随着人们生活水平的提高，水产品越来越成为消费者喜爱的食品，水产品具有口感鲜美、低脂肪、蛋白含量高、营养成分丰富[1]、种类多、分布广等优点，满足人们对多样化食物的需求和高营养食品的追求[2]。砷是普遍存在的一种有毒重金属，人体摄入后会使体内蛋白变性，与细胞内生物酶结合，损害酶功能，造成代谢障碍，还会影响中枢神经系统，造成脑细胞损伤[3]，严重影响人体健康。在自然环境中，砷元素主要以有机砷和无机砷的形态存在，无机砷主要有砷酸根（As5+）和亚砷酸根（As3+），食用高含量无机砷食物会引发人体急性中毒，如长期摄入低含量无机砷水产品则会造成皮肤、血管和内脏等器官的损伤，并伴有慢性中毒等临床表现。而有机砷主要为砷甜菜碱（arsenic betaine，AsB）、砷胆碱、一甲基砷（monomethyl arsenic，MMA）和二甲基砷（dimethyl arsenic，DMA）等[4]，一般认为有机砷为低毒或无毒[5]。水产品会对环境中的砷有一定的富集 作用[6]，因此水产品中总砷含量较高，主要以有机砷的形态存在，但由于工业有毒物质的排放和水体环境污染提高了水产品体内富集无机砷等有毒物质的风险[7]，消费者也对有毒物质具有较高的关注。因此，研究完善水产品中多种形态砷的检测方法十分必要。
当前，对于砷总量的检测方法主要有原子荧光光谱法[8]、 电感耦合等离子体（inductively coupled plasma，ICP）- 发射光谱法、ICP-质谱法[9-10]、化学分析法[11-12]等，对于不同形态砷的检测主要是利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法实现不同形态砷分离，例如，HPLC-原子荧光光谱法[13-16]、HPLCICP-质谱法[17-20]等，也可利用毛细管电泳-ICP-质谱法[21]和气相色谱-质谱法[22]等。HPLC-原子荧光光谱法[23-25] 需要对AsB进行氧化处理后才能检测，操作步骤相对复杂；毛细管电泳-ICP-质谱法[26-28]操作较为复杂，检测效率较低，无法满足大量待测样品的检测；气相色谱-质谱法[29-30]测定的不同形态砷有一定局限性。
本研究采用HPLC-ICP-串联质谱（HPLC-ICP-tandem mass spectrometry，HPLC-ICP-MS/MS）法，通过实验优化分离方法与仪器参数，建立一种适用于常见水产品中形态砷的检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
水产品（海水鱼类5 批次、贝类5 批次、海水虾蟹类5 批次、淡水鱼类5 批次、淡水虾蟹类5 批次） 市场采购。
1 000 μg/mL As3+标准溶液、990.4 μg/mL As5+标准溶液 上海安谱实验科技股份有限公司；DMA标准溶液（砷含量0.706 μmol/g）、MMA标准溶液（砷含量0.335 μmol/g）、AsB标准溶液（砷含量0.518 μmol/g） 中国计量科学研究院；无水乙酸钠、磷酸二氢钠、 硝酸钾、乙二胺四乙酸二钠（均为分析纯）、氨水（优级纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；磷酸二氢铵（分析纯） 天津光复化学试剂公司；一级水（电阻率18.2 MΩ·cm）。
1.2 仪器与设备
8900 HPLC-ICP-MS/MS仪 美国Agilent公司；OLS200恒温水浴摇床 英国Grant公司；3K15离心机 德国Sigma公司；Nylon 0.45 μm滤膜、C18净化小柱 中国Agela Technologies公司。
1.3 方法
1.3.1 样品前处理
称取1.0 g样品（精确至0.001 g）于50 mL离心管中，加入20 mL体积分数1%硝酸溶液，静置过夜；于90 ℃恒温水浴摇床热浸提2.5 h，每0.5 h振荡1 min，冷却至室温，于105 r/min离心10 min，取5 mL上清液于离心管中，加入5 mL正己烷，振摇1 min，105 r/min离心10～15 min，弃去上层正己烷，重复提取1 次，取下层清液，经0.45 μm有机滤膜过滤及C18净化小柱净化（弃去前端1 mL）后，上机测定。标准溶液无需前处理，直接上机测定。
1.3.2 实验设备条件
色谱柱：As7阴离子交换柱（250 mm×4 mm）；流动相A：10 mmol/L无水乙酸钠、3 mmol/L硝酸钾、12 mmol/L磷酸二氢钠、0.2 mmol/L乙二胺四乙酸二钠（pH=10）；流动相B：一级水；流速0.6 mL/min；进样体积20 μL。优化后ICP-MS/MS仪器条件设定值为射频功率1 550 W，辅助气体流速0.90 L/min，等离子体气体流速15.0 L/min，采样深度8.0 mm，提取透镜电压 -12 V，第1个八极杆偏转电压1 V，第2个八极杆偏转电压 -10 V，碰撞池气体为O2，碰撞池气体流量4.3 L/min，八极杆偏转电压-3.0 V。
