我国是肉类生产与消费大国，据国家统计局公布数据显示，2021年全国肉类总产量8 887 万t[1]。冷鲜肉富含蛋白质等营养物质且水分含量高，导致其在流通、贮藏过程中极易受到微生物侵染，发生腐败变质[2]，产生食品安全和食品资源浪费等问题。新鲜度是肉制品变质过程中外在感官、内部理化特性和微生物生长情况的综合衡量标准[3]。冷鲜肉在微生物和自身酶的作用下会发生腐败变质，产生与新鲜度相关的特征性释放物。已有研究表明，在细菌和酶的作用下，肉类中的少量蛋白质逐渐分解成肽和氨基酸，最后降解成氨、胺等小分子化合物，这些含氮的小分子化合物具有高度挥发性，是肉类腐败气味的主要来源[4]。三甲胺和二甲胺是肉类及水产品中常见的挥发性胺，常被视为表征肉类和海鲜腐败的重要指标[5-7]。冉云等[8]利用三甲胺表征缢蛏贮藏期间新鲜度，结果表明，三甲胺的总量随贮藏时间延长而不断增加。郑刚等[9]利用顶空气相色谱法测定鸡肉、猪肉、火腿中三甲胺含量，结果表明，三甲胺含量随着贮藏时间的延长而呈现上升趋势。胡洋洋等[10]以二甲胺为靶标物质，分析不同温度下鲫鱼的新鲜度，结果表明，二甲胺的总量随贮藏时间延长而不断减少。池叶艳等[11]利用气相色谱法对瓯江淡水鱼中的二甲胺含量进行分析，结果表明，二甲胺含量随着贮藏时间的延长呈现下降趋势。上述研究结果表明，水产品中三甲胺和二甲胺作为新鲜度指标的研究已有初步结论，而冷鲜肉中三甲胺、二甲胺随贮藏时间的变化规律鲜有报道，二者之间的关系尚不明确。因此，本研究以（0.0±0.5） ℃冷鲜羊肉为研究对象，探究三甲胺、二甲胺在羊肉贮藏过程中随新鲜度指标变化的变化规律，确证其能否表征冷鲜羊肉新鲜度，旨在为冷鲜羊肉新鲜度的快速检测技术研发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
6～8 月龄小尾寒羊背最长肌购于北京二商穆香源清真肉类食品有限公司。
2-硫代巴比妥酸 上海源叶生物科技有限公司；三氯乙酸 上海麦克林生化科技有限公司；平板计数 琼脂 北京陆桥技术股份有限公司；乙酸铵、冰醋酸、硫酸铜、二硫化碳 美国Sigma公司；丁基羟基茴香醚、盐酸、氢氧化钠、氧化镁、丙二醇、苯、氨水 国药集团化学试剂有限公司；所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
Testo 205便携式pH计 德国德图公司；SpectraMax 190全波长酶标仪 美国Molecular Devices公司； CM-600D色差计 柯尼卡-美能达办公系统（中国）有限公司；JYH-66恒温恒湿培养箱 上海跃进医疗器械有限公司；垂直单向流洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；SQ810C高压蒸汽灭菌器 上海雅马拓科技贸易有限公司；Kjeltec 2300全自动凯氏定氮仪 丹麦Foss集团有限公司；Ultra Turax Disperser S25匀浆器 德国IKA公司；TSQ 9000气相色谱-质谱联用仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品采集
选取胴体质量、饲养条件相近、性别相同、健康无病的小尾寒羊6 只，宰后胴体预冷24 h后，取双侧背最长肌，均匀分割，约200 g/块。每条背最长肌分割为6 块，共计制得72 个样品，每个样品分装至无菌袋中，置于低温保温箱中2 h内运回实验室；使用PP5聚丙烯塑料盒进行空气密封包装（包装盒规格23 cm×13 cm×4 cm，包装膜厚度100 μm，透氧性＜2 cm3/（m2·d），透湿性＜5 g/（m2·d），气体空间约400 mL）后，于（0.0±0.5） ℃条件下贮藏0、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21 d；处理当天开始，在规定时间点每次随机取出6 个样品进行实验，测定其色泽、菌落总数、总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量等新鲜度指标及三甲胺、二甲胺含量的变化情况。
