原料肉在一定环境条件下，经过微生物长时间发酵，得到具有较优风味、口感、较长贮藏期的发酵肉制品[1]。一方面，发酵过程中，肉中的蛋白质在微生物及酶的共同作用下产生大量能赋予产品独特风味和营养的氨基酸；另一方面，肉制品本身具有或发酵过程中产生的大量有益微生物通过抑制腐败微生物的生长繁殖及有害物质的产生，使其安全性得到一定提高。目前，风味独特、保质期较长的发酵肉制品广受国内外消费者的喜爱[2-3]。
作为传统发酵肉制品的酸肉，在湖南、广西、贵州、四川等地食用较多，它是将新鲜肉清洗后切片，加入一定量的食盐、辣椒粉等辅料入坛，密封后自然发酵而成，因具备良好的营养价值和防腐性能广受消费者喜爱[4-6]。原料肉中蛋白质降解、脂类氧化、美拉德反应等赋予发酵酸肉独特的风味特征[7-9]。无论是酸肉自身存在的微生物，还是将微生物作为人工发酵剂添加到酸肉中，对风味的形成均有重要贡献作用[10-11]。20 ℃和25 ℃是生产酸肉的最佳发酵温度，能在保证产品品质的前提下获得更长保质期[12]。范晓文等[13]从酸肉口感、风味等角度分析发现，60 d左右的保藏时间最适宜，最长不应超过90 d。近年来，固相微萃取-气相色谱-质谱联用（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectroscopy，SPME-GC-MS）技术结合相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）或OAV被广泛用于检测并确定食品中起关键作用的挥发性物质[14-16]。
本研究通过SPME-GC-MS检测4 个发酵时期酸肉中的挥发性物质，并筛选出OAV≥1的物质，确定各个阶段的主体风味，最后通过主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）得到发酵过程中发生显著变化的成分，为提升传统发酵酸肉品质及探讨主体风味形成机制提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
新鲜后腿猪肉 湖南省长沙市东之源超市。
加碘精制食用盐、5 2°浓香型白酒、浏阳炒米（咸味） 湖南省长沙市步步高超市。
1.2 仪器与设备
Premium U410超低温冰箱 英国New Brunswick Scientific公司；ATY124电子天平 岛津企业管理（中国）有限公司；Synergy UV超纯水机 武汉佰蕾真生物科技有限公司；萃取瓶（带聚四氟乙烯隔垫） 北京海富达科技有限公司；固相微萃取手动进样器、65 μm PDMS/DVB萃取头 美国Supelco公司；7000D气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司。
1.3 方法
1.3.1 样品制备
参考侗族传统酸肉的做法并做部分改进。将清洗干净的新鲜后腿肉切成厚度约为0.5 cm的小块，以原料肉质量为基准加入3%食盐，搅拌数分钟后腌制1 h，沥干盐水，加入3 mL/100 g白酒，撒上适量焦黄色炒米，吸收渗透出的盐水，最后在密封罐底部铺满一层炒米，将肉装入坛中压实密封，且每放置一层鲜肉铺一层炒米。置于通风良好的室内，自然发酵。分别取发酵0、10、30、50 d的样品，用绞肉机搅碎后分装至6号密封袋中于-20 ℃冰箱中保存，以备后续实验。
1.3.2 挥发性风味物质分析
SPME条件：称取3 g样品装入10 mL萃取瓶，60 ℃温度条件下，将固相微萃取头插入萃取瓶中平衡5 min后推出纤维头，离样品1 cm左右提取其中香气成分；萃取40 min后将萃取头插入GC进样口，250 ℃条件下以无分裂模式解吸5 min，开始GC-MS分析。
G C条 件：色 谱 柱 为H P-5 M S毛 细 管 柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），以纯度≥99.999%的氦气作为载气，流速控制在1.0 mL/min，进样口温度250 ℃；升温程序设置如下：50 ℃保持1 min，8 ℃/min升至130 ℃，保持1 min，最后以15 ℃/min升至280 ℃，保持2 min；后运行程序：280 ℃、3 min；不分流进样。
