盐水鸭作为酱卤肉制品，水分活度高，具有现做即食、不适宜贮藏的特点，因此产品的货架期普遍较短。此外，由于其特殊的低温煮制工艺，不适宜进行高温高压的传统灭菌，故难以大规模生产和扩大销售范围[1]。虽然现有的真空包装或经商业杀菌的盐水鸭具有较长的保质期，但其特有的香酥口感和风味会受到影响。因此，开发一种适用于低温肉制品的新型杀菌技术是目前该行业发展的重要瓶颈。
低温等离子体（cold plasma，CP）作为食品行业的一种新型杀菌技术，具有处理温度低、营养物质破坏小、不破坏产品质构、显著延长食品保质期等优点，近年来备受关注[2-4]。在高压条件下，空气被电离形成含有活性氧、活性氮、原子、电子、离子的第4态，即为等离子体[5-6]。CP处理过程中产生的活性氧和活性氮等活性物质已被证明有利于微生物的失活[7-8]，但当CP应用于肉类等食物时，会导致脂质氧化，影响其感官品质[3,9]。Choi等[10]研究发现，鱼干经等离子体处理后其硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值与对照组相比增加1.5 倍。Wang Xiaoting等[11]采用介质阻挡放电CP处理牛肉饼，结果表明，在贮藏过程中CP处理组样品的TBARs值显著升高。但当一种新的杀菌技术应用于食品时，在保证高效杀菌的同时必须确保不会对产品产生重大影响。微生物污染和脂质氧化是肉质恶化的主要原因，会导致肉的色、香、味发生不良变化，营养价值和安全性降低[12]，因此，调控肉的脂质氧化现象具有重要意义。富含酚类物质的精油是一个很好的选择，它已被广泛应用于食品的抗氧化[13-14]。此外，精油也可用于食品的抗菌保鲜，其抗菌活性与单萜类、酚类、醛类和酮类化合物密切相关[15]。Viuda-Martos等[16]发现，精油中活性成分会作用于细菌细胞膜的磷脂层，并破坏脂质和蛋白质的结构。El Atki等[17]进一步指出，不同精油经复合后，在不增加浓度的情况下可提高其抗菌效果，如将肉桂精油与其他植物精油复合后，与单一精油相比，对细菌的抑菌效果显著提高。
本研究采用复合精油（牛至精油、肉桂精油、迷迭香精油）协同CP技术对盐水鸭进行处理，以实现在杀菌和保持产品品质上达到平衡。研究CP处理对复合精油基础理化性质，包括大肠杆菌抑菌性、总酚含量、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率的影响；并将复合精油协同CP处理盐水鸭，对贮藏期内盐水鸭的菌落总数、大肠杆菌菌落总数、色泽及TBARs值进行测定，为复合精油协同CP技术在低温肉制品保鲜中的应用提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
盐水鸭由南京盐水鸭加工企业提供。
牛至精油 上海Macklin科技有限公司；肉桂精油上海源叶生物科技有限公司；脂溶性迷迭香 上海瑞祥生物科技有限公司；福林酚 上海瑞永生物科技有限公司；没食子酸 上海阿拉丁生物科技有限公司；DPPH 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。
1.2 仪器与设备
MAP-H360盒式气调保鲜包装机 苏州森瑞保鲜设备（科技）有限公司；BK130/36介质阻挡放电CP设备美国Phenix Technologies公司；CR-400色差仪日本柯尼卡-美能达控股公司。
1.3 方法
1.3.1 复合精油的制备
用体积分数40%乙醇溶液分别配制质量分数均分别为0.050%、0.075%、0.100%、0.125%的牛至精油和肉桂精油，将2 种相同质量分数的精油再与0.3 g/kg脂溶性迷迭香混合，复合精油质量分数以牛至精油/肉桂精油的质量分数计。复合精油的具体配制方法如下：称取30 mg脂溶性迷迭香提取物于250 mL烧杯中，加入50 µL相应质量分数的牛至精油和肉桂精油，加入40 mL无水乙醇，超声至完全分散，再加入60 mL无菌超纯水，超声15 min。
1.3.2 CP协同复合精油的抑菌实验
从-40 ℃取出传代培养2 次的大肠杆菌菌种保藏管，加至营养肉汤中进行活化，于37 ℃、300 r/min的条件下培养10 h。菌液4 ℃、7 500 r/min离心10 min，去上清，生理盐水清洗3 次，通过调整菌液光密度将菌液浓度稀释至108 CFU/mL。
