13 种烃类、3 种胺类、2 种醇类、2 种其他物质。DX1、DX2、DX3、XX1、XX2和OX养殖模式分别检出20、20、19、24、18、21 种。
表2 不同养殖克氏原螯虾挥发性成分及含量
Table 2 Volatile components and contents of different cultured Procambarus clarkia ng/g
注：-.未检出；字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。
类别 保留时间/min 化学式 化学名称 DX1 DX2 DX3 XX1 XX2 OX酮类1.95 C3H2Cl4O 1,1,3,3-四氯-2-丙酮 0.04±0.02a - - 0.04±0.02 - 0.09±0.05a 5.84 C7H14O 3-庚酮 1.97±0.97a 1.20±0.58b 1.19±0.16b 1.10±0.12b 1.10±0.12b 0.94±0.30b 7.46 C8H16O 3-甲基-2-庚酮 6.61±0.32ab 6.76±0.90a 5.80±3.37bc 4.50±1.04d - 5.85±0.33c 7.53 C10H20O 3,5-二甲基-2-辛酮 - - 5.23±0.01b 5.20±0.06b - 6.10±0.43a 7.96 C8H16O 4-辛酮 2.74±0.75a 2.10±0.37a 2.39±0.87a 1.91±0.33a 1.90±0.17a 2.20±1.47a 8.02 C9H18O 2,4-二甲基-3-庚酮 2.99±0.42a 2.20±0.35ab 0.89±0.85c 2.00±0.42b 1.77±0.16b 1.60±0.09bc 10.39 C9H18O 5-壬酮 3.21±0.24a 2.47±0.38b 0.85±0.45c 2.70±0.32ab 2.40±0.07b 0.79±1.18c 10.88 C9H18O 2-壬酮 - - - - - 0.09±0.02a酯类烃类胺类10.70 C11H20O 4-羟基-4-甲基-5-己烯酸叔丁酯 - - - - 0.05±0.02a 0.05±0.01ab 27.84 C17H34O2 十六烷酸甲酯 0.18±0.10a 0.11±0.02ab 0.05±0.02b 0.17±0.03a 0.08±0.04ab 0.11±0.50ab 28.22 C18H28O3苯丙酸,3,5-双(1,1-二甲基乙基)-4-羟基甲酯 - - - - 0.06±0.04a 0.03±0.10a 2.21 C6H6 苯 0.06±0.03d 0.24±0.12c 0.56±0.28a 0.08±0.05d - 0.38±0.22b 3.53 C7H8 甲苯 0.38±0.16a 0.22±0.03b 0.19±0.01b 0.20±0.01b 0.18±0.02b 0.20±0.12b 5.31 C8H10 乙苯 - - - 0.05±0.03b 0.18±0.11a -5.46 C8H10 邻二甲苯 0.32±0.16bc 0.20±0.03bc 0.67±0.35a 0.16±0.09ab - -7.79 C9H12 1-乙基-4-甲基苯 0.32±0.18c 0.51±0.29ab - 0.57±0.10a 0.41±0.24bc 0.42±0.56bc 7.89 C9H12 1,2,3-三甲基苯 9.89±0.45a 7.75±0.86ab 2.00±0.03d 6.89±0.53bc 7.13±0.77c 5.65±2.75bc 8.16 C10H20 2,6-二甲基-4-辛烯 1.98±0.79a 1.21±0.28b 0.66±0.20d 0.91±0.06cd 1.12±0.06bc 1.02±0.48bc 8.45 C9H12 1-乙基-4-甲基苯 2.37±0.63a 1.11±0.10b 0.20±0.35c 0.94±0.17b 1.07±0.18bc 1.02±0.59bc 8.77 C10H14 2-甲基丙基苯 0.33±0.19a 0.31±0.18ab 0.13±0.03cd 0.12±0.05d 0.23±0.04bc -9.15 C10H14 1-甲基-3-(1-甲基乙基)苯 - - - 0.10±0.06a - -11.01 C11H24 十一烷 - 0.25±0.02a 0.18±0.02b 0.21±0.02bc 0.22±0.01bc 0.18±0.08bc 14.77 C11H24O4 1,1,3,3-四乙氧基丙烷 - - 0.15±0.07a - - -17.96 C14H30 十四烷 - - - 0.08±0.04a - -1.25 C4H10N2 对-α-二甲基苯乙胺 0.61±0.32a 0.31±0.13bc 0.26±0.03cd 0.35±0.06c 0.51±0.04b 0.18±0.16d 1.40 C9H11F2NO3 2,5-二氟-β,3,4-三羟基-N-甲基苯乙胺 0.22±0.39c - 0.48±0.27a 0.23±0.04c 0.37±0.08b 0.37±0.14b 1.46 C9H11F2NO3 乙酰胺,N-甲基-N-[4-[4-氟-1-六氢吡啶基]-2-丁炔基]-乙酰胺 - 0.25±0.18b - - - 0.32±0.16a醇类 8.82 C4H10O 2-甲基-2-丙醇 - 2.20±1.56a - - - -17.79 C16H34O 1-十六烷醇 0.29±0.19a 0.13±0.00b 0.09±0.03bc 0.09±0.02bc 0.16±0.03b -其他 1.79 C6H12N2O4S2 胱氨酸 0.06±0.03a - - - - -20.50 C14H22O 2,4-二叔丁基苯酚 0.12±0.08a 0.07±0.04b 0.06±0.03b 0.04±0.03c - -
表3 不同养殖模式克氏原螯虾挥发性成分分类比较
Table 3 Comparison of the composition of volatile components of Procambarus clarkii in different culture modes
类别 DX1 DX2 DX3 XX1 XX2 OX含量/（ng/g） 数量 含量/（ng/g） 数量 含量/（ng/g） 数量 含量/（ng/g） 数量 含量/（ng/g） 数量 含量/（ng/g） 数量酮类 17.56±1.62a 6 14.73±2.17b 5 16.35±1.05a 6 17.45±2.07a 7 7.17±0.04c 4 17.66±0.36a 8酯类 0.18±0.14a 1 0.11±0.01b 1 0.05±0.04c 1 0.17±0.05ab 1 0.19±0.06a 3 0.19±0.51a 3烃类 15.65±2.24a 8 11.80±1.65b 9 4.74±2.58bc 8 10.31±0.97bc 12 10.54±1.09c 8 8.87±0.69d 7胺类 0.83±0.60a 2 0.56±0.26b 2 0.74±0.23ab 2 0.58±0.24b 2 0.88±0.07a 2 0.87±0.27a 3醇类 0.29±0.19b 1 2.33±1.28a 2 0.09±0.07b 1 0.09±0.11b 1 0.16±0.15b 1 0.00±0.00b 0其他 0.18±0.10a 2 0.07±0.04b 1 0.06±0.03b 1 0.04±0.03b 1 0.00±0.00c 0 0.00±0.00c 0
酮类是食品中一类重要的挥发性物质，通常阈值较低，对食品的风味有一定贡献[16]。酮类挥发物通常来源于脂质氧化、烷烃降解和美拉德反应[17]。2-壬酮常被认为是甲壳类水产养殖产品中的有利挥发性风味物质，具有浓郁的果香且阈值较低[18]，可能是克氏原螯虾肉中关键风味物质。由表2～3可知，酮类物质在6 组养殖模式克氏原螯虾肉中挥发性物质的种类和含量都存在显著差异（P＜0.05），DX1、DX2、DX3、XX1、XX2、OX养殖模式的克氏原螯虾肉中的种类和含量分别为6（17.56 ng/g）、5（14.73 ng/g）、6（16.35 ng/g）、7（17.45 ng/g）、4 种（7.17 ng/g）和8 种（17.66 ng/g）。3-庚酮、4-辛酮、2,4-二甲基-3-庚酮、5-壬酮是6 组养殖模式克氏原螯虾肉中的共有挥发性酮类物质，而3,5-二甲基-2-辛酮仅在DX3、XX1、OX养殖模式的克氏原螯虾肉中存在，且含量较高，可能是造成不同养殖模式克氏原螯虾风味不同的原因。
