低温肉制品是指在常压下通过蒸、煮、熏、烤等热处理，使中心温度达到75～85 ℃的肉制品[1]。与高温肉制品相比，低温肉制品能够保持原料肉固有的组织结构，使其肉质紧实有弹性，同时具有较高的蛋白消化率，符合现代人对健康饮食的需求。然而，由于产品杀菌温度较低且含有丰富的蛋白质和脂肪，在运输、贮藏过程中极易造成微生物污染、氧化变质，使产品品质和营养价值严重下降，通常表现为风味恶化、产品变色[2-4]。因此，寻找控制肉制品贮藏中微生物污染和蛋白质氧化的有效方法非常必要[5]。
多酚因其来源广泛、抗氧化性和抑菌性突出被认为是最有前景的一类天然防腐添加剂和抗氧化剂，已在肉制品品质提升相关研究中被大量报道。褐藻是一种富含酚类物质的大型海藻，具有多种生物活性，如抗氧化、抗肿瘤、抑菌等[6]。褐藻多酚（phlorotannins，PT）是褐藻次级代谢产生的以间苯三酚为结构单元的聚合物[7]。目前，已有不少PT抗氧化性和抑菌性的评估，如Cui Xin等[8]发现海带发酵液具有显著的抗氧化活性。卢虹玉等[9]通过溶剂萃取和超滤方法提取4 种PT，并证实其具有显著的抗氧化作用。李静等[10]发现海带中的PT对哈维氏弧菌和溶藻弧菌有明显的抑制效果。许多种类多酚因具有良好的抗氧化和抑菌性活性被应用在肉制品中[11-17]，其中有不少关于PT在肉制品中的应用，如Wang Tiantian等[18]研究PT、α-生育酚和抗坏血酸对红鲷鱼在-18 ℃冷冻90 d后脂质和蛋白质氧化及质构特性的影响，发现PT和α-生育酚显著降低硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值，有效抑制蛋白质和脂质氧化。林娇芬等[19]发现海带多酚提取物可以显著延缓对虾TBARs值的上升，降低腐败劣变的速度。Cox等[20]将海藻添加到肉饼中，发现能够抑制肉饼氧化的发生及细菌的生长，感官可接受程度高。以上研究表明，PT作为抗氧化剂添加到食品中具有良好的应用前景，但添加到低温肉制品中的研究鲜有报道。
加速贮藏实验（accelerated shelf-life testing，ASLT）被广泛应用于食品行业，通过模拟食品在不同环境下的变化，评估食品加速贮藏过程中的品质降低和保质期变化。相对于常温保质期模拟测试方法，ASLT具有周期短、效率高的特点，现已广泛应用于多种耐贮藏食物[21-23]。黄梅香等[24]通过ASLT模型，于37、32、27 ℃下推测低钠盐火腿肠在室温25 ℃和低温4 ℃的保质期。符锋等[25]利用ASLT模型，预测了52、62 ℃下自热菜肴竹笋肌肉在25 ℃的保质期。因此，本研究采用ASLT方法，以低温火腿肠为食品加工模型，分别添加0.02%、0.10%质量分数的PT，从感官评价、TBARs值、菌落总数、电子鼻四个方面分析低温火腿肠在贮藏期间的品质变化规律，并依照化学动力学原理进行保质期预测，以期为PT在低温肉制品的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜猪瘦肉、肥膘、玉米淀粉、食盐、白糖、味精、生姜粉、胡椒粉、花椒粉、卡拉胶、复合磷酸盐、红曲红 青岛市市北区开平路农贸市场。
PT 陕西帕尼尔生物科技有限公司；硫代巴比妥酸、无水乙醇、氯化钠、三氯乙酸、氯仿 上海麦克林生化科技有限公司；所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
Spark 20M酶标仪 瑞士Tecan公司；HD-3A水分活度仪 无锡市华科仪器仪表有限公司；PEN3型电子鼻德国Airsense仪器公司；FCD-3000电热鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司；FSH-2高速匀浆机 常州国华电器有限公司；Happy-TL20台式高速冷冻离心机济南福的机械有限公司；FA1004B电子天平 上海佑科仪器仪表有限公司。
1.3 方法
1.3.1 低温火腿的制备