1.3.2 指标测定
1.3.2.1 色泽测定
参考Li Xin等[12]的方法，用黑白参考校正后的色差计对肉色指标进行测定，在每个样品表面随机选择4 个位点进行测定，结果取平均值。
1.3.2.2 pH值测定
参考Szerman等[13]的方法，将pH计用pH 4.01和pH 7.00 2 种校正液校正后，再将校正后的pH计探头插入羊肉中，深度约2 cm，选取3 个不同位置进行测定，结果取平均值。
1.3.2.3 硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值测定
参考GB 5009.181—2016《食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定》[14]中第二法进行测定，结果用每千克肉中丙二醛的毫克数表示。
1.3.2.4 菌落总数测定参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[15]中规定的方法进行测定。
1.3.2.5 TVB-N含量测定
参考GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[16]中规定的自动凯氏定氮法进行测定。
1.3.2.6 包装及肉中二甲胺含量测定
包装中二甲胺含量的测定参考张勇等[17]的方法，以0.01 mol/L盐酸异丙醇溶液为吸收液，20 mL顶空瓶作吸收瓶，向顶空瓶中加入10 mL吸收液，用注射器抽取包装有肉样的密封包装盒中空气20 mL，缓慢注入吸收瓶中并涡旋混匀；肉中二甲胺含量的测定参考戚勃等[18]的方法，称取搅碎混匀的肉样5 g，置于100 mL离心管中，加入50 g/L三氯乙酸溶液45 mL，匀浆约20 s，5 000 r/min离心10 min，过滤于100 mL容量瓶中；沉淀再重复处理1 次，合并2 次滤液，用50 g/L三氯乙酸溶液定容。
取样品溶液5 mL，再加入1 mL 120 g/L NaOH、1 mL铜铵试剂和10 mL CS2苯溶液，混匀；50 ℃水浴3 min，立即剧烈振摇150 次，再加入1 mL体积分数35%的醋酸溶液，立即振摇120 次，静置30 min；吸取上层显色液，利用酶标仪在434 nm波长处测定吸光度，包装中二甲胺含量用吸收液作空白实验，肉中二甲胺含量用三氯乙酸溶液作空白实验。
包装中二甲胺含量按式（1）计算。
式中：X1为包装中二甲胺含量/（μg/mL）；C为样品溶液中二甲胺含量/μg；C0为吸收液中二甲胺含量/μg； V0为吸收液体积/mL。
肉中二甲胺含量按式（2）计算。
式中：X2为肉中二甲胺含量/（μg/g）；ρ为样品溶液中二甲胺质量浓度/（μg/mL）；V为样品溶液定容体积/mL；m为取样量/g。
1.3.2.7 包装及肉中三甲胺含量测定
包装中三甲胺含量的测定参考GB 5009.179—2016《食品安全国家标准 食品中三甲胺的测定》[19]、 GB/T 14676—93《空气质量 三甲胺的测定 气相色谱法》[20] 并稍作修改：以0.02 mol/L盐酸作为吸收液，向20 mL顶空瓶中加入5 mL吸收液，用注射器抽取空气包装盒中的空气20 mL，缓慢注入吸收瓶中并涡旋，制得提取液。肉中三甲胺含量的测定参照GB 5009.179—2016中的顶空气相色谱-质谱联用法进行测定，结果以每克肉中三甲胺的微克数表示：称取均质后的样品10 g置于50 mL离心管中，加入20 mL 5 g/100 mL三氯乙酸溶液，均质1 min后以4 000 r/min离心5 min，过滤后定容至50 mL， 制得提取液。