酯类物质通常是由脂肪或蛋白质降解引起的醇和酸之间的酯化反应产生，或来自乙醇中甘油三酯、脂肪酸和酯之间的醇解反应，通常具有花香和果香，可减弱脂肪酸的刺激性气味和苦味氨基酸的风味，酯类化合物阈值较低，通常对食品风味的贡献较大[19-20]。在本研究6 组养殖模式中，除DX2（0.11 ng/g）和DX3（0.05 ng/g）外，DX1、XX1、XX2、OX养殖模式的克氏原螯虾肉中挥发性物质含量相差不大，分别为0.18、0.17、0.19、0.19 ng/g。十六烷酸甲酯是唯一一种在6 组养殖模式克氏原螯虾肉中均存在的挥发性物质。
31 种挥发性化合物中烃类物质种类最多，DX1、DX2、DX3、XX1、XX2、OX养殖模式克氏原螯虾肉中挥发性物质分别为8、9、8、12、8、7 种，含量分别为15.65、11.80、4.74、10.31、10.54、8.87 ng/g。烃类通常是由脂肪酸烷氧自由基均裂产生，其阈值较高，对食品风味贡献较小[21]。烯烃类物质通过加成、缩合等反应可以形成酮类和醇类，是克氏原螯虾产生腥味的潜在因素[22]。但王惠惠等[23]认为此类物质可作为醛类、酮类的前体物质，有助于促进肉产品风味的形成。1-甲基-3-(1-甲基乙基)苯、十四烷仅在XX1养殖模式中检测到，这可能是引起XX1与其他模式克氏原螯虾肉风味不同的原因。除1,1,3,3-四乙氧基丙烷仅在DX3养殖模式检测到外，其他烃类物质的种类差异较小，仅在含量方面表现较大差异。
醇类物质主要来源于脂肪氧化、氨基酸还原和碳水化合物的代谢[24]。部分醇类具有花香和果香，主要由相应醛的还原产生，仅在含量高时才被感知，对食品风味贡献较小[25]。朱青云等[26]研究青海牦牛肉的挥发性风味品质时，认为醇类阈值较高，对青海牦牛肉的挥发性风味品质贡献不大。除DX2养殖模式，醇类在其余5 种养殖模式小龙虾肉中的挥发性物质含量差异不显著，且仅在DX2养殖模式的克氏原螯虾肉中检出2 种醇类化合物，其含量为2.33 ng/g；DX1、DX3、XX1、XX2养殖模式的克氏原螯虾肉中均含有1 种挥发性物质，而OX养殖模式的克氏原螯虾肉中未检出醇类物质。
检出的挥发性化合物中胺类物质占比较小，总量为0.56～0.88 ng/g。6 组养殖模式中除OX养殖模式的克氏原螯虾外（3 种），其他养殖模式的克氏原螯虾肉中都含有2 种胺类物质。
主成分碎石图曲线的陡峭程度可以反映各成分的变化趋势，进而明确主成分的提取数量[27]。一般来说，高质量PCA模型中前2 个PC的累计贡献率应在60%以上[28]。由图1可知，前3 个PC的特征值呈快速下降趋势，且从第4个PC特征值开始，碎石图曲线趋于平缓。由表4可知，3 个PC的特征值分别为14.81、7.17、2.98，均大于1，累计贡献率为96.01%，能够准确反映6 组养殖模式克氏原螯虾肉挥发性风味的整体状况。因此，选取前3 个P C 作为本研究中6 组养殖模式克氏原螯虾肉中挥发性成分评价的分析指标。
图1 不同养殖模式克氏原螯虾挥发性成分碎石图
Fig. 1 Scree plot of volatile components of Procambarus clarkii in different culture modes
表4 不同养殖模式克氏原螯虾主成分结果
Table 4 Eigenvalues and contribution rates of principal components for Procambarus clarkii in different culture modes
PC 特征值 贡献率/% 累计贡献率/%PC1 14.81 56.97 56.97 PC2 7.17 27.58 84.55 PC3 2.98 11.46 96.01