参考张俊等[23]低温火腿肠配方并适当修改，具体配方（所有调味料添加量以猪肉的总质量为基准）如下：对照组：猪瘦肉70%、肥肉30%、玉米淀粉6%、大豆分离蛋白3%、复合磷酸盐0.4%、食盐2%、卡拉胶0.4%、白糖1.5%、冰水25%、其他调味料0.8%（味精、生姜粉、胡椒粉、花椒粉）、红曲红0.3%。实验组：分别添加0.02%和0.10%质量分数的PT，其余材料同对照组。
工艺流程：原料肉预处理→搅拌、腌制（4 ℃、24 h）→斩拌→灌肠封口→蒸煮灭菌→冷却→成品→贮藏
操作要点：1）搅拌、腌制：瘦肉用食盐、复合磷酸盐、糖、5%冰水混合腌制；肥肉用食盐腌制。搅拌过程中控制温度于10 ℃左右，搅拌完成的肉糜置于容器中，排尽表面气泡，置于4 ℃冰箱腌制24 h。2）斩拌：先后在肉糜中加入玉米淀粉、大豆分离蛋白、卡拉胶、白糖、香辛料及红曲红进行手动搅拌，玉米淀粉加水分散后加入，卡拉胶用热水融化冷却后加入，斩拌过程中加入冰水。3）蒸煮杀菌：将灌装完成的低温火腿肠置于沸水浴中恒温蒸煮30 min，保持火腿肠中心温度在75～85 ℃[26]。
1.3.2 感官评价
由10 名专业人士组成感官评价小组，对低温火腿肠的色泽、外观状态、组织状态、气味4 项指标进行分项评分，计算总和与均值。每项指标分3 个等级。低温火腿肠感官评分标准如表1所示。
表1 低温火腿肠感官评价评分规则[23]
Table 1 Criteria for sensory evaluation of low-temperature sausage[23]
项目评分标准评分色泽色泽均匀、无变色，光泽感明显色泽基本均匀、少许变色，光泽感较差色泽过深或过浅，缺乏光泽17～25 8～16 0～7外观形态外观光滑、无出水、出油、涨袋现象，无霉斑外观较光滑、少许出水、出油，有涨袋现象，有少许霉斑外观有出水、出油、涨袋现象，有霉斑17～25 8～16 0～7组织状态组织紧密，无明显杂质，无密集气孔，切片性好组织较紧密，略有杂质，略有气孔，切片性良好组织不紧密，杂质明显，影响成型，气孔多，切片性差17～25 8～16 0～7气味具有特有的肉香味，无异味肉香味较明显，有少许异味肉香味不明显，异味明显17～25 8～16 0～7
1.3.3 TBARs值测定
参照GB 5009.181ü2016《食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定》的方法测定TBARs值。
1.3.4 电子鼻检测
测定3 组低温火腿肠的整体气味特征，电子鼻传感器响应类型见表2。取切碎后的待测样品1 g于棕色计量瓶中，加入5 mL饱和氯化钠溶液，捣碎后盖上盖子，用封口膜封好防止漏气，在40 ℃下加热10 min。电子鼻参数：以洁净干燥空气为载气，气体流量150 mL/s，平衡温度40 ℃，数据采集时间200 s，延滞时间250 s。测试下一个样品前，进行150 s的清洁程序，直到传感器信号返回基线，每个样品重复测定3 次。
表2 电子鼻化学传感器及其主要响应的物质
Table 2 Performance descriptions of electronic nose chemical sensors
序列号传感器性能描述标准物质（检测限/（mg/kg））1W1C对芳香族有机物灵敏甲苯（10）2W5S对氮氧化物灵敏NO2（1）3W3C对胺类、芳香成分灵敏苯（10）4W6S对氢化物有选择性H2（0.1）5W5C对短链烷烃灵敏丙烷（1）6W1S对甲基类灵敏CH4（100）7W1W对无机硫化物灵敏H2S（1）8W2S对醇类、醛酮类灵敏CO（100）9W2W对芳香成分、有机硫化物灵敏H2S（1）10W3S用于高浓度烷烃检测CH3（10）阵列
1.3.5 菌落总数测定
参照GB 4789.2ü2010《食品微生物学检验 菌落总数测定》的方法测定菌落总数。
1.3.6 加速贮藏实验及保持期预测
参考双实验温度法[27]，将3 组不同添加量PT的低温火腿肠置于恒温培养箱中。通常情况下，温度每上升5 ℃，火腿肠的劣变现象会发生显著性变化。因此，分别于32 ℃（T1）和37 ℃（T2）下进行贮藏。以处理当天为计时起点第0天，分别在37 ℃下第0、2、4、6、8、10、12、14天和32 ℃下第3、6、9、12、15、18天定期测定低温火腿肠的各项指标。