将菌液转移至无菌12 孔板中，每5 mL菌液中加入1 mL复合精油，轻微混匀。将孔板置于聚乙烯热成型盒（17 cm×12 cm×3.2 cm）内，用包装机进行聚丙烯薄膜密封。随后置于CP设备内进行处理，处理电压65 kV[18]，处理时间30 s，处理后放置2 h。将未经CP处理的组别作为对照组，经CP处理的组别记为CP组。参照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》对大肠杆菌菌落数进行测定。
1.3.3 复合精油总酚含量的测定
参照Thiruvengadam等[19]的方法并略作修改。用体积分数40%乙醇溶液配制0.1 mg/mL没食子酸溶液，取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL没食子酸溶液置于具塞玻璃管中，分别加入6 mL超纯水和0.5 mL 1 mol/L福林酚试剂，轻微振荡后，避光静置10 min。用0.1 g/mL Na2CO3溶液分别定容至10 mL，充分混匀，置于暗处反应2 h，用紫外分光光度计于763 nm波长处测定吸光度，并绘制该质量浓度梯度下的标准曲线。
吸取0.1 mL经CP处理或未经CP处理的复合精油，加入6 mL超纯水和0.5 mL福林酚试剂，振荡混匀避光静置10 min后，加入3.4 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，置于暗室使其充分反应2 h，于763 nm波长处测定吸光度，根据标准曲线得到总酚含量。样品中总酚含量以每克样品所含没食子酸质量计，单位为mg/g。
1.3.4 复合精油DPPH自由基清除率的测定
参照Li Xican等[20]的方法稍作改进。称取8 mg DPPH，用100 mL无水乙醇充分溶解，制得0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液（现配现用）。吸取2 mL经CP处理或未经CP处理的复合精油于具塞试管中，并与等体积DPPH溶液振荡均匀，室温暗处静置反应0.5 h，于517 nm波长处测定吸光度。同时，测定2 mL DPPH溶液与2 mL体积分数40%乙醇溶液混合后的吸光度。复合精油的DPPH自由基清除率按式（1）计算。
式中：A0为DPPH溶液与体积分数40%乙醇溶液反应后的吸光度；A样为DPPH溶液与复合精油反应后的吸光度。
1.3.5 盐水鸭样品处理
将盐水鸭切块，部分样品置于聚乙烯热成型盒（17 cm×12 cm×3.2 cm），每盒100 g，用包装机进行聚丙烯薄膜密封；另一部分样品置于0.100%复合精油（由1.3.2节得出的最优质量分数）中浸泡5 min，沥干后包装密封。按表1条件进行处理，于4 ℃贮藏。贮藏至0、6、12、18 d时，从4 组中各随机抽取3 盒进行各项指标的测定。
表1 盐水鸭样品的不同处理条件
Table 1 Different treatment conditions for salted duck samples
组别处理电压/kV处理时间/min处理次数间隔时间/min对照组直接4 ℃贮藏CP组65230.5复合精油处理组（EO组）直接4 ℃贮藏先经复合精油处理再经CP处理组（EO＋CP组）65230.5
1.3.6 盐水鸭中菌落总数及大肠杆菌的测定
参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》进行菌落总数测定，参照GB 4789.3—2016进行大肠杆菌测定。
1.3.7 盐水鸭色差值的测定
采用色差仪测定样品表面亮度值（L*）、红度值（a*）和黄度值（b*），每个样品测定3 次，每组随机选3 个样品，样品总色差（ΔE）按式（2）计算[21]。
式中：L0*、a0*和b0*为样品初始颜色参数；L*、a*和b*为样品贮藏过程中的颜色参数。
1.3.8 盐水鸭TBARs值的测定
参照Xiong Zhenjie[22]、彭泽宇[23]等方法并加以修改。称取（10.0±0.1）g肉样，剪碎后加入50 mL 75 g/L三氯乙酸溶液，混匀，加塞密封，于37 ℃下恒温水浴振荡30 min，用双层滤纸过滤2 次，加入5 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液，混匀，于90 ℃下水浴40 min，取出冷却至室温，7 000 r/min离心10 min，取上清。在上清液中加入5 mL氯仿，混匀，静置分层，取上清于532 nm波长处测定吸光度。TBARs值按式（3）计算。
式中：m为样品质量/g；A532 nm为样品在532 nm波长处的吸光度。