PCA作为一种多元统计分析技术被广泛用于样本变异分析，能够简化数据并揭示不同样本之间的相互关系，这种分析涉及描述样本之间的无监督分类趋势[29-30]。PCA首先对得到的数据进行标准化处理，进而便于对6 组样品间的相似性和差异性进行科学准确评价。Gewers[31]、罗杨[32]等认为PCA中样品之间距离近则代表差异小，距离远则代表差异明显。如图2所示，各组样品均被分开且无任何重叠，表明各组样品在挥发性成分上皆存在差异，通过PCA分析，6 组养殖模式的克氏原螯虾肉中的挥发性成分得到较好的区分，且重复性较好。
图2 不同养殖模式的克氏原螯虾肉挥发性成分的PCA得分图
Fig. 2 PCA score plot of volatile components of Procambarus clarkii meat from different farming modes
以3 个PC为初始自变量，经PCA计算因子得分，再根据因子得分系数矩阵和每个PC的特征值得出克氏原螯虾肉中挥发性成分前3 个PC线性关系分别为：
式中：X1～X31代表不同养殖模式克氏原螯虾肉中所检出的31 种挥发性成分。
根据所提取PC对应的方差相对贡献率作为权重，对3 个PC得分进行权重加和，建立综合评价函数F＝0.569F1+0.278F2+0.115F3，计算各组综合得分，分值越高表明克氏原螯虾的挥发性风味成分品质越好。如表5所示，6 组养殖模克氏原螯虾肉中DX1养殖模式的得分最高，挥发性风味品质最好，其后依次为DX2、XX2、XX1、DX3、OX。
表5 不同养殖模式克氏原螯虾PCA和综合得分
Table 5 PCA and comprehensive scores of Procambarus clarkii in different culture modes
养殖模式 F1得分 F2得分 F3得分 综合得分 排名DX1 0.73 0.79 1.22 0.77 1 DX2 0.40 0.71 -0.83 0.33 2 XX2 -0.03 -0.03 -1.11 -0.15 3 XX1 -0.54 0.65 -0.35 -0.17 4 DX3 0.67 -2.2 0.05 -0.22 5 OX -1.23 0.08 1.03 -0.56 6
分层聚类是聚类过程中常用的方法，期取代聚类样本中个体与距离的关系，并将距离相近的样本归入一类，重复此过程以完成聚类[33]。如图3所示，6 组克氏原螯虾养殖模式分为5 类，DX1、DX2、DX3、XX1养殖模式为一类，XX2和OX养殖模式为一类。DX1养殖模式克氏原螯虾肉中酮类物质、烃类物质含量较高，品质最好；DX2养殖模式的克氏原螯虾品质较好，腥味胺类物质含量最低；DX3品质较差。挥发性物质可分为4 类，酮类单独为一类，酮类阈值较低，含量较高与其他挥发性物质的相关性较强；酯类与胺类物质聚为一类；醇类单独为一类；烃类和其他聚为一类，二者阈值较高，但与其他物质相关性较强。聚类分析与PCA结果较为相似，可以较为准确体现6 组养殖模式克氏原螯虾肉的挥发性风味成分品质差异。
图3 不同养殖模式克氏原螯虾的挥发性成分的聚类分析热图
Fig. 3 Heatmap of cluster analysis of volatile components of Procambarus clarkii from different culture modes
通过HS-SPME-GC-MS技术检测分析江苏省兴化地区不同养殖模式克氏原螯虾肉中的挥发性物质，共检出31 种挥发性物质，包括8 种酮类、3 种酯类、13 种烃类、3 种胺类、2 种醇类、2 种其他，其中挥发性物质含量最多的是DX1（34.69 ng/g）。主要呈味物质酮类和酯类的总含量在OX养殖模式中最高（17.85 ng/g），在XX2模式中含量最低（7.36 ng/g）。利用PCA建立综合评价模型，结果表明，DX1养殖模式挥发性风味成分品质最好，OX养殖模式的克氏原螯虾肉挥发性风味成分品质较差。聚类分析将不同养殖模式分为5 类，挥发性物质分为4 类，与PCA结果结合较好地体现了不同养殖模式的克氏原螯虾肉挥发性风味品质的差异性。综上所述，一稻两虾养殖模式的克氏原螯虾挥发性风味品质最好，藕虾养殖模式较差。本研究为建立优质克氏原螯虾的养殖模式提供一定的基础；此外，为建立优质克氏原螯虾的养殖模式提供更全面的指导，还需要结合克氏原螯虾肉的其他品质性质进行综合分析。
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