准确吸取提取液2.0 mL于20 mL顶空瓶中，加入5.0 mL 1 g/mL氢氧化钠溶液，上气相色谱-质谱仪进行测定。
1.4 数据处理
所有数据使用Excel 2013软件整理，结果以平均值±标准差表示，并进行数据分析与作图，采用Origin 2019软件对三甲胺、二甲胺含量变化作图；采用IBM SPSS 21.0软件中Duncan’s多重检验进行显著性分析；采用IBM SPSS 21.0软件中的Pearson相关性分析冷鲜羊肉新鲜度指标与三甲胺、二甲胺含量的相关性。
2 结果与分析
2.1 冷鲜羊肉贮藏期间新鲜度变化
2.1.1 冷鲜羊肉贮藏期间色泽、pH值变化
羊肉pH值变化与新鲜度相关，是判断羊肉新鲜度的参考指标之一，直接影响肉的色泽、水分损失、保藏性等[21-22]。由表1可知，随贮藏时间延长，冷鲜羊肉pH值整体呈现先上升然后趋于稳定的变化趋势，与张福生等[23]结果一致。
表1 冷鲜羊肉贮藏期间色泽、pH值的变化
Table 1 Changes in color parameters and pH value of chilled mutton during storage
注：同列小写字母不同，表示差异显著（P＜0.05）。
肉色是消费者选择羊肉最主要的参考依据，通常可以根据样品的L*、a*和b*判断肉色好坏。随着贮藏时间的延长，冷鲜羊肉L*、a*、b*整体均呈现先上升后下降的变化趋势。
2.1.2 冷鲜羊肉贮藏期间TBARs值变化
长期冷藏通常会导致肉中脂肪氧化，这是导致肉酸败变质和颜色发生褐变的重要原因之一[24]。本研究对冷鲜羊肉的脂肪氧化情况（2-硫代巴比妥酸法）进行分析，由图1可知，随着贮藏时间的延长，冷鲜羊肉TBARs值整体呈现上升趋势，贮藏0～17 d上升不显著，说明贮藏前期羊肉脂肪氧化不明显，新鲜程度较高，这与贮藏前期冷鲜羊肉呈现亮红色泽的结果一致。贮藏17 d后，冷鲜羊肉TBARs值呈现指数型上升趋势 （P＜0.05），贮藏结束（21 d）时，冷鲜羊肉的TBARs值达到最高（P＜0.05）。
图1 冷鲜羊肉贮藏期间TBARs值变化
Fig. 1 Change in TBARs value in chilled mutton during storage
字母不同，表示不同贮藏时间差异显著（P＜0.05）。下同。
2.1.3 冷鲜羊肉贮藏期间菌落总数、TVB-N含量变化
图3 冷鲜羊肉贮藏期间TVB-N含量变化
Fig. 3 Change in TVB-N content of chilled mutton during storage
由图2～3可知，随着贮藏时间的延长，冷鲜羊肉菌落总数、TVB-N含量整体均呈现上升趋势。在冷鲜羊肉贮藏期间，菌落总数初始值为2.95（lg（CFU/g）），贮藏前13 d，其菌落总数上升不显著；当贮藏到15 d时，菌落总数进入快速增长期，显著升高（P＜0.05），并于17 d时达到6.17（lg（CFU/g）），且超过行业标准 NY/T 632—2002《冷却猪肉》中规定的6（lg（CFU/g））。 冷鲜羊肉贮藏期间，TVB-N含量初始值为10.4 mg/100 g，贮藏前11 d，TVB-N含量上升不显著；当贮藏到17 d时冷鲜羊肉TVB-N含量达到15.17 mg/100 g，且超过国家标准GB 2707—2016中规定的15 mg/100 g；贮藏17～21 d，TVB-N含量呈指数型升高（P＜0.05），实验结束（21 d）时达到27.22 mg/100 g；与菌落总数变化趋势基本一致。本研究中冷鲜羊肉的TVB-N含量与菌落总数变化规律大致表现为菌落总数增长至一定程度时，TVB-N含量进入快速积累状态，这与孙武亮等[25]结果一致。综上所述，冷鲜羊肉贮藏期间色泽、菌落总数、TVB-N含量等新鲜度指标变化结果一致，肉中蛋白质、脂肪逐渐发生氧化分解，颜色发生褐变，进而引起新鲜度下降；在（0.0±0.5） ℃空气密封包装条件下，冷鲜羊肉货架期长达17 d。
