冷鲜肉是日常膳食中不可或缺的一部分。国家统计局统计，2022年中国猪、牛、羊、禽肉产量9 227万 t，比上年增长3.8%；其中，猪肉产量5 541万 t，增长4.6%；牛肉产量718万 t，增长3.0%；羊肉产量525万 t，增长2.0%；禽肉产量2 443万 t，增长2.6%。冷鲜肉具有肉质嫩、味鲜美且富含人体所需的蛋白质、脂肪、碳水化合物和微量元素等特点[1]，深受消费者喜爱，因此逐渐成为国际鲜肉生产和销售的主流。但冷鲜肉食品在加工、贮藏等过程中易受到微生物的污染，是各类微生物的理想基质[2]。贮藏不当会加快微生物的生长速率，从而导致肉类变质而引发食物中毒等一系列的安全问题[3-4]。冷鲜肉受微生物污染而引发食源性疾病的问题越来越具有挑战性，在我国当下流行疾病中所占比例较大，微生物导致的腐败占中国肉类损失的8%[5]，给肉类行业造成了数十亿美元的损失。肉类在屠宰、加工、运输过程中受到诸多因素影响，且微生物的生长繁殖加速了肉类的腐败变质。在此背景下，构建微生物预测模型，以评价和预测肉制品的质量安全显得尤为重要。
1 冷鲜肉的腐败及品质评价指标
冷鲜肉的腐败一般是指在微生物增殖代谢为主的多种因素作用下，蛋白质和脂肪等营养物质发生变化，颜色、气味、质地等发生改变，且有腐臭味的产生以及肉表面出现黏液等现象，肉品质下降，甚至达到不能食用的状态。影响冷鲜肉腐败变质主要有三方面原因：首先，肉表面微生物生长繁殖，逐渐渗透到肉体中，产生腐败臭味和异味代谢物，使肉表面发黏、变臭，以致肉腐败变质，主要微生物为假单胞菌、乳酸菌和肠杆菌[6]；其次，肉中的肌红蛋白被氧化，使肉色发生变化。在冷藏过程中，肌肉组织从空气中吸收氧气，并改变肉组织的结构。在一定条件下，鲜肉中的肌红蛋白形成不稳定的含氧肌红蛋白，使肉呈鲜红色，后期形成稳定的高铁肌红蛋白，呈现暗红色；最后，肉内源酶作用引起肉品质发生改变，温度偏高使冷鲜肉和微生物中各种酶活性增强，从而促进各种酶的催化作用，导致肉类变质。其中，微生物的代谢活动是冷鲜肉变质的主要因素[7]，具体有关肉腐败的相关因素如图1所示。健康动物的肌肉组织原本没有细菌，但在屠宰加工过程中胴体表面接触到各种微生物而被污染，总的来说可以分为两方面，即内源性细菌污染和外源性细菌污染[8]，前者来源主要包括动物毛发、肠、皮肤、粪便和蹄子，后者来源主要在屠宰加工、贮藏、运输、销售等过程，由水、空气、人、动物、设备和器具造成的污染。图2是动物组织在屠宰加工过程中的主要程序，是造成微生物污染的关键环节。
图1 肉类腐败的相关因素[9]
Fig. 1 Factors associated with meat spoilage[9]
图2 与微生物污染有关的一般关键环节[10]
Fig. 2 General key links related to microbiological contamination[10]
根据GB 2707—2016《食品安全国家标准 鲜（冻）畜、禽产品》和GB/T 9959.2—2008《分割鲜、冻猪瘦肉》，可通过感官品质（色泽、气味、组织状态等）、微生物菌落总数、挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、pH值等指标评价肉的品质。其中，微生物菌落总数是评价肉类品质的重要指标，当菌落总数＞6（lg（CFU/g）），则达到腐败标准，且当TVB-N含量＞15 mg/100 g时，视为变质肉。在适宜环境下，酶和微生物的活性越强，蛋白质分解速率越快，产生的碱性含氮物质更多，如氨、胺等，导致TVB-N含量升高[11]；肌肉组织的pH值会因内源性酶和微生物的作用而发生变化，由于肌纤维蛋白降解以及肉中蛋白含氮化合物在内源性酶和微生物作用下分解，产生碱性物质，导致pH值升高[12-13]，当pH值达到6.7或以上时，即为变质肉；而色泽是替代感官评价的客观评价指标。