MS条件：电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，质量扫描范围m/z 30～450，电离方式：电子电离源。
定性及定量：将所识别到的挥发性物质质谱相关参数（离子碎片、质荷比）与NIST17.L质谱数据库进行比对，筛选得到匹配度大于80%的化合物进行分析；通过峰面积归一化法得到酸肉发酵过程中各挥发性组分的相对含量（%）。
1.3.3 OAV计算
根据文献[17]确定各组分风味阈值，按下式计算酸肉发酵过程中挥发性物质的OAV。
式中：Ci为某挥发性成分含量/（μg/kg）；OTi为该物质对应的阈值/（μg/kg）。
1.4 数据处理
采用OriginPro 7.5、TBtools软件作图；采用SPSS Statistics 25.0软件进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著；PCA和PLS-DA通过SIMCA-P 14.0软件实现。实验均进行3 次重复。
2 结果与分析
2.1 酸肉发酵过程中挥发性物质分析
由图1和表1可知，酸肉发酵过程中4 个发酵时期共鉴定出106 种挥发性风味物质，包括酯类32 种、酸类2 种、醇类11 种、醛类16 种、酮类3 种、碳氢化合物29 种及其他类化合物13 种。在发酵0、10、30、50 d的酸肉中分别发现37、53、54、50 种挥发性风味物质。随着发酵时间延长，原料肉中内源酶发挥作用，样品中的大分子物质氧化水解生成大量风味前体物质，酸肉中的挥发性物质种类迅速增加，以酯类、酸类、醇类、醛类物质为主。酯类物质在整个发酵过程呈显著上升的变化趋势，经过50 d的自然发酵后，其相对含量由鲜肉中的1.58%显著增加至52.20%，主要以丁酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、戊酸乙酯等能赋予酸肉水果香和奶油香味的乙酯类物质为主。可能是由于发酵后期醇类不断氧化生成醛类或与酸类合成酯类，整个发酵过程中醇类的相对含量先增后减，发酵10 d时相对含量最高，为17.52%。鲜肉中未鉴定出酸类物质，在10～50 d发酵过程中仅检测到己酸、正戊酸2 种酸类物质，其总相对含量在发酵后无显著变化。碳氢类化合物相对含量在原料肉中最高（9.80%），经过60 d的发酵，相对含量仅为0.56%。范晓文等[13]在发酵0～180 d的发酵酸肉中共检测到104 种挥发性物质，其中酯类、碳氢类物质、酮类物质含量在整个发酵过程变化显著（P＜0.05）；周才琼等[18]发现，发酵60 d期间，酸肉中的风味物质从31 种增加至85 种，主要体现为酯类物质的增加；张倩等[5]在贵州荔波传统酸肉中检测到34 种以酸类、醛类为主的挥发性物质。
图1 传统发酵酸肉中挥发性风味化合物种类数（A）及其相对含量（B）变化
Fig. 1 Changes in the types (A) and relative contents (B) of volatile compounds in sour meat during fermentation
表1 酸肉发酵过程中挥发性风味成分组成
Table 1 Composition of volatiles during sour meat fermentation
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续表1
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续表1
注：同行小写字母不同，表示不同发酵时间差异显著（P＜0.05）。
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2.2 OAV确定发酵酸肉中关键风味成分
续表2
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检测到的各挥发性物质含量及其对应的感觉阈值决定了传统发酵肉制品的风味特征。OAV≥1被认为该挥发性物质对酸肉整体风味具有重要贡献作用，挥发性物质对整体风味的贡献度与其OAV呈正比[19-20]。106 种挥发性物质中筛选出49 种OAV≥1的物质，即对酸肉风味具有贡献作用的物质，由表2可知，发酵0、10、30、50 d酸肉中的关键风味物质分别有16、28、31、27 种。通过绘制相关热图直观展示各个发酵时期酸肉中的关键风味物质。