1.3.3 溶液配制
用一级水配制As3+、As5+、DMA、MMA和AsB 5 种形态砷混合标准溶液，5 种形态砷混合标准溶液质量浓度梯度均为2.5、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L，现用现配。
1.4 数据处理
调用Agilent MassHunter数据工作站软件分析计算，拟合线性回归曲线。
2 结果与分析
2.1 ICP-MS/MS优化条件及干扰消除
在测定样品之前，用1 μg/mL的Li、Y、Co、Tl、Ce、Mg混合溶液作为调谐液，以蠕动泵0.1 r/s的转速持续进液，优化仪器条件，提高待测元素响应值，降低杂质质谱干扰，提高仪器灵敏度。
采用MS/MS串联模式测定5 种形态砷，充分利用待测元素与反应气发生碰撞和反应，形成新的质量离子，以发生质量转移的方式消除干扰。在MS/MS模式下，向反应池中通入O2，目标离子75As+与O2发生碰撞，发生质量转移，生成75As16O+团簇离子，通过设定m/z 75、91，实现对目标元素的精准筛选，消除其他元素的干扰。
2.2 测定方法优化
2.2.1 HPLC色谱柱的选择
考察待测溶液在Hamilton X-100阴离子交换色谱柱（250 mm×4.1 mm）和As7阴离子交换柱（250 mm×4 mm）中的分离效果，结果表明，以无水乙酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠和乙二胺四乙酸二钠为流动相，用As7阴离子交换柱（250 mm×4 mm）作为色谱柱，能够很好地分离5 种形态砷，分析时间短，仅6 min，简便快捷，故选择As7阴离子交换柱（250 mm×4 mm）作为本实验的色谱柱。
2.2.2 流动相流速的选择
进样流速对样品的分离分析有较大影响，考察不同流速（0.4、0.6、0.8、1.0 mL/min）下5 种形态砷的分离情况，以出峰时间、峰形和分离度为判断依据。实验发现，当流速为0.6 mL/min时，待测元素的各形态谱峰能够在6 min内完全呈现，且分离度和峰形较好。故选择0.6 mL/min作为分析流速。
2.2.3 流动相的选择
考察2 种流动相的分离效果。第1种是以磷酸二氢铵为流动相进行分析测定，能够将5 种形态砷分离，分析时间约20 min，时间较长；第2种是以无水乙酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠和乙二胺四乙酸二钠为流动相进行分析测定，分离效果明显，分析时间约6 min。第2种流动相以磷酸二氢钠为主要成分，故考察15、12、9 mmol/L磷酸二氢钠作为流动相的效果，结果表明，当流动相组成为10 mmol/L 无水乙酸钠、3 mmol/L硝酸钾、12 mmol/L磷酸二氢钠、0.2 mmol/L乙二胺四乙酸二钠时，能够很好实现AsB、DMA和As3+分离，如果盐浓度过高对于质谱仪器中采样锥有一定的影响，长时间高浓度进样可能会造成锥口堵塞、锥面腐蚀等严重问题，故采用梯度洗脱，同时也改善了分离效果。洗脱程序如表1所示。
表1 梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution program
洗脱时间/min 流动相A体积分数/% 流动相B体积分数/%0～1 85 15 1～3 100 0 3～6 85 15
条件优化后5 种形态砷的分离色谱图如图1所示。
图1 5 种形态砷分离色谱图
Fig. 1 Separation chromatograms of five arsenic species
2.3 方法线性关系和检出限
对实验方法进行进一步研究，用一级水配制As3+、As5+、DMA、MMA、AsB质量浓度梯度均为2.5、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的混合标准溶液，以质量浓度为X轴，峰面积为Y轴，分析得到线性拟合曲线方程，计算得到待测元素砷各形态的检出限。
由表2可知，各形态砷拟合曲线相关系数R2≥0.999 4，满足实验要求，检出限也均低于国家标准（0.02 mg/kg）。
表2 5 种形态砷的标准方程、线性及检出限
Table 2 Standard curves and detection limits for five arsenic species
目标物质 拟合方程 线性相关系数 检出限/（mg/kg）As3+ y=423.263 0x 0.999 9 0.005 94 DMA y=491.064 9x+56.194 4 0.999 4 0.005 28 MMA y=469.843 7x+91.432 7 0.999 8 0.008 17 As5+ y=490.123 5x+5.755 8 1.000 0 0.008 41 AsB y=479.570 6x+6.007 3 0.999 5 0.011 70
