鱼子酱被称为世界三大珍味之首，与鹅肝、松露并称三大美食，也是国内经济鱼养殖产业的主打产品[1-2]。鱼籽食品营养物质种类齐全，富含蛋白质、维生素、必需氨基酸和矿物质等营养元素[3-4]，近年来，需求呈现持续增长的态势[5]。鱼籽的加工工艺中，为了去腥和延长货架期，盐渍是主要的处理环节[6-7]。盐渍过程中使用到的调料主要是氯化钠，氯化钠的使用不仅可以给产品带来典型的咸味口感以及去除腥味的作用，同时，氯化钠具有较高的渗透压，使微生物细胞脱水、变形并影响微生物细胞中水分的代谢，从而抑制其生命活动，减缓有害微生物的生长，使鱼子酱等产品的安全性和可食用性得到了保障。
虽然氯化钠在居民日常饮食中必不可少，但是大量的流行病学、临床实验研究表明，过量的钠摄入会导致高血压[8-9]、心血管疾病[10]，而高血压会导致心肌梗死、功能衰竭等[11]。世界卫生组织《2030年可持续发展议程》中提到，每年约有410 万人因钠盐摄入过量而死，所以被认为是人类不可忽视的“健康杀手”[12]。Du Shufa等[13]对食盐使用量数据进行汇总分析发现，在过去的30 年里，中国人均钠摄入量在逐步降低，但仍然是世界卫生组织推荐值（＜2.0 g/d）的2 倍，超过1/4的人钠摄入量大于5.0 g/d。由此可见，我国的减盐防控工作仍然任重而道远。
如何降低氯化钠含量又不影响盐渍后鱼子酱的品质？当下，食品中减盐的措施主要集中在降低盐含量、改变盐粒形态、改善加工工艺，以及添加钠盐替代 物等[14-15]方式。其中，钠盐替代物主要是通过对产品中使用的氯化钠进行部分替代，减少钠离子的摄入，从而达到减盐的目的。相较于其他方法，此方法因成本较低、操作方便的特点，以及钠盐替代物在口感上具有和钠盐相同的作用，均能够作为氯化钠的替代物来使用并赋予食物咸味特征[16]，因此被广泛应用于食品减盐。然而，钠盐替代物种类较为单一，目前主要为氯化盐（如氯化钾[17]、氯化钙[18-19]、氯化镁[20-21]等），其他替代物还未被全面使用，因次，开发复合钠盐替代物具有实际的应用前景。
实验室前期对鱼籽营养成分进行了全面的检测分析[22]，发现鱼籽中水溶性蛋白和维生素含量最多，水洗能够造成营养物质的流失。因次，在鱼子酱的实际生产中应减少水洗次数，但又得保证盐渍的作用可以得到发挥。在此基础上，本研究拟采用多种钠盐替代物联合使用的方法，以微生物为评价指标，通过单因素试验、Plackett-Burman（PB）试验、最佳陡坡试验和响应面优化试验，确定最佳的钠盐复合替代物配方，以期降低氯化钠的使用量，减少鱼子酱中的钠含量；进一步通过对pH值、水分活度（water activity，aw）、色差等品质特性的研究，比较全面地反映钠盐替代物的减盐效果与对马苏大马哈鱼子酱品质及货架期的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
马苏大马哈鱼籽 北京市鲟鱼、鲑鳟鱼水产创新团队。
氯化钾、氯化钠、氯化钙、氯化镁、乳酸钾、乳酸钙 湖北蓝天有限责任公司；平板计数琼脂（PCA） 北京奥博星生物技术有限责任公司。
1.2 仪器与设备
DNP-9162电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；SCL-1300超净工作台 北京赛伯乐仪器有限公司；YXQ-LS-S高压蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司；ML54-02分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HD3A智能水分活度测量仪 无锡市华科仪器仪表有限公司；TA-XT2i质构仪 英国Stable Micro Systems公司；NH-300色差仪 日本Konica Minolta 公司；KDN-1000自动凯氏定氮仪 杭州绿博仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 鱼子酱制备
将新鲜鱼籽解冻，用去离子水清洗去除杂质后，按照下述工艺进行鱼子酱制备：原料→清洗→挑选→盐渍→ 清洗→沥干→包装→冷藏。其中盐渍过程，加入水的质量与鱼籽质量比1∶1，用盐量4%，盐渍时长10 min，清洗时长5 min，后保存在27 ℃（常温）条件下。整个过程均于无菌超净台进行，所使用的器具均为食品级。
1.3.2 单因素试验
以贮藏12 h鱼子酱的微生物菌落总数为指标，在仅使用氯化钠（100%）盐渍的基础上，进行单因素试验，针对乳酸钾、氯化钾、氯化镁与抗坏血酸钙4 种替代物，分别按照10%、20%、30%、40%与50%的替代比例设置试验组，探求不同钠盐替代物的最佳替代比例。