2 冷鲜肉中主要致腐微生物及危害
冷鲜肉中的微生物是引起食品安全问题的重要因素，致腐微生物会导致鲜肉组织状态、色、香、味等感官性质变差并失去原有营养价值。致腐微生物不仅污染程度大，且种类繁多，主要分为腐败微生物和病原微生物两大类。腐败微生物是指通过对肉中某些特定底物进行发酵，在贮藏过程中引起肉类腐败，并产生特殊腐败气味的一种微生物。常见的有假单胞菌、莫拉氏菌、不动杆菌、肠杆菌和气单胞菌以及革兰氏阳性葡萄球菌等[14]。病原微生物是指能产生毒素等致病因子，食用受其污染的肉类后会引起食源性疾病的一类微生物，包括革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、单核细胞增生李斯特菌、肉毒梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌及革兰阴性的沙门氏菌、大肠埃希氏菌和耶尔森氏菌等[15]。
据统计，全世界每年死于腹泻的儿童人数不低于300万，由微生物污染引起的疾病占比超过70%[16]。2018年，全国共报告食物中毒事件291 起，其中细菌性食物中毒事件数占比为36.77%。沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及其肠毒素是主要致病因素，具有一定的安全隐患[17]。在加工运输过程中，由于微生物生长繁殖导致的冷鲜肉品质下降或腐败现象，成为消费者重点关注的肉品安全问题。许多研究发现，肉类中存在大量的致腐微生物。李宁[18]通过高通量测序技术研究得出假单胞菌属、不动杆菌属、发光杆菌属是导致冷鲜猪肉腐败变质的主要微生物；吴任之等[19]研究表明，雅安市生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌的污染较为严重，应引起足够重视；Zhong Aiai等[20]研究得出假单胞菌属、乳球菌属和不动杆菌属是新鲜肉类样品中的主要细菌，假单胞菌属可在低温条件下生长并代谢产生腐败产物。据报道，假单胞菌属是变质肉类中的主要细菌，包括鱼[21]、猪肉[22]、牛肉[23]。Guo Zonglin等[24]研究牛肉干在贮藏过程中品质变化的影响因素，发现假单胞菌属、肠杆菌科、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和脂质氧化会导致牛肉干变色，并产生异味。张一敏等[25]研究得出假单胞菌属、不动杆菌属、气单胞菌属、腐败希瓦氏菌、肠杆菌科、乳杆菌属和热杀索丝菌属等是生鲜牛肉中的优势腐败菌。以上研究表明，冷鲜肉中主要优势致腐菌有假单胞菌属、不动杆菌属、肠杆菌科和气单胞菌属等，具有一定的致腐能力，且影响冷鲜肉的食用安全，必须引起足够重视。
假单胞菌属是一种专性需氧的革兰氏染色阴性菌，具有很强的致腐能力，可利用葡萄糖、核糖、葡萄糖酸盐等基础物质进行呼吸和繁殖，且利用氨基酸作为生长基质，产生具有异味的酸、酯、含硫化合物等；肉中的腐败臭味大多来自假单胞菌属，该菌属可以在低温下生长，是导致肉类腐败的主要微生物[26]。
不动杆菌属是一种革兰氏阴性严格好氧球杆菌[27]。该属构成了一个多功能细菌群，包括在土壤等多个自然栖息地中鉴定的致病和非致病物种[28]，是引起医院内感染的致病菌之一。近年来，也有报道称不动杆菌是肉类食品中的腐败菌之一[29]。其中，鲍曼不动杆菌是医院常见的感染菌之一，当人体抵抗力下降时，可引起脑膜炎、肺炎、败血症、泌尿系统和伤口感染等[30]。
肠杆菌是一种革兰氏阴性兼性厌氧菌，在好氧条件下可以利用葡萄糖作为反应底物。当进行葡萄糖发酵时不会产生难闻的气味，只有当葡萄糖耗尽时，一些氨基酸被分解才会产生腐败气味，因而在适宜环境下，肠杆菌才有较强的致腐能力，从而导致食物腐败变质[31]。
