酱猪肉是我国传统的熟肉制品之一，因其诱人的口感和风味深受消费者喜爱[1]，常以散装零售的方式见于商超和农贸市场[2]。在酱猪肉的制作中，常添加香料进行腌制烹饪，这些香料中多含有抗菌的酚类化合物，可延长酱猪肉的货架期。然而目前酱猪肉等熟肉制品仍面临着腐败细菌侵染的挑战[3-4]，如李斯特菌、肉毒梭状芽孢杆菌等，这些细菌具有耐受低pH值和高盐浓度环境的能力，并能在冷藏条件下存活。因此，当肉制品受到污染时，会出现异味、变色等不良的感官属性。更严重的是被污染的肉制品如果被孕妇、新生儿和免疫系统较弱的老年人食用，可能会引发严重疾病如脑膜炎、败血症，甚至导致自然流产[5]。为减少肉制品制备过程中的污染，长期以来人们使用合成物质作为添加剂[6]。然而，这些人工合成的添加剂存在着致癌性和致畸性等风险[7]。植物中天然产物尤其是精油，因其安全性较高，具有较好的应用前景[8]。寻找合适的精油作为天然抗菌剂十分必要。留兰香精油具有较好的抑菌活性，有一定的潜在应用价值。植物精油具有易挥发、热不稳定等特点，直接在食品中添加植物精油，其抗菌效果有限。然而，使用添加精油的可食性薄膜，可以更有效地发挥其抗菌作用[9]。相比直接在食品中添加精油，可以通过缓释延长精油作用时间，并提高其溶解度，从而增强抗菌作用。
留兰香（Mentha spicata L.）为唇形科薄荷属芳香植物，其干燥的叶子和精油被广泛用作烹饪和食品工业香料和调味剂[10]。从留兰香茎叶中提取出的留兰香精油，主要化学成分是香芹酮和柠檬烯，其他成分还有月桂烯、薄荷酮、桉叶油素等，这些物质带有特殊的味道，并且具有一定的功能活性，如抗氧化、抗菌等[11–13]。壳聚糖是由甲壳类动物壳中的几丁质经脱乙酰反应制备而成，是一种生物可降解和生物相容的聚合物，是自然界中含量仅次于纤维素的第二丰富的聚合物。由于其无毒、抗菌、抗氧化以及能形成保护膜等多种功能特性[14-18]，壳聚糖可作为一种天然来源的食品防腐剂，因而受到研究学者的密切关注。且已有报道称，壳聚糖可以抑制多种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的生长[19]，以及作为生物保藏剂在各类肉制品中针对各种食品腐败和致病微生物发挥防治作用[20–23]。目前，鲜有留兰香精油与壳聚糖联合使用在酱猪肉保鲜中应用的研究。针对上述问题，本研究探寻壳聚糖留兰香精油复合膜在低温贮藏中，对酱猪肉的感官特性、化学性质、菌落总数的影响，并为天然保鲜剂的开发应用提供理论参考，也为今后肉制品的高品质保鲜开辟途径。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酱猪肉、留兰香购于丹尼斯百货科学大道店；壳聚糖（生物试剂，摩尔质量2.9×105 g/mol）、吐温-80（化学纯）、冰乙酸（分析纯）、丙三醇（分析纯）、无水硫酸钠（优级纯）、氢氧化钾（优级纯） 国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
JA2003型电子天平 上海精密科学仪器有限公司；CS-200色差仪 杭州彩谱科技有限公司；ES315高压蒸汽灭菌锅 日本Tomy公司；PB-30型pH计 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；1300-A2型超净工作台赛默飞世尔科技（中国）有限公司；101-EBS型电热鼓风干燥箱 北京市永光明医疗仪器有限公司；LHS-250H型智能恒温恒湿培养箱 郑州生元仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 留兰香精油提取