1.3.3 PB试验
PB试验可从最少的试验次数中从多因素中准确、便捷地筛选出显著性影响因素。根据单因素试验结果，利用Design-Expert软件设计PB试验（表1），响应值为贮藏12 h鱼子酱的菌落总数。对各因素进行方差分析，并根据贡献率大小从中筛选出贡献率较高的3 个因素进行下一步研究。
表1 PB试验因素与水平编码表
Table 1 Code levels and corresponding actual levels of variables used in PB design
1.3.4 最佳爬坡试验
根据PB试验的步长效应与结果，综合分析菌落总数，得到显著因素及响应值，以高替代比例为优先原则，设计爬坡试验的方向和步长。方向根据显著因素的效应值表现为增加或减少，步长根据单因素试验结果确定，试验设计如表2所示。
表2 最陡爬坡试验设计
Table 2 Design of the steepest grade test
1.3.5 Box-Behnken响应面试验
选取乳酸钾、氯化钾、氯化镁替代比例3 个因素作为自变量，使用Design Expert软件设计响应面试验，由最佳陡坡试验中选择的最优替代比例作为响应中心点，以贮藏12 h鱼子酱的菌落总数为响应值，因素与水平编码如表3所示。
表3 Box-Behnken响应面试验因素与水平编码表
Table 3 Code levels and corresponding actual levels of variables used in Box-Behnken design
1.3.6 菌落总数测定
称取1 g鱼籽酱，破碎，振荡均匀后取上清液备用。根据GB 4789.1—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则》进行平板计数，吸取100 μL样品溶液进行涂布，在恒温培养箱培养后计数，培养温度37 ℃，以菌落形成单位在30～300 CFU/g为宜。
1.3.7 OD600 nm测定
称取2 g马苏大马哈鱼子酱实验组与对照组样品，加入8 mL去离子水，破碎搅拌均匀后，8 000 r/min离心10 min，取上清液测定OD600 nm。
1.3.8 pH值测定
准确称量0.2 g鱼籽酱，加入0.8 mL去离子水，将鱼籽破碎均匀后，静置沉淀，使用电子pH计测定上清液的pH值。
1.3.9 色泽测定
采用色彩色差计，在自然灯光下测定鱼子酱的亮度值（L*）、红度值（a*）和黄度值（b*），每组样品测定3 次。
1.3.10 aw测定
aw不仅可以表示食品中水的能量状态，又能揭示食品质量变化和微生物繁殖对其水分的可利用程度，是食品加工过程及成品质量的重要控制参数和监控指标。取适量实验组与对照组马苏大马哈鱼子酱样品分别于水分测量皿中，在0、6、12、18、24 h进行取样。使用水分活度测量仪检测样品aw，测量时间10 min，示数稳定后记录数值。
1.4 数据处理
每组实验重复测定3 次，数据以平均值±标准差表示。使用SPSS Statistix 25.0软件进行均值计算及方差分析，采用Origin 2018软件绘图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
由图1可知，使用不同替代比例的钠盐替代物进行盐渍后，微生物数量均呈现波动趋势，说明钠盐的含量对微生物生长具有一定的作用。另外，考虑过高或过低的替代比例可能会带来不适口感等影响，通过单因素试验得到的乳酸钾、氯化钾、氯化镁及抗坏血酸钙的替代比例分别为10%、20%、10%、40%。
图1 不同钠盐替代物单因素试验结果
Fig. 1 Effect of individual sodium salt substitutes on total bacterial count investigated by one-factor-at-a-time method
小写字母不同，表示组间差异显著（P＜0.05）。
2.2 PB试验结果
选择对乳酸钾替代比例（A）、氯化钾替代比例（B）、 氯化镁替代比例（C）和抗坏血酸钙替代比例（D） 4 个因素进行分析，考察各个因素对鱼子酱菌落总数的影响，根据单因素试验中各因素的较适范围，以菌落总数为响应值，PB试验设计及结果如表4所示。
表4 PB试验设计及结果
Table 4 PB design and experimental results
表6 PB试验整体因素模型方差分析表