沙门氏菌为革兰氏阴性短杆菌，不产外毒素，但产内毒素。由于其抗原的差异（H抗原、K抗原、O抗原、Vi抗原），血清型较多，较常见的血清型有肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌等。沙门氏菌可以通过水、食物和昆虫等从患者或病原菌携带者的粪便中传播，发病症状主要为恶心、呕吐、腹泻等，严重时可导致败血症与胃肠炎，是最常见的食源性致病菌之一[32]。方忠意等[33]采用聚合酶链式反应、微生物自动鉴定系统和血清凝集法对分离菌株进行鉴定，以了解河南省生猪屠宰场沙门氏菌污染情况，结果表明，分离率为5.36%，存在一定沙门氏菌污染，具有极大的安全隐患。
金黄色葡萄球菌是毒性最强的葡萄球菌，革兰氏阳性、圆形且可产生毒害[34]。该菌在肉和肉制品中的污染率较高[35]，也是引起肠毒素型食物中毒的主要病原体，且含有多种致病因子，如肠毒素、溶血素和血浆凝固酶等，其中肠毒素占主要地位，因此，被人体摄入后可引起食物中毒[36]。肠毒素引起的食物中毒通常在摄入后2～8 h内发病，其症状包括恶心、剧烈呕吐，有时会伴有腹泻，甚至引发多种侵袭性、毒素性疾病和全身性感染[37]；刘保光等[38]研究表明，金黄色葡萄球菌产生的毒素和侵袭酶是其致病性的主要原因。还有学者研究零售鲜红肉中的金黄色葡萄球菌污染率在12.5%～70.0%之间，金黄色葡萄球菌的污染在生红肉的加工阶段比比皆是[39]。因此，金黄色葡萄球菌在肉中的污染具有一定的安全隐患，时刻需要注意。
单核细胞增生李斯特氏菌为革兰氏阳性小杆菌，广泛分布于土壤、水、植被、野生动物粪便、农场和食品加工设备中。研究发现，被单核细胞增生李斯特氏菌污染的家禽和肉制品分别为15%和30%以上。该菌发病率较低，但致病力较强、病死率较高，感染时会出现发热、头痛、恶心、呕吐和腹泻等症状，临床死亡率为20%～30%[40]。张俊彦等[41]调查发现，2018—2020年浙江省销售的散装熟肉产品中检出单核增生李斯特菌的污染率为2.97%。因此，该菌可污染食品冷藏、加工、运输等多个环节，必须引起足够重视。
3 微生物预测模型的构建
3.1 微生物预测模型分类
冷鲜肉受微生物污染而引发的食源性疾病是全球食品安全面临的重要挑战之一。肉类中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌等仍然是我国亟需控制的重要致病因子。针对由微生物引发的食品安全问题，在肉类中应采取更有效的措施严格控制肉类中致腐微生物的污染水平，并结合微生物预测模型预测其在不同加工及流通条件下的生长/失活特性，以降低因致腐微生物所引发的食源性疾病暴发风险。
食品微生物生长预测模型是在微生物学、数学模型、统计学和应用计算机科学的基础上建立的一门新学科[42]。预测建模的目的是使用数学模型定量分析微生物的产生，并预测在某些条件下，微生物数量何时会达到对人类健康构成威胁的水平。根据各种食品微生物在不同加工、贮藏和流通条件下的特征数据，通过计算机处理，确定食品中主要致腐微生物的生长或残留动态变化，从而快速准确评价和预测食品的质量和安全性。微生物预测模型可以用于描述微生物的生长、生存和生命过程，可分为一级、二级和三级模型如表1所示，具体分类以及在肉品中的应用实例如表2所示。
表1 常见微生物预测模型的分类及特点[43-44]
Table 1 Classification and characteristics of common microbial prediction models[43-44]