根据ASLT模型，进行保质期预测。根据每组样品在特定温度下的保存时间，按式（1）计算温度相差5 ℃时货架寿命的比值（Q5）。
式中：T1为确定货架期的已知温度点；T2为所求货架期的温度点；f1、f2分别为在温度T1、T2条件下的货架期。
同时，在低于最高实验温度的任何温度条件下，2 次测试的时间间隔按式（2）计算：
式中：t1为较低实验温度T1时每次测试之间的时间间隔/d；t2为最高实验温度T2时每次测试之间的时间间隔/d；ΔT＝T1-T2。
根据每个样品在温度相差5 ℃下的保存时间计算Q5，得到式（3）：
将T1＝37 ℃、T2＝4 ℃代入式（1）可得式（4），在低温4 ℃条件下样品的保质期按式（4）计算：
1.4 数据处理
实验重复测定3 次，结果以平均值±标准差表示，采用Origin 2018软件作图。使用SPSS软件进行显著性分析和Pearson相关性分析，差异显著性水平为P＜0.05，使用Winmuster软件处理电子鼻分析数据。
2 结果与分析
2.1 低温火腿肠的品质变化
2.1.1 不同PT添加量对低温火腿肠感官评价的影响
在贮藏期间，影响肉制品感官品质的因素复杂，如蛋白水解、脂肪氧化、化学氧化等[28]。如图1所示， 37 ℃和32 ℃贮藏初期，3 组低温火腿肠感官评分差异不显著（P＞0.05）。随贮藏时间的延长，低温火腿肠表面发黏，颜色变深，逐渐出现酸败味等现象，导致嫩度变差，脂质氧化蛋白质水解，整体评分下降，其中对照组较为明显，且在第8天时感官评分已不可接受（55.67f2.14）。37 ℃下贮藏第2、6、8天和32 ℃下贮藏第6、9、15天时，对照组的感官评分显著低于PT组（P＜0.05）。与未贮藏时相比，在37、32 ℃贮藏最后1 d（贮藏14 d和18 d），对照组、0.02% PT组、0.10% PT组的感官评分分别降低57.00%、56.34%、52.63%和52.26%、49.53%、40.37%。以上结果表明，在贮藏后期，PT能延缓低温火腿肠感官品质的下降。这与石长波等[29]在火腿肠中添加儿茶素大豆分离蛋白复合物后，贮藏期间感官评分大于对照组的结果一致。
图1 不同多褐藻酚添加量对低温火腿肠感官评分的影响
Fig. 1 Effect of different PT supplementation levels on sensory score of low-temperature sausage
2.1.2 不同PT添加量对低温火腿肠脂质氧化的影响
肉制品中含有丰富的脂肪，因而极易发生自由基链式反应（脂肪自动氧化），产生低级醛酮类物质。TBARs值可以反映肉制品氧化酸败的程度，随着脂肪氧化程度的增加，产生的TBARs混合物不断增多，TBARs值随之增大[30-31]。如图2所示，随着贮藏时间的延长，低温火腿肠的TBARs值呈显著上升趋势（P＜0.05），且对照组的TBARs值增长速率显著高于PT组（P＜0.05）。未贮藏时，3 组样品的TBARs值差异不显著。第6天开始，对照组的TBARs值显著高于PT组（P＜0.05）。与贮藏末期对照组相比，在37 ℃和32 ℃贮藏最后1 d时，0.02% PT组和0.10% PT组的TBARs值分别降低13.02%、24.83%、19.36%和32.18%，说明PT能有效抑制火腿肠脂肪氧化，且抑制程度呈明显的量效关系。其原因可能是PT分子中具有大量羟基，与自由基相互结合，并能与Cu2+、Fe3+、Al3+等对食品氧化具有催化作用的金属离子形成稳定的络合物，从而抑制和延缓低温火腿肠氧化变质，使其保持更好的品质。这与Nicorescu等[32]在火腿肠中添加玫瑰果多酚后TBARs值增长的速率小于未添加组的结果一致。
图2 不同PT添加量对低温火腿肠TBARs值的影响
Fig. 2 Effect of different PT supplementation levels on TBARs value of low-temperature sausage
2.1.3 不同PT添加量的低温火腿肠的电子鼻分析