Table 6 Analysis of variance for the effect of substitution levels of four non-sodium salts for NaCl on total bacterial count as per PB design
由表5～6可知，氯化钾替代比例（B）、氯化镁替代比例（C）和抗坏血酸钙替代比例（D）3 个因素对菌落总数的增加显示为正效应，乳酸钾替代比例（A）显示为负效应，抗坏血酸钙替代比例贡献率最低（0.19）， 因此选择乳酸钾替代比例、氯化钾替代比例、氯化镁替代比例3 个影响最显著的因素进行下一步的最陡爬坡试验。
表5 PB试验设计因素水平及效应分析
Table 5 Low and high levels of variables and effect analysis as per PB design
2.3 最佳爬坡试验结果
当拟合区域越靠近响应值中心，响应面拟合方程越精准。最佳爬坡法以各因素正负效应值确定爬坡方向，能够准确逼近最佳值区域。依据PB试验结果设计最佳爬坡路径，其中乳酸钾替代比例为负效应，应减少，氯化钾、氯化镁替代比例为正效应，应增加。按照因素水平的变化方向及步长设计试验。
由图2可知，3号样品的初始菌落总数较高，但后续贮藏12、18、24 h均发现3号样品的抑菌效果均优于其他组样品，故以3号样品的因素与水平为响应面试验的中心点。
图2 最佳陡坡试验拐点图
Fig. 2 Inflection point for total bacterial count in samples stored for different periods of time as per steepest ascent design
A～D. 贮藏6、12、18、24 h。
2.4 Box-Behnken响应面试验结果
根据PB试验和最佳陡坡试验的结果（乳酸钾替代比例17.5%、氯化钾替代比例15.0%、氯化镁替代比例35.0%），采用响应面Box-Behnken试验进一步优化，响应面试验设计及结果如表7所示。
表7 复配盐最佳配方的响应面试验结果
Table 7 Box-Behnken design and experimental response
试验号A乳酸钾替代比例/%B氯化钾替代比例/%C氯化镁替代比例/%菌落总数（lg（CFU/g））1 17.5 15.0 35.0 6.32±0.02 2 15.0 17.5 35.0 6.44±0.02 3 20.0 15.0 32.5 6.37±0.06 4 17.5 12.5 32.5 6.46±0.14 5 20.0 17.5 35.0 6.36±0.05 6 17.5 15.0 35.0 6.30±0.03 7 17.5 15.0 35.0 6.29±0.05 8 17.5 15.0 35.0 6.32±0.03 9 17.5 17.5 37.5 6.56±0.07 10 17.5 15.0 32.5 6.50±0.02 11 17.5 17.5 32.5 6.52±0.03 12 20.0 12.5 35.0 6.51±0.05 13 20.0 15.0 37.5 6.41±0.02 14 15.0 15.0 32.5 6.43±0.02 15 15.0 12.5 35.0 6.59±0.05 16 17.5 12.5 37.5 6.40±0.04 17 17.5 15.0 35.0 6.30±0.06
根据Box-Behnken响应面试验结果，建立回归模型并进行方差分析，由表8可知：模型P值小于0.000 1，高度显著，说明与实际情况拟合良好；失拟项结果表明，未知因素对实验结果干扰小（P值为0.914 0，不显著）；该模型的决定系数R2=0.936 1，说明该模型拟合较好。对于鱼子酱产品，当菌落总数达到6.00（lg（CFU/g））即可认为产品腐败，实验中发现，在27 ℃放置12 h时菌落总数达到 6.00（lg（CFU/g）），因此以27 ℃放置12 h的菌落总数为响应值建立响应面模型。
表8 响应面试验结果回归模型方差分析
Table 8 Analysis of variance of quadratic polynomial model
注：**. 极显著（P＜0.01）。
由图3可知，等高线图均为椭圆形，响应面三维图具有稳定点，且为最大值。对结果进行拟合处理得到的q曲线为：Y=6.316 2-0.031 2A-0.010 0B- 0.009 0C＋0.007 5AC＋0.025 0BC＋0.036 7A2＋0.109 2B2＋0.072 3C2。
图3 乳酸钾、氯化钾和氯化镁替代比例对菌落总数影响的 等高线图和响应面图