表2 不同发酵阶段酸肉中关键挥发性成分阈值及OAV
Table 2 Threshold values and OAV of key volatile components in sour meat at different fermentation stages
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由表2及图2可知，发酵过程对酸肉整体风味起重要贡献作用的主要为酯类，其次为醛类和醇类物质。余冰等[21]对发酵60 d酸肉中检测出的挥发性物质进行分析，得出己酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醇等为主体物质。同时，黄群等[22]对湘西酸肉中的挥发性成分进行分析，得出酯类、醛类为主要风味贡献源，与本研究结果一致。
酯类物质是发酵肉制品中最普遍的挥发性风味物质，阈值较低，能给产品带来果香和花香，主要来源于醇和酸发生的酯化反应，酸肉发酵后的样品中均检测出高含量的乙酯[23-24]。研究发现，发酵肉制品中酯类物质的含量与其成熟风味成正比[25]。相关研究证明，酸肉发酵后期形成的乙酸己酯、壬酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等乙酯类物质OAV较高，是发酵酸肉中的主体风味物质[18,21]。常荣[26]在研究发酵保藏对酸肉食用品质的影响中发现，具有果香和酒香的辛酸乙酯、癸酸乙酯等是酸肉独特酯香味的重要来源。由表2及图2可知，酯类物质对鲜肉风味的贡献作用并不显著。
图2 不同发酵时期酸肉中关键风味物质热图分析
Fig. 2 Heat-map analysis of key flavor compounds in sour meat at different fermentation periods
同样作为发酵肉制品中的主要风味物质，醇类发酵前期相对含量的显著上升主要来源于添加的白酒等辅料，而随着发酵的进行，醇类不断转换成醛类、酯类物质，含量降低。周才琼等[18]发现，酸肉发酵60 d后，醇类物质含量降低26.48%。1-壬醇、庚醇、1-辛醇等OAV较高的直链醇对酸肉风味有贡献作用。1-辛烯-3-醇是传统腌腊肉制品中的主要醇类物质，主要体现在发酵香肠中[27]，但在本研究中因其含量较低，对酸肉整体风味不具有贡献作用。整体而言，虽然大部分醇类物质阈值较高，但与酸反应产生的酯类是酸肉的主体风味物之一。
酸肉脂质自氧化产生的饱和/不饱和醛，由于其阈值较低[28]，对酸肉整体风味贡献较大，主要有壬醛、癸醛、(E)-2-庚烯醛、(E)-2-壬烯醛等具有清香味的物质，一定程度上能降低酸肉的油脂味。赋予酸肉脂肪、柑橘和青草味的壬醛通常被认为是肉制品的主要香味来源[29]。苯乙醛、正辛醛为原料肉中的主体挥发性成分，发酵后未检出。
整个发酵过程仅鉴定出2 种酸类、3 种酮类物质，酸类物质来源于甘油三酯、磷脂等脂肪的水解及氧化[30]，戊酸、己酸等短链脂肪酸对酸肉特殊风味的呈现均具有促进作用，张倩等[5]发现，己酸等酸类物质为贵州荔波酸肉中主要挥发性成分，酸类物质含量占挥发性成分总量的44%。且正戊酸、己酸是形成酯类的重要前体物。酮类物质中仅2-庚酮（水果香）对风味有贡献作用，2-庚酮来源于葡萄球菌等微生物的不完全β-氧化，使产品具有典型的发酵风味[31]。
碳氢类化合物作为鲜肉中含量最高的一类挥发性物质，仅在发酵初期表现出对鲜肉整体风味具有贡献作用，发酵60 d时仅十六烷的OAV大于1。碳氢化合物阈值较高，对发酵肉制品风味形成贡献不突出。研究表明，酸肉发酵过程美拉德反应产生的吡嗪、呋喃类物质[32]，如2,6-二甲基吡嗪、2,6-二乙基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪等对整体风味也有一定的影响。
2.3 酸肉中关键挥发性成分的PCA及PLS-DA
对酸肉风味具有贡献作用的挥发性成分建立PCA和多元统计分析PLS-DA法，探讨不同发酵期样品风味物质的差异，初步探索酸肉发酵过程中风味物质变化规律。对OAV≥1的挥发性物质进行PCA，提取特征值大于1、总贡献率达到80%的主成分[33]。