如图3所示，3 组样品W1W、W2W、W1S、W2S传感器的响应值增加幅度较大，且W2W的响应值随着贮藏时间的延长呈现上升趋势，在第8天响应值陡然增加（P＜0.05），贮藏最后1 d时，对照组、0.02% PT组、0.10% PT组在贮藏温度为37 ℃时W1W最大，分别为7.996 0、7.466 8、7.423 4，32 ℃时W1W最大值为8.212 9、7.409 9、7.383 7。W1W和W2W均可检测出硫化物，说明3 组样品在贮藏过程中产生了挥发性硫化物，但添加PT后硫化物减少。肉制品在贮藏过程中蛋白质会因受到微生物的作用而被水解产生H2S，例如大肠杆菌在有氧条件下能利用葡萄糖和6-磷酸葡萄糖作为底物，分解氨基酸产生H2S等挥发性含硫化合物[33]。相比于对照组，PT组W1S和W2S响应值降低，W1S和W2S传感器可以检测在贮藏过程中因脂肪氧化生成的小分子醇类、醛酮类化合物，说明添加PT后提高了低温火腿肠中醇类、醛酮类化合物挥发性物质的含量，并随着添加量的增加而增加，所得结果与TBARs值的变化情况吻合。
图3 37 ℃和32 ℃下PT低温火腿肠电子鼻雷达图
Fig. 3 Radar plots of electron nose response for low-temperature sausage stored at 37 or 32 ℃
2.1.4 不同PT添加量的低温火腿肠主成分分析（principal component analysis，PCA）
PCA通过将测定样品多个指标的维度和数据转换成特征向量并进行线性分析使得到的数据直观性和可视性增加，PCA散点图以更简洁明了的方式呈现出数据间的联系性[34]。图4A表示37 ℃下对照组、0.02% PT组、0.10% PT的低温火腿肠在第0天时PCA散点图。PC1的贡献率为87.9%，PC2的贡献率为9.8%，累计贡献率为97.7%，表明2 个主成分基本可以代表样品的主要信息特征。PT的添加对低温火腿肠的挥发性气味造成一定影响，但3 组样品的数据点在PCA图中的分布较为集中，气味差别较小，说明在第0天火腿肠气味没有明显变化，PCA中气味相近。图4B表示37 ℃下低温火腿肠在第8天时的PCA散点图。其中PC1贡献率为59.7%，PC2贡献率为25.9%，累计贡献率为85.6%，表明2 个主成分基本可以代表样品的主要信息特征。从分布区域看，PT组的数据点分布较为集中，且有重合部分，说明二者整体气味轮廓相近，不能从气味上较好地区分。对照组的数据点主要分布在右上区域，距离其他样品较远，说明PT组和对照组能够明显区分。图4C表示37 ℃下低温火腿肠在第14天时的PCA散点图。其中PC1贡献率为65.4%，PC2贡献率为18.1%，累计总贡献率为83.5%。从分布区域看，PT组数据点相距较近，二者与对照组相距较远，3 组样品数据点无重合区域，因此利用电子鼻对3 组样品进行区分效果较好。综上所述，3 个组分别聚类在PCA图中不同位置，0.02% PT组和0.10% PT组在第0、8天的聚类有部分重叠，说明二者差异不显著。图4D、E分别为32 ℃下第6天和第18天的低温火腿肠电子鼻气味PCA图。第6天时，0.02% PT组和0.10% PT组相距较近；第18天时，3 组样品之间距离较远。此外，第6、18天时3 组样品无重叠区域，可以明显区分。
图4 不同PT添加量的低温火腿肠电子鼻PCA分析
Fig. 4 PCA plots of low-temperature sausage with different PT supplementation levels based on the electronic nose signals
2.1.5 不同PT添加量对低温火腿肠菌落总数的影响