图2 冷鲜羊肉贮藏期间菌落总数变化
Fig. 2 Change in TVC in chilled mutton during storage
2.2 冷鲜羊肉贮藏期间二甲胺、三甲胺含量变化
2.2.1 冷鲜羊肉贮藏期间二甲胺含量变化
由图4可知，随着贮藏时间的不断延长，冷鲜羊肉中二甲胺含量整体呈现先上升后下降趋势，贮藏0～1 d时，肉中二甲胺含量显著升高（P＜0.05），贮藏1～3 d时显著降低（P＜0.05），贮藏至9 d后趋于稳定。而包装盒中二甲胺含量在贮藏0～1 d显著上升（P＜0.05），贮藏5～9 d时上升不显著，贮藏11～17 d时显著升高 （P＜0.05），贮藏19～21 d趋于稳定。
图4 冷鲜羊肉贮藏期间二甲胺含量变化
Fig. 4 Change in dimethylamine content in chilled mutton during storage
2.2.2 冷鲜羊肉贮藏期间三甲胺含量变化
由图5可知，随着贮藏时间的不断延长，肉中、包装中三甲胺含量整体均呈现上升趋势。冷鲜羊肉在贮藏0～1、3～5、9～11 d期间，三甲胺含量显著升高 （P＜0.05），13～19 d上升不显著，贮藏结束（21 d）时，三甲胺含量达到最高（15.61 μg/g）（P＜0.05）。包装盒中三甲胺含量在贮藏0～11 d上升不显著，13～15 d时显著升高（P＜0.05），17～21 d上升不显著，贮藏结束（21 d）时，包装盒中三甲胺含量达到最高（0.051 μg/mL） （P＜0.05）。对比冷鲜羊肉中二甲胺含量结果，三甲胺含量明显更高，同时有研究表明，肉类腐败所产众多气体中，三甲胺含量占比高达33%[26]，因此，将三甲胺作为肉类新鲜度的鉴定指标更具潜力。
图5 冷鲜羊肉贮藏期间三甲胺含量变化
Fig. 5 Change in trimethylamine content in chilled mutton during storage
2.3 三甲胺、二甲胺含量与冷鲜羊肉新鲜度各指标间的相关性
为进一步明确三甲胺和二甲胺含量随冷鲜羊肉新鲜度的变化规律，对冷鲜羊肉贮藏期间肉中和包装中三甲胺、二甲胺含量以及新鲜度各指标之间进行相关性分析。由图6可知，肉中三甲胺含量及包装中三甲胺含量均与菌落总数、TVB-N含量、TBARs值呈显著正相关，相关系数分别为0.86、0.75、0.74和0.92、0.96、0.95。肉中二甲胺含量与菌落总数、TVB-N含量、TBARs值均呈负相关，相关系数分别为-0.85、-0.58、-0.60，而包装中二甲胺含量与菌落总数、TVB-N含量、TBARs值均呈正相关，相关系数分别为0.90、0.74、0.65。上述结果表明，三甲胺、二甲胺含量均可用于表征本研究条件下的冷鲜羊肉新鲜度，且包装中三甲胺、二甲胺含量与菌落总数、TVB-N含量、TBARs值的相关系数均高于肉中三甲胺、二甲胺含量与菌落总数、TVB-N含量、TBARs值的相关系数，包装中三甲胺含量与菌落总数、TVB-N含量、TBARs值的相关系数高于包装中二甲胺含量与三者间的相关系数，进一步确证了包装中三甲胺可以作为冷鲜羊肉在该实验条件下的标志气体物质，具有表征冷鲜羊肉新鲜度的能力。
图6 三甲胺、二甲胺含量与各新鲜度指标间相关系数
Fig. 6 Correlation coefficients between trimethylamine and dimethylamine contents and each freshness index