模型特点一级模型Monod、Gompertz、Logistic函数、Rosso、Baranyi ＆ Roberts、杀菌D值描述特定条件下微生物数量与时间的关系，操作简单、使用方便，适合受单一因素影响的微生物二级模型Belehradeks、Ratkowsky、Arrhenius、Z值、平方根、响应面多种因素共同对微生物的抑制和灭活的影响，如温度、pH值、水分活度等三级模型病原体建模程序、生长预测、水产品腐败与安全、ComBase、Sym’Previus预测系统比较全面，结果精准性高；可分析多重环境因素对微生物的影响，但应用程序较复杂
表2 肉品中有害微生物预测建模中的应用实例
Table 2 Examples of predictive modelling of harmful microorganisms in meat products
肉品基质微生物模型环境温度/℃参考文献鸡肉大肠杆菌O157:H7Gompertz、Ratkowsky 4、8、10、12、16、20、28、37[45]猪肉金黄色葡萄球菌、假单胞菌、大肠杆菌Gompertz0、4、8[46]鸭肉假单胞菌、乳酸菌、荧光假单胞菌Gompertz、Belehradeks、Arrhenius4、10、15、20、25[47]鸡肉沙门氏菌Logistic函数、Gompertz、Ratkowsky8、16、25、35[48]猪肉沙门氏菌Gompertz、Baranyi ＆Roberts 7、12、15、18、22、25、28、30[49]牛肉大肠杆菌O157:H7Logistic函数、Gompertz、Ratkowsky4、16、25、30、37[50]
3.2 人工神经网络
人工神经网络（artificial neural network，ANN）是一种可用于处理具有多个节点和多个输出点实际问题的网络结构。网络中大量神经元相互连接，功能与生物神经元相同，可以达到传递信息和处理数据的目的，是每种自适应计算模型[51]。近年来，ANN在生物、经济、科技、医学等多个领域发挥了非常重要的作用，具有很大的发展前景[52]。通常，ANN包含大约3 种层：输入层、隐藏层和输出层。每一层由多个节点或神经元组成，一层中的节点连接到其他层中的节点。神经元之间的这些相互作用会导致权重和偏差[53]。ANN机制的简化概念如图3所示。
图3 ANN机制示意图
Fig. 3 Schematic diagram of ANN mechanism
反向传播（back propagation，BP）神经网络是应用最广泛的神经网络模型之一，它是根据Rumelhart和McClelland领导的科学家在1986年提出的误差BP算法训练的多层前馈神经网络。BP神经网络是一种基于生物学研究和大脑反应机制的拓扑网络，由大量神经元作为基本处理单元组成。每个神经元模拟神经冲突的过程，接收来自n 个其他神经元的信号，这些信号通过加权连接传输，神经元将接收到的总输入值与神经元的阈值进行比较，然后通过激活函数对神经元产生的输出信号进行处理。对于输入信号，必须前向传播到隐藏节点，隐藏节点的输出信息通过激活函数传播到输出节点，最后得出输出结果[54]。对于传统的预测微生物学模型，通常采用经验数学回归的方法描述食源性致病菌的生长失活行为以及环境条件与致病菌特定行为之间的定量关系。传统模型得到的预测结果多为确定性的点估计，但由于可变性的存在，病原体的实际行为通常是一个特定的范围，而不是一个单一的确定值[55]，此外，模型中的参数是根据经验建立的，没有实际意义，这使得在复杂环境中很难准确预测[56]。然而，与传统的方程回归方法相比，BP神经网络具有自适应学习能力、大规模并行处理、分布式存储、适应性强、容错性高以及较强的处理性能，包括优化、摸拟和控制等优点，是一种预测非线性模型，也是预测微生物学中一种新型的方式。近年来，BP神经网络模型在食品工业中应用也较广泛，表3列举了关于ANN模型在食品微生物中的应用实例。