肉制品腐败变质的主要因素是由于贮藏过程中微生物数量的变化，菌落总数是衡量食品腐败变质的重要指标[28]。由图5可知，随着贮藏时间的延长，低温火腿肠的菌落总数呈显著上升趋势（P＜0.05），且贮藏温度越高，菌落总数增长越快。贮藏初期，3 组样品的菌落总数已有显著差异（P＜0.05）。随着PT添加量的增加，菌落总数增长速率显著减小，而对照组菌落总数增长速率最快，且贮藏最后1 d，37、32 ℃下菌落总数分别为（8.23f0.01）、（7.12f0.02）（lg（CFU/g）），且32 ℃贮藏时菌落总数增长速率明显低于37 ℃。根据GB 2726ü2016《食品安全国家标准 熟肉制品》[35]中菌落总数最高安全限量为5（lg（CFU/g）），对照组、0.02% PT组、0.10% PT组在37 ℃下的菌落总数分别于第8、10、12天超标，在32 ℃下的菌落总数分别于第12、15、18天超标。在贮藏过程中蛋白质、糖类和脂类逐渐降解为小分子物质，为部分微生物提供营养来源，从而促进微生物不断繁殖。上述研究结果表明，PT具有较好的抑菌性，且PT的使用量与抑制微生物繁殖呈明显的量效关系。PT的添加有利于延长低温火腿肠的保质期。这与陈雨晴等[36]以石莼多酚为保鲜剂添加到猪肉丸中结果类似，多酚添加组延长了保质期，尤其是多酚添加量与保鲜效果呈明显的量效关系。
图5 不同PT添加量对低温火腿肠菌落总数的影响
Fig. 5 Effect of different PT supplementation levels on TVC of low-temperature sausage
2.2 不同PT添加量低温火腿肠的保质期预测
2.2.1 不同温度贮藏期间理化指标与感官评分的相关性分析
对不同PT添加量低温火腿肠在不同温度贮藏期间各理化指标与感官评分间进行Pearson相关性分析，Pearson相关系数绝对值越大，表明二者之间的相关性越高。由表3～5可知，低温火腿肠的感官评分与TBARs值、菌落总数之间的Pearson相关系数均大于0.92，说明指标间相关性较好。在所有相关检测指标中，菌落总数与感官评分之间的相关性较其他指标更高，具有极显著负相关，在32、37 ℃条件下对照组、0.02% PT组和0.10% PT组的相关系数分别为0.980、0.946、0.984、0.959、0.985、0.984；因此，将菌落总数作为低温火腿肠品质变化和保质期动力学预测模型的关键指标。
表3 对照组低温火腿肠在不同温度贮藏期间各指标间的Pearson相关系数
Table 3 Pearson’s correlation coefficients between electronic nose sensor signals and quality indicators for low-temperature sausage in the control group during storage at different temperatures
注：*. 相关性显著（P＜0.05）；**. 相关性极显著（P＜0.01）。下同。
温度/℃指标TBARs值菌落总数W1WW2WW1SW2S感官评分37 TBARs值10.962**0.874**-0.237-0.0370.216-0.913**菌落总数10.901**-0.0090.1920.460-0.959**W1W10.0560.1000.404-0.895**W2W10.5650.706-0.015 W1S10.891**-0.142 W2S1-0.471感官评分1 32 TBARs值10.981**0.897**0.4230.7280.639-0.949**菌落总数10.914**0.4180.7420.679-0.980**W1W10.5010.784*0.782*-0.946**W2W10.850*0.854*-0.391 W1S10.977**-0.738 W2S1-0.702感官评分1
表4 0.02%PT组低温火腿肠在不同温度贮藏期间各指标间的Pearson相关系数
Table 4 Pearson’s correlation coefficients between electronic nose sensor signals and quality indicators for low-temperature sausage in the 0.02% PT group during storage at different temperatures