由表3可知，前3 个主成分的累计贡献率达到92.777%，能更客观地反映酸肉发酵过程中的挥发性物质变化趋势，在此基础上对前3 个主成分进行PCA和层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）。
表3 主成分的特征值及累积贡献率
Table 3 Eigenvalues and cumulative contribution rates of first three principal components
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由图3可知，样品组内具有良好的重复性，未发酵的原料肉与发酵不同时长的酸肉间表现出显著差异，发酵30 d与50 d的样品距离相近，表明发酵后期酸肉主体风味物质变化趋于稳定。
图3 不同发酵时期酸肉中关键风味化合物的PCA（A）和HCA（B）Fig. 3 PCA (A) and HCA (B) plots of key flavor compounds in sour meat at different fermentation periods
在此基础上，对关键挥发性物质进行PLS-DA，找出不同发酵阶段酸肉呈现不同风味特征的差异代谢物。一般通过投影变量重要性（variable importance in the projection，VIP）筛选差异物，VIP≥1的物质被确定为差异代谢物[34]。
由图4可知，4 个发酵时期共筛选出13 种发生显著变化的挥发性物质，分别为烟酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丙二酸二乙酯、正戊酸、己酸、正己醇、庚醇、1-戊醇、(E)-2-庚烯醛、壬醛、正辛烷。其中，烟酸乙酯、1-戊醇、(E)-2-庚烯醛、正辛烷等物质主要存在于发酵初期（0、10 d），发酵后期含量显著下降。丁酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丙二酸二乙酯、正戊酸和壬醛在发酵中不断积累，为传统发酵酸肉中的主体风味物质。
图4 不同发酵时期酸肉中关键风味化合物的PLS-DA
Fig. 4 PLS-DA plot of key flavor compounds in sour meat at different fermentation periods
红色柱形图代表VIP≥1的差异代谢物。
3 结 论
采用SPME-GC-MS从鲜肉及发酵10、30、50 d的酸肉中鉴定出106 种挥发性风味物质，以酯类、醇类、醛类及碳氢类化合物为主，还有少量的酮类、酸类物质。在检出的挥发性风味物质中，酯类物质含量最为丰富，整个发酵过程中不断增加，其相对含量由1.58%显著增加到52.20%，辛酸乙酯、丙二酸二乙酯、丁酸乙酯等乙酯类物质占多数。醇类、醛类物质相对含量呈先上升后下降的变化趋势，己醇、1-辛烯-3-醇、己酸、壬醛等相对含量较高。以OAV≥1为筛选指标，得到不同发酵时期促进酸肉风味形成的挥发性成分49 种。阈值较低的酯类、醛类物质，如庚酸乙酯、癸酸乙酯（酯香味）及壬醛（青草味）对酸肉风味物质的产生具有贡献作用。作为鲜肉中的主要风味物质，碳氢类化合物相对含量随发酵时间的延长而不断下降，且其阈值较高，不构成酸肉的主体风味。
为更好分析酸肉发酵过程中关键风味物质的动态变化，对OAV≥1的挥发性物质进行PCA和PLS-DA，PCA结果显示，各样品组内重复性好，组间差异大，即未发酵的鲜肉与发酵一定时期的酸肉风味组成存在显著差异。通过PLS-DA得出13 种发生显著变化的挥发性风味物质（VIP≥1），这13 种差异代谢物促使不同时期的发酵酸肉具有不同的风味特征。处于发酵后期的酸肉，整体风味物质变化较稳定，在三大物质的分解代谢及微生物作用下，属于发酵酸肉特有的风味特征随着发酵时间延长逐渐呈现出来。酸肉中风味产生机制及微生物群落演替对挥发性风味物质产生的影响还需进一步研究。
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