3 讨 论
3.1 冷鲜羊肉贮藏期间新鲜度变化
在贮藏前期冷鲜羊肉呈现亮红色泽，这主要是由于肉中脱氧肌红蛋白与O2结合生成氧合肌红蛋白所致，而随贮藏时间的延长，冷鲜羊肉中氧合肌红蛋白在活性氧作用下会被氧化生成褐色的高铁肌红蛋白，随着高铁肌红蛋白含量的积累，冷鲜羊肉变成暗红色，失去光泽[27]。 在贮藏期间，肉表面渗水使肉样对光的反射能力增强，L*增大[28]，后续由高铁肌红蛋白的积累及脂质氧化产生的自由基与肉中胺类物质反应生成黄色素，使L*降低，色泽变暗，肉表面失去光泽。b*和氧合肌红蛋白与肌红蛋白的相对比值有关，比值越大，b*越大[29]，也有研究表明，b*在贮藏15 d后达到最大，随后逐渐降低，这与肉中微生物的繁殖及水分损失有关[30]。且随贮藏时间的延长，肉中脂肪氧化程度增加，其中含有的不饱和脂肪酸氧化生成的自由基会加速肌红蛋白的氧化，引起肉表面褪色[31]，肉感官品质下降。
肉中含有大量的微生物，在冷藏条件下细菌中的各种酶活性虽然受一定影响，但仍易使脂肪、蛋白质等出现一定程度的分解[32]，产生氨、胺类等含氮的碱性有毒物质，它们以TVB-N的形式存在于肉中，随着贮藏时间的延长，胺类等代谢物积累导致冷鲜羊肉的TVB-N含量和菌落总数在贮藏过程中显著上升。pH值上升主要可能是由于分解代谢消耗了肌肉中所积累的酸性物质[33]。TBARs值也随之不断上升，主要是由于不饱和脂肪酸在氧的作用下发生氧化生成的醛和酮所致[34]，而随贮藏时间的延长，冷鲜羊肉中微生物数量不断增加，羊肉脂肪氧化速率加快，氧化程度加深。本研究中冷鲜羊肉菌落总数和TVB-N含量在17 d时分别达到6.17（lg（CFU/g）） 和15.17 mg/100 g，二者均超过国家标准规定的限值。因此，从以上新鲜度指标可以综合判断本次实验（0.0±0.5） ℃贮藏条件下，冷鲜羊肉的贮藏期为17 d。
3.2 冷鲜羊肉贮藏期间二甲胺、三甲胺含量变化
三甲胺和二甲胺是肉类及水产品中常见的挥发性胺，冷鲜羊肉贮藏前期肉中与包装中二甲胺含量均呈增加趋势，这主要与肉中氧化三甲胺的分解有关，随着贮藏时间延长，微生物的数量增加，分泌出大量的酶分解氧化三甲胺，导致二甲胺含量增加[35]，肉中二甲胺随着贮藏时间的延长不断逸出，包装盒中二甲胺气体含量不断上升。而贮藏后期肉中与包装盒中二甲胺气体含量具有不一致的变化趋势，肉中二甲胺含量下降，这主要是由于羊肉在贮藏期间肌肉纤维结构逐渐破坏，肌纤维间距离增大，其间的空隙不利于二甲胺滞留所致。三甲胺含量呈现显著上升主要是由于肉中天然存在三甲胺、氧化三甲胺以及三甲胺的产生有助于TVB-N含量的增长，但随着贮藏时间的延长，在微生物和酶的作用下，蛋白质、氨基酸降解程度增加，脱氨反应加剧，以及非蛋白质氮化合物的积累使得TVB-N含量在后期才显著增加，且TVB-N含量的增加总是滞后的[36-37]。肉中三甲胺随着贮藏时间的延长不断逸出，使得包装盒中三甲胺气体含量不断上升，主要是由于随着贮藏时间的延长，微生物含量不断增加，氧化三甲胺不断降解成三甲胺所致。
4 结 论
冷鲜羊肉贮藏期间，肉中蛋白质、脂肪逐渐发生氧化分解，颜色发生褐变，失去光泽，进而引起新鲜度下降，在（0.0±0.5） ℃空气密封包装条件下，冷鲜羊肉货架期长达17 d。进一步通过相关分析，证实三甲胺、二甲胺含量与菌落总数、TVB-N含量、TBARs值均具有较强的相关性，且三甲胺的相关性更好，包装中三甲胺气体含量与菌落总数、TVB-N含量、TBARs值的相关系数均达到0.92以上，确证了三甲胺更适于表征与评价本研究条件下冷鲜羊肉新鲜度。
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