温度/℃指标TBARs值菌落总数W1WW2WW1SW2S感官评分37 TBARs值10.980**0.929**0.865**0.3690.411-0.934**菌落总数10.939**0.830*0.4800.536-0.985**W1W1 0.942**0.6590.685-0.933**W2W10.5160.532-0.787*W1S10.981**-0.586 W2S1-0.650感官评分1 32 TBARs值10.979**0.966**0.5110.5860.601-0.933**菌落总数10.936**0.6120.5730.586-0.946**W1W10.5500.4550.470-0.851*W2W10.3500.382-0.381 W1S10.996**-0.595 W2S1-0.612感官评分1
表5 0.10%PT组低温火腿肠在不同温度贮藏期间各指标间的Pearson相关系数
Table 5 Pearson’s correlation coefficients between electronic nose sensor signals and quality indicators for low-temperature sausage in the 0.10% PT group during storage at different temperatures
温度/℃指标TBARs值菌落总数W1WW2WW1SW2S感官评分37 TBARs值10.949**0.5090.727*0.5120.529-0.929**菌落总数10.4810.6290.6700.686-0.984**W1W10.5440.4340.419-0.437 W2W10.1830.209-0.610 W1S10.991**-0.613 W2S1-0.614感官评分1 32 TBARs值10.938**0.891**0.4460.4930.546-0.932**菌落总数10.962**0.5910.7080.742-0.984**W1W10.7420.817*0.843*-0.909**W2W10.7340.707-0.536 W1S10.996**-0.594 W2S1-0.628感官评分1
2.2.2 保质期预测
根据GB 2726ü2016中菌落总数最高安全限量5（lg（CFU/g））[35]，确定PT添加量为0%、0.02%、0.10%复合低温火腿肠在37 ℃下的保质期分别为6、8、10 d，在32 ℃下的保质期分别为9、12、15 d。根据公式（4）可得到对照组、0.02% PT组、0.10% PT组低温火腿肠在4 ℃下的保质期分别为87、116、145 d。其中，未添加多酚的低温火腿肠保质期为87 d，较市面上低温火腿产品最短的保质期（3 个月）还略短3 d，可能是由于未添加亚硝酸盐等化学防腐剂，产品易变质。0.02% PT组和0.10% PT组与市场上大多数产品的保质期相近，PT的抑菌且延长保质期效果颇为显著。
3 结 论
本研究将PT以0.02%和0.10%的质量分数添加到低温火腿肠中，探究其在32、37 ℃贮藏期间的品质变化，利用菌落总数为劣变指标预测保质期。研究结果表明，TBARs值、菌落总数在样品贮藏过程中均呈现增长趋势，且0.10% PT组显著高于对照组（P＜0.05）。由保质期预测实验可知，对照组、0.02% PT组、0.10% PT组的保质期分别为87、116、145 d。且添加PT的低温火腿肠已超过市场3 个月（90 d）的平均保质期水平。说明PT能够以其优良的抗氧化、抑菌活性应用到肉制品中延缓脂质氧化、微生物生长，并在不降低品质的前提下延长产品保质期，保持低温火腿肠的风味。同时，所有指标均表明0.10% PT组的低温火腿肠品质优于0.02% PT组。在实际应用中需要根据产品品质要求进行添加量上的选择，在最大程度上发挥PT的抗氧化和抑菌作用，从而使其在肉制品的生产中发挥显著的效果。
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