参考陈鑫沛等[24]的方法并加以改进，称取晒干粉碎后的留兰香粉末100 g，置于烧瓶中，向其中加入蒸馏水（1 g粉末/10 mL蒸馏水），混匀后将其置于电热套中，预设温度160 ℃，开始加热，以瓶中液体沸腾开始计时，提取5 h（直到没有油状物馏出），用少量正己烷萃取精油，经过无水硫酸钠干燥后，采用氮气吹干仪除去残存的正己烷，得到留兰香精油，封口后置于冰箱－20 ℃中避光备用。留兰香精油得率约0.58%。
1.3.2 复合可食膜的制备
参考Wang Dongying等[25]的制备方法，称取15.0 g壳聚糖溶解在1.0 L冰乙酸溶液（0.7%，V/V）中，配制质量分数1.5%的壳聚糖溶液，用磁力搅拌器在40 ℃下搅拌至壳聚糖完全溶解。加入甘油塑化（0.15 g甘油/1 g壳聚糖）。继续搅拌10 min后，分别加入质量分数为0%、0.5%、1%、2%的留兰香精油，并加入吐温-80（0.2%，V/V）作乳化剂，制备成膜液。将所有成膜液用均质器以12 000 r/min匀浆5 min，使膜液中的留兰香精油均匀分布，超声处理10 min，脱除气泡。分别从成膜液中取100 mL，倒入培养皿（d=60 cm）中成型，得到壳聚糖-留兰香精油复合膜。在电热鼓风干燥箱中37 ℃干燥48 h，从培养皿上取下，在（25±1）℃和湿度（60±5）%的标准条件下保存48 h。
1.3.3 低温贮藏实验
将装有酱猪肉和冰袋的保温箱封装，送至实验室。在无菌条件下，将酱猪肉取出并切碎（小于10 mm），将切好的酱肉样品置于5 个聚对苯二甲酸乙二酯材质的容器中，其中一份不做任何处理作空白组，在其余4 个盖子内部分别粘贴壳聚糖-留兰香精油复合膜，将其按精油添加量分别命名为CS/A0、CS/A0.5、CS/A1.0和CS/A2.0，每份样品约200 g。样品于4 ℃避光冷藏，并在第0、6、12、18、24天测定样品的色泽、pH值、挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、大肠菌群数、菌落总数等指标。
1.3.4 猪肉表面色泽的测定
采用色差仪在常温下测定酱猪肉表面的亮度值（L*）、红度值（a*）。
1.3.5 pH值测定
按GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》进行测定。
1.3.6 TVB-N含量测定
参照GB/T 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中的自动凯氏定氮法进行测定。
1.3.7 菌落总数的测定
参照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》进行。
1.3.8 大肠菌群数的测定参照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》进行。
1.3.9 感官评价
于第24天取出样品放置于洁净的白色盘中，由30 名食品专业学生组成感官评价小组，对酱猪肉样品的色泽、外观、气味进行评价，每个样品评价前用温开水漱口，具体评定标准见表1。
表1 酱猪肉感官评定标准
Table 1 Criteria for sensory evaluation of sauced pork
评分外观气味色泽口感质地6～9外形完好，肉质紧实有弹性酱猪肉香味，无异味表面呈酱红色，鲜亮，红润香软可口，引人食欲3～6肉质模糊松散，肉质弹性减弱轻微异味，酱猪肉香味减少肉色变淡，泛褐酸涩异常，无食欲0～3坍塌模糊，黏结不分，液体流出腐臭气味，香味消失表面呈深褐色，暗淡腐败变质，无法食用
1.4 数据处理
采用IBM SPSS Statistics软件用单因素方差分析进行统计分析，显著水平符合95%（有统计学意义，P＜0.05）和99%（极显著，P＜0.01）的置信水平。实验均重复3 次，结果用平均值±标准差表示。所有图形使用Origin 22.0软件绘制。