表3 肉品中有害微生物神经网络模型中的应用实例
Table 3 Examples of neural network modelling of harmful microorganisms in meat
肉品基质微生物模型环境条件参考文献酱牛肉金黄色葡萄球菌BP神经网络模型不同温度（15、25、36 ℃）和不同初始接菌量（102、103、104 CFU/mL）[57]冷鲜猪肉假单胞菌 径向基函数神经网络模型0、4、7、15、20 ℃[58]香肠铜绿假单胞菌逐步回归、遗传算法-ANN模型不同温度（15、25、0 ℃）、提取物质量浓度（2、4、6、8、20 g/L）和提取物类型（水和乙醇）[59]牛肉大肠杆菌ANN模型受3 个水平的影响：电流（300、600、900 mA）、频率（1、10、100 kHz）、占空比（30%、50%和70%）[60]
3.3 模型的评价
为了提高预测的准确性，任何模型都需要在使用之前进行验证。然而，目前还没有统一标准的模型验证方法，为了评价模型对微生物生长的拟合效果，更倾向于采用统计方法对模型进行验证。如F检验、t检验、均方误差、决定系数R2、偏倚因子Bf、精度因子Af等。对于非线性回归，主要采用残差平方和（residual sum of squares，RSS）、残差均方差（residual standard error，MSE）和赤池信息量准则（Akaike information criterion，AIC）等指标综合评价模型的拟合效果。RSS和MSE值越小，模型拟合效果越好，AIC值越小，模型越准确[61]。
3.4 建立微生物生长预测模型的意义
食品中微生物的生长繁殖代谢会导致pH值变化、有毒化合物的形成、异味等不良影响，导致品质下降及安全性问题。蛋白质降解会产生大量的游离氨基酸和肽，从而被微生物进一步代谢为挥发性有机化合物和生物胺，这些化合物和生物胺会导致食品腐败和异味的产生[62]。因此，微生物的生长繁殖是导致肉类腐败变质和引发食品安全问题的主要因素。通过构建肉类中微生物的生长预测模型，预测微生物的生长参数，判断肉类中特定微生物在不同屠宰、加工和销售条件下生长或存活的动态变化，从而对贮藏过程肉类品质进行判断。此外，微生物预测模型可以在已知相关条件的情况下，预测生产、贮藏、流通等过程中相关因素对微生物的影响，有助于掌握肉中微生物的生长规律和动态变化，定量评估食品的安全程度。
4 结语
肉类在屠宰、贮藏、销售等过程中会受到微生物的污染。在适宜条件下，大量微生物生长繁殖，以致肉腐败变质并产生毒素导致食源性疾病爆发，危害消费者健康。因此，利用数学模型来描述多种因素环境下食品中微生物的生长规律，构建微生物预测模型具有重要意义。本文综述微生物预测模型的种类和人工神经网络模型在肉类方向预测的研究进展，分析模型的优势和不足，以期为今后该领域内的研究提供一定参考。但利用科学合理的数学建模描述环境因素是整个微生物预测模型中最关键的问题，只有更好地描述环境因素与微生物生长之间的关系，该模型才具有实用价值。预测微生物学还有些许不足和有待探索的地方。例如，建立一个完整的模型需要大量的数据支持和工作量，产品的贮藏环境由于销售、运输等因素不断变化，环境的不确定性导致模型中的不确定性变量，以及如何提高预测结果的准确性实现肉类微生物的安全性，将是构建微生物预测模型领域的主要挑战。为解决这一系列的问题，通过构建ANN模型对肉类中致腐微生物进行精准识别与预测，是实现肉类微生物安全的重要途径。但ANN模型往往只能得到单一的预测结果，无法得知模型在预测过程中如何做出决策，以及数据集中每个输入特征如何对最终预测产生影响。因此，微生物预测仍有许多领域值得探索、研究和解决。
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