Fig. 3 Response surface and contour plots showing the individual and interactive effects of variables on total bacterial count
参照以上试验结果得到的最优钠盐替代物复合配方为乳酸钾替代比例18.55%、氯化钾替代比例15.105%、氯化镁替代比例35.08%，即当正常组氯化钠使用量为4%时，最优钠盐替代物复合配方为乳酸钾添加量0.74%、氯化钾0.60%、氯化镁1.40%，在保证盐渍盐使用量不变的基础上可将氯化钠使用量降至1.26%。
以乳酸钾0.74%、氯化钾0.60%、氯化镁1.40%添加量为实验组，氯化钠组为对照组，进一步测定鱼子酱贮藏过程中品质特性。
2.5 鱼子酱贮藏过程中指标变化
2.5.1 OD600 nm的变化
OD600 nm与透光率呈负相关。由图4可知，实验组与对照组的初始OD600 nm分别为0.375±0.002、0.322±0.040。27 ℃贮藏条件下，随贮藏时间延长均呈现上升趋势，但是实验组的OD600 nm上升趋势较对照组缓慢，到达旺盛生长的对数期所需时间也较长，这与菌落总数的测定结果一致，说明微生物繁殖速度减缓，实验组较对照组可有效抑制微生物的生长。
图4 鱼子酱贮藏过程中OD600 nm的变化
Fig. 4 Changes in OD600 nm in caviar during storage
2.5.2 pH值的变化
由图5可知，在贮藏过程中，鱼子酱的pH值总体均呈现波动趋势，这主要是因为贮藏过程中，磷酸肌酸等[22] 物质分解产生磷酸等酸性物质[23]，使鱼子酱的pH值下降，但随着贮藏时间的延长，鱼子酱中的内源性酶和表面微生物分解蛋白质等含氮化合物[24-25]，产生较多的碱性物质，造成pH值上升[26]。由于贮藏温度与盐渍过程使用的盐用量不同，使上下波动趋势快慢程度不同，各处理组均呈现波动趋势，但是相比对照组而言，实验组的变化趋势较为缓慢，说明实验组的微生物活动滞后，腐败程度与菌落总数存在一定的关系，与菌落总数分析结果基本一致，说明得到的低盐替代配方可以有效减缓微生物活性，进而延缓鱼子酱腐败进程。
图5 鱼子酱贮藏过程中pH值的变化
Fig. 5 Changes in pH value of caviar during storage
2.5.3 色泽的变化
鱼籽本身的生化、微生物变化的外部表现之一是色泽变化，而色泽变化与鱼籽的新鲜度有直接关系。由表9 可知，鱼籽酱贮藏过程中，L*呈现上升趋势但有所波动，这可能是由于在贮藏前期，温度过高，鱼籽表面水分损失较大，表面变得干燥，因此缺少水分的折射，L*降低，随着微生物的加速繁殖与相关酶的作用，鱼籽逐渐腐败萎缩，持水力下降，水分向鱼籽表面渗透，使得表面湿润程度增加，造成L*上升[27-28]。此时，鱼籽质地逐渐变软。实验组与对照组鱼籽酱的a*在贮藏期间呈现先上升后降低的趋势，变化幅度较大。这可能与贮藏过程中水分的析出有关，贮藏前期，表面水分减少，鱼籽表面变得干燥，使a*上升，在贮藏时间到达6 h时，鱼籽的a*升高到最大值，即红色加深；在后续的贮藏过程中，由于水分的析出，表面由干燥逐渐湿润，a*逐渐降低。实验组与对照组鱼籽酱的b*均呈现升高的趋势，变化幅度较大。
表9 鱼子酱贮藏过程中色泽的变化
Table 9 Color change of caviar during storage
2.5.4 aw的变化
由图6可知，实验组与对照组鱼子酱在27 ℃的贮藏温度下aw呈现基本一致的变化趋势，且aw均大于0.90。这与色泽的测定结果相吻合：贮藏过程中，鱼籽表面与内部的水分存在迁移现象，导致aw出现波动[29-30]，但由于贮藏环境为封闭的恒温培养箱，空气流速较小，水分蒸发也较慢，导致实验组与对照组的aw虽呈波动趋势，但总体变化不大。
图6 鱼子酱贮藏过程中aw的变化
Fig. 6 Changes in aw in caviar during storage
3 结 论
本研究以微生物菌落总数为指标，经单因素、响应面等试验确定鱼子酱中最佳钠盐复合物替代配方为乳酸钾、氯化钾、氯化镁的替代比例分别为17.64%、14.61%、34.36%。通过与正常组鱼子酱进行对比发现，实验组鱼子酱aw持续保持在0.9以上、b*均呈现升高的趋势、OD600 nm增长缓慢，表明优化得到的钠盐替代物复合盐可以在一定程度上延长鱼子酱货架期，延缓鱼子酱产品的腐败进程。因此，该钠盐替代物复合盐配方可用于鱼子酱的制备，且能够提高产品质量和安全性，在盐渍品加工行业具有良好的应用潜力。
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