2 结果与分析
2.1 不同质量分数的壳聚糖-留兰香精油复合膜对酱猪肉感官品质的影响
由图1可知，壳聚糖-留兰香精油复合膜包裹的酱猪肉在口感、色泽、气味、外观方面明显优于空白组，并且随精油质量分数的提高，实验组的感官评分也随之升高，其中以2%壳聚糖-留兰香精油复合膜组酱猪肉的感官指标最好。冷藏酱猪肉在没有真空包装的情况下，其中的营养物质如脂肪、蛋白质容易被氧化，导致肉质下降，甚至产生安全问题[26]。留兰香精油中的香芹酮、柠檬烯等主要物质，不仅可以改善酱猪肉的风味，还可以抑制其表面菌落生长繁殖[27]，减少营养物质损失，并改善其色泽、组织形态。
图1 第24天酱猪肉贮藏后的感官得分雷达图
Fig. 1 Radar chart of sensory score of sauced pork after storage for 24 days
2.2 不同质量分数壳聚糖-留兰香精油复合膜对酱猪肉色泽的影响
由表2可知，在贮藏初期，空白组和各处理组L*没有显著差异。随着贮藏时间的延长，各组L*均有一定程度的减小，组间差异逐渐增大。在贮藏末期，CS/A2组的L*显著高于其余各组（P＜0.05）。肉制品a*可以反映肉的颜色以及氧化状态，酱猪肉的颜色越红，a*越大。在贮藏开始时，各组之间的a*无显著差异。随贮藏时间延长，各组间a*差异逐渐增大，贮藏结束时CS/A0、CS/A0.5、CS/A1.0、CS/A2.0与贮藏开始时相比分别降低了56.9%、53.47%、54.17%、41.67%、36.11%。
表2 贮藏过程中酱猪肉色泽的变化
Table 2 Changes in color parameters of sauced pork during storage
注：同列小写字母不同，表示差异显著（P＜0.05）。
色泽指标组别贮藏时间/d 06121824 L*空白55.2±6.7 41.9±5.5 35.6±4.6a 24.7±2.7a 17.8±3.2a CS/A055.2±6.7 42.4±4.8 37.9±3.8ab 28.3±4.2ab 19.7±4.1ab CS/A0.5 55.2±6.7 41.2±5.3 38.6±4.2ab 30.5±3.4ab 22.2±3.0ab CS/A155.2±6.7 44.6±4.4 40.1±2.8ab 33.3±3.8b 25.8±2.4b CS/A255.2±6.7 49.8±5.1 45.5±4.7b 41.7±4.5c 37.9±4.1c a*空白14.4±0.8 11.6±0.9ab 9.9±0.9ab 7.5±0.8a 6.2±0.5a CS/A014.4±0.8 10.8±0.7a 9.6±0.6a 7.9±0.7a 6.7±0.6a CS/A0.5 14.4±0.8 11.0±0.9a 9.5±0.6a 7.9±0.6a 6.6±0.8a CS/A114.4±0.8 12.3±0.5ab 10.9±1.7ab 9.3±0.5b 8.4±0.8b CS/A214.4±0.8 13.0±1.1b 11.6±0.9b 10.5±0.9b 9.2±1.1b
L*和a*是反映肉制品新鲜程度较为重要的指标。随贮藏时间延长，肉制品的L*和a*均呈下降趋势。根据Vatavali等[28]的研究，L*的变化是由于肉中蛋白质逐渐分解，使入射光扩散增加，导致L*下降。壳聚糖-留兰香精油复合膜可能是通过影响酱猪肉中肌红蛋白和血红蛋白的含量而达到保鲜酱猪肉的作用。
2.3 不同质量分数壳聚糖-留兰香精油复合膜对酱猪肉pH值的影响