1.4 数据处理
所有实验重复3 次，采用SPSS Statistics 20.0软件进行单因素方差分析。采用Duncan’s多重比较法进行显著性分析（P＜0.05）。对于总酚含量和DPPH自由基清除率测定结果采用t检验法进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 CP协同复合精油对大肠杆菌的抑菌效果
由图1可知，当不添加复合精油时，40%乙醇溶液对大肠杆菌几乎没有抑菌性，协同CP处理30 s后，对大肠杆菌的抑菌效果仍不明显，仅能降低0.56（lg（CFU/mL））。随着复合精油质量分数的增加，大肠杆菌菌落数随之降低，且当复合精油协同CP处理时，对大肠杆菌的抑菌效果更为明显。当复合精油质量分数为0.075%且协同CP处理时，大肠杆菌菌落数由5.2（lg（CFU/mL））降至2.75（lg（CFU/mL））。当复合精油质量分数为0.100%～0.125%且协同CP处理时，大肠杆菌未检出。El Atki等[24]研究发现，肉桂精油与百里香酚和香芹酚复合使用对大肠杆菌具有显著的抑菌作用。此外，肉桂精油中的主要活性成分肉桂醛具有较好的保鲜抑菌性，但分子遇光、热、氧不稳定易降解，与天然多酚复配可有效提高肉桂醛的稳定性[25]。以上结果表明，CP协同复合精油处理会加速细菌的死亡。
图1 复合精油协同CP处理对大肠杆菌抑菌效果的影响
Fig.1 Inhibitory effect of essential oil blend combined with CP on E.coli
2.2 CP处理对复合精油总酚含量和DPPH自由基清除率的影响
由表2可知，随着复合精油质量分数的增加，其总酚含量和DPPH自由基清除率显著提高。且随着总酚含量的增加，对应的DPPH自由基清除率也随之增强，表明复合精油的抗氧化能力逐渐增强，这与卢俊宇等[26]研究中茶多酚复合膜总酚含量和DPPH自由基清除率的变化趋势一致。与对照组相比，CP组总酚含量略有下降，由0.27～0.43 mg/g降至0.25～0.41 mg/g；DPPH自由基清除率也略有降低，从89.11%～94.25%降至88.91%～93.52%。以上结果表明，CP处理并不会对复合精油的总酚含量和DPPH自由基清除率造成显著影响。但Umair等[27]研究表明，CP处理会对胡萝卜汁中酚类物质的稳定性造成影响；同时Kodama等[28]研究发现，CP处理会造成柑橘精油中烯萜类物质含量降低。这可能归因于复合精油的初始总酚含量相对较高，且CP处理电压及时间相对较低/短，故未对复合精油的抗氧化特性造成显著影响。
表2 CP处理对复合精油总酚含量和DPPH自由基清除率的影响
Table 2 Effect of CP on the total phenol content and DPPH radical scavenging capacity of essential oil blend
注：同行小写字母不同，表示对照组与CP组之间差异显著（P＜0.05）。
总酚含量/（mg/g）DPPH自由基清除率/%对照组CP组对照组CP组0.0500.27±0.01a0.25±0.01a89.11±0.26a88.91±0.46a 0.0750.34±0.02a0.36±0.01a91.76±0.95a91.82±1.06a 0.1000.38±0.01a0.37±0.02a93.57±0.19a92.65±0.10b 0.1250.43±0.02a0.41±0.01a94.25±0.26a93.52±1.06a复合精油质量分数/%
2.3 不同处理条件对盐水鸭菌落总数及大肠杆菌的影响
由图2可知，对照组菌落总数在贮藏18 d内由4.46（lg（CFU/g））增至6.52（lg（CFU/g）），CP组由2.97（lg（CFU/g））增至5.69（lg（CFU/g）），EO组由3.12（lg（CFU/g））增至6.23（lg（CFU/g）），而EO＋CP组仅由2.12（lg（CFU/g））增至5.01（lg（CFU/g））。以上结果表明，CP处理和EO处理均对样品具有抑菌效果，且EO协同CP处理的抑菌效果更为显著。按照GB 2726—2016《食品安全国家标准 熟肉制品》，对照组菌落总数贮藏6 d已达到临界值4.903（lg（CFU/g）），相比之下，EO＋CP组抑菌效果最佳，当贮藏至12 d时其菌落总数为3.75（lg（CFU/g）），仍低于临界值，且贮藏18 d时才增至5.01（lg（CFU/g））。由此可知，EO协同CP处理可显著降低盐水鸭中的菌落总数，这与Moradi[29]、Gao Yue[30]等的研究相一致。