2.4 方法准确度
按优化后条件测定，同时进行高、中、低3 个梯度的加标回收实验，重复测定6 次。由表3可知，5 种形态砷的加标回收率为83%～116%，表明方法准确度良好，相对标准偏差均小于5%，方法精密度较好。
表3 3 个梯度加标回收实验结果（n =6）
Table 3 Recoveries at three spiked levels and precision (n = 6)
注：—.未检出。表4同。
目标物质本底值/（mg/kg）加标量/（mg/kg）加标回收率/%相对标准偏差/%As3+ —0.25 112 1.2 1.00 103 1.5 3.00 99 0.7 DMA —0.25 116 1.9 1.00 97 2.7 3.00 102 1.3 MMA —0.25 108 0.8 1.00 96 1.5 3.00 102 2.3 As5+ —0.25 93 2.9 1.00 96 1.5 3.00 103 1.7 AsB 0.905 0.25 83 0.2 1.00 97 1.1 3.00 92 3.5
2.5 实际样品测定
分析采购的海水鱼类5 批次、贝类5 批次、海水虾蟹类5 批次、淡水鱼类5 批次及淡水虾蟹类5 批次，每个样品测3 个平行。海水鱼类实际样品测定谱图如图2所示，测定结果如表4所示。
图2 海水鱼类实际样品色谱图
Fig. 2 Chromatogram of arsenic species in actual marine fish samples
表4 实际样品测定结果（n =3）
Table 4 Analytical results for arsenic species in actual samples (n = 3)mg/kg
样品 As3+含量 DMA含量 MMA含量 As5+含量 AsB含量海水鱼类1 - - - 0.010 7 0.812 1 2 - - - - 0.905 6 3 - - - - 0.667 3 4 - - 0.014 5 - 0.526 4 5 - - 0.013 3 - 0.297 7贝类1 - - - - 1.442 1 2 - 0.477 5 0.022 3 - 1.117 5 3 - - 0.012 7 - 0.841 5 4 - 0.245 2 0.008 8 0.044 6 0.774 7 5 0.008 8 - - 0.012 5 1.358 2海水虾蟹类1 - - 0.010 6 0.009 5 1.021 7 2 - - 0.039 7 - 1.216 5 3 - - 0.026 6 0.012 2 1.638 9 4 - - - 0.016 7 0.993 7 5 - - - - 1.182 1
续表4 mg/kg
样品 As3+含量 DMA含量 MMA含量 As5+含量 AsB含量淡水鱼类1 - - - - 0.075 6 2 - 0.033 4 - - -3 - - - - 0.083 3 4 - - - - -5 - - - - -淡水虾蟹类1 - - - - 0.093 6 2 - 0.011 7 - - 0.081 2 3 - - - - -4 - 0.029 6 0.031 6 - -5 - - - - 0.074 6
由表4可知，所测样品中19 批次样品中无机砷含量均低于检出限；而有机砷AsB的含量较高，DMA和MMA含量相对较低；6 批次样品中检出含有一定量的As3+和As5+，但低于GB 2762—2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》规定的限量值（0.5 mg/kg），其中以虾蟹类为主，可能与其生活环境和食物种类有关。
3 结 论
采用HPLC-ICP-MS/MS法对5 种形态砷进行分析测定。利用MS/MS模式，以质量转移的方式消除干扰，通过实验，确定了5 种形态砷的分离时间；以10 mmol/L无水乙酸钠、3 mmol/L硝酸钾、12 mmol/L磷酸二氢钠、0.2 mmol/L乙二胺四乙酸二钠为流动相（pH 10），采用As7阴离子交换柱进行梯度洗脱，流速0.6 mL/min，能够在6 min内完成5 种形态砷的分离测定；线性良好，检出限较低，满足检测要求；相对标准偏差均小于5%；加标回收率为83%～116%。本方法简便、快捷、准确，可作为水产品中形态砷现有分析方法的有效补充，为水产品及其他食品中多种形态砷的分析研判和风险评价提供有力的技术支撑。
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