酱猪肉的初始pH值为5.46～5.54，由图2可知，随贮藏时间延长，各组pH值有不同程度的增加，其中空白组、CS/A0、CS/A0.5组的pH值上升较为快速，并且3 组间差异较小，而CS/A1、CS/A2组增速较为缓慢，在贮藏第24天时，CS/A2组的pH值仍低于6.3，属于一级鲜度范围，CS/A1为二级鲜度，而空白组和CS/A0组的pH值大于6.7，为变质肉[29]。与空白组相比，CS/A2组的pH增长速率降低了58.5%，这表明壳聚糖-留兰香精油复合膜的使用有助于减缓酱猪肉pH值的上升，并且效果随着精油质量分数的增加而增强。
图2 贮藏过程中酱猪肉pH值的变化
Fig. 2 Changes in pH of sauced pork during storage
2.4 不同质量分数的壳聚糖-留兰香精油复合膜对酱猪肉中TVB-N含量的影响
由图3可知，各组TVB-N含量随贮藏时间的延长逐步增加，并且组间差异逐渐增大。贮藏初期，空白组和各处理组差异较小；贮藏结束时，空白组TVB-N含量达到35.4 mg/100 g，远超变质肉20 mg/100 g的标准，而CS/A2组为16.2 mg/100 g，增长速率与其相比降低了57.1%，仍属二级鲜肉范围。这可能是由于复合膜具有较好的空气阻隔性能，减少外界中水分和温度的影响，抑制样品中腐败菌的生长和繁殖，从而延缓了TVB-N含量的升高[30]。
图3 贮藏过程中酱猪肉TVB-N含量的变化
Fig. 3 Changes in TVB-N content in sauced pork during storage
2.5 不同质量分数壳聚糖-留兰香精油复合膜对酱猪肉菌落总数的影响
由图4可知，随着贮藏时间的延长，各组菌落总数都有不同程度的增加，空白组中菌落总数最多，显著高于同一贮藏时期的壳聚糖精油处理组，CS/A0.5组与CS/A0组较为接近，这可能是由于精油质量分数过低，抗菌作用不明显。贮藏期间，所有处理组中CS/A2组菌落总数始终保持最低水平。可见，壳聚糖-留兰香精油复合膜具有明显的抑菌性，并且随着精油质量分数的增加，酱猪肉的菌落总数增长速率逐渐缓慢。
图4 贮藏过程中酱猪肉菌落总数的变化
Fig. 4 Changes in total bacterial count of sauced pork during storage
2.6 不同质量分数壳聚糖-留兰香精油复合膜对酱猪肉大肠菌群数的影响
由图5可知，贮藏期间酱猪肉中的大肠菌群数量呈上升趋势，其中CS/A2组上升最缓慢，其次为CS/A1、CS/A0.5以及CS/A0组，而空白组大肠菌群数最多。这表明壳聚糖-留兰香精油对大肠菌群也有一定的抑制作用，并且抑制趋势与菌落总数一致。
图5 贮藏过程中酱猪肉大肠菌群数的变化
Fig. 5 Changes in coliform count in sauced pork during storage
3 结 论
本实验探究精油质量分数为0%、0.5%、1%、2%的留兰香精油-壳聚糖复合膜对低温贮藏过程中酱猪肉保鲜效果的影响。结果表明，该复合膜能够较好地保持酱猪肉的组织形态、气味等感官性质，并且在酱猪肉的贮藏中，精油质量分数对保鲜效果有明显影响，其中以2%质量分数精油制备的复合膜保鲜效果最好，与空白组相比，pH值和TVB-N含量的增长速率分别降低了58.5%和57.1%。该复合膜较好地维持酱猪肉的色泽、有效地降低贮藏过程中pH值、TVB-N含量、菌落总数、大肠菌群数，并且通过对比发现，含有留兰香精油的复合膜不仅优于空白组，同时优于纯壳聚糖膜处理组。留兰香精油-壳聚糖复合膜能将壳聚糖和精油二者的优点相结合，更有效地保持酱猪肉的营养价值和感官品质，具有广阔的应用前景。
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