图2 复合精油协同CP处理对贮藏期内盐水鸭菌落总数的影响
Fig.2 Effect of essential oil blend combined with CP on the total bacterial count of salted duck during storage
小写字母不同，表示同一贮藏时间组间差异显著（P＜0.05）。图3～6同。
由图3可知，贮藏0 d时，EO组与EO＋CP组大肠杆菌菌落数无显著差异，分别为1.08、0.87（lg（CFU/g）），对照组和CP组分别为2.65、1.89（lg（CFU/g））。但随着贮藏时间的延长，EO组与EO＋CP组的差异增大，EO＋CP组菌落数增长更为缓慢，表明CP处理和复合精油具有较好的协同抑菌作用。
图3 复合精油协同CP处理对贮藏期内盐水鸭大肠杆菌菌落数的影响
Fig.3 Effect of essential oil blend combined with CP on E.coli count of salted duck during storage
2.4 不同处理条件对盐水鸭色泽的影响
肉品的色泽和外观是消费者首要考虑的产品属性[31]。ΔE越大，表明样品的色差值与原始色泽之间的差异越大。由图4可知，随着贮藏时间的延长，盐水鸭ΔE显著上升，这可能与样品表面的腐败变质程度有关[32]。
图4 复合精油协同CP处理对贮藏期内盐水鸭ΔE的影响
Fig.4 Effect of essential oil blend combined with CP on the ΔE of salted duck during storage
由图5可知，当4 组样品贮藏18 d时，对照组已经明显发生腐败变质，肉色变暗，样品表面出现小颗粒状物质，且具有黏性。相比之下，在贮藏过程中，CP组和EO组间的ΔE差异不显著（图4），在贮藏末期，2 组样品表面只是部分出现颗粒状异物。EO＋CP组样品则在外观色泽上品质最佳。
图5 复合精油协同CP处理对贮藏18 d后盐水鸭外观的影响
Fig.5 Effect of essential oil blend combined with CP on the appearance of salted duck after 18 days of storage
A～D.分别为对照组、CP组、EO组和EO＋CP组。
2.5 不同处理条件对盐水鸭TBARs值的影响
TBARs值反映丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，MDA是脂质二级氧化的主要产物，也是肉类制品中最常用的脂质氧化指示物。由图6可知，样品的TBARs值随着贮藏时间的延长而增加，对照组样品由1.91 mg/kg增至5.84 mg/kg，CP组由3.29 mg/kg增至6.87 mg/kg，EO组由0.94 mg/kg增至3.95 mg/kg，而EO＋CP组仅由1.12 mg/kg增至4.58 mg/kg。在所有组别中，CP组样品的TBARs值最高，EO组最低。此外，EO＋CP组样品的TBARs值低于对照组。表明复合精油处理不仅能缓解CP处理对盐水鸭造成的脂质氧化，且能减弱样品自身在贮藏期内的脂质氧化现象。这与Gao Yue等[30]的研究结果一致，在鸡肉饼中添加1%迷迭香提取物可显著降低CP处理和非CP处理组样品贮藏期内的TBARs值。
图6 复合精油协同CP处理对贮藏期内盐水鸭TBARs值的影响
Fig.6 Effect of essential oil blend combined with CP on TBARs value of salted duck during storage
3 结 论
本研究分析复合精油协同CP处理对盐水鸭品质的影响，以调控CP处理导致的肉品脂质氧化现象。结果表明：当复合精油质量分数为0.100%～0.125%且协同CP处理大肠杆菌菌液时，大肠杆菌未检出；且CP处理未对复合精油的抗氧化特性造成显著影响；同时，复合精油协同CP处理可使盐水鸭贮藏时间显著延长，且对表观品质无显著影响，并能减缓产品贮藏过程中的脂质氧化现象。本研究结果为低温肉制品的保鲜提供了参考，为分析其在肉制品中应用的可行性及前景，后续研究将进一步探讨精油与CP联合处理对产品风味的影响。
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