罗非鱼（Oreochromis niloticus）生长速度快、肉嫩味美、营养丰富，近些年来已经成为中国最具国际竞争力的水产养殖品种之一[1]。我国不仅是罗非鱼产量最大的国家，也是世界上出口量和消费量最大的国家[2]。目前我国罗非鱼的加工形式主要以冻鱼片和冻全鱼为主，产品形式单一且附加值低，副产物开发利用及精加工水平不高。罗非鱼加工过程中产生的下脚料，如鱼皮、鱼碎肉、鱼骨、鱼内脏和鱼鳞等，含量高达原料的55%～65%[3]。这些下脚料直接丢弃会造成极大的资源浪费与环境污染，如何对这些下脚料进行加工利用已经成为罗非鱼产业面临的关键性问题[4]。
随着社会的发展，消费者对富含营养、口感良好又经济方便的食品需求不断增长，较大刺激了低脂肉类和即食肉类等产品的发展，而重组鱼肉制品的出现为消费者提供了更健康、更安全的选择。重组鱼肉制品是借助外力或添加辅料以提取鱼肉纤维中的基质蛋白，与添加剂相互作用使肉粒或肉块重新组合黏连成型，形成新的质构，经冷冻后可直接出售的水产食品[5]。肉制品的重组技术起源于20世纪60年代，包括NaCl溶出肌原纤维蛋白、固定、蛋白热变性形成有组织的结构3 个步骤[6]。对于低值鱼类及加工碎肉可以通过重组技术制备具备一定质构的重组鱼肉制品，并且可以调控鱼肉产品的形状、质地、颜色、脂肪、水分含量等，从而提升其附加值[7-9]。
本研究以罗非鱼碎肉为原料，采用响应面法优化重组罗非鱼肉制品的加工工艺，为罗非鱼的高值化利用提供技术支撑和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
罗非鱼碎肉，由海南翔泰渔业股份有限公司提供，于生产线收集、冻藏后运送至实验室，-20 ℃冷冻保存备用。
谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase，TG） 美国Sigma-Aldrich试剂公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
800s组织捣碎机 美国Warring Blender公司；T18高速分散机 德国IKA公司；ST-16R高速冷冻离心机美国Thermo Scientific公司；EL303/204分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；GL-3250A磁力搅拌器海门市其林贝尔仪器制造有限公司；CR-14小型色差仪柯尼卡-美能达（中国）有限公司；CT-3质构仪 美国Brookfield公司；JBCJEFD1307023J超净工作台 美国安捷伦公司。
1.3 方法
1.3.1 重组罗非鱼肉制品的制备
根据Martelo-Vidal[10]、Canto[11]等的方法并有所改动。罗非鱼碎肉解冻后，充分搅碎并用去离子水以料液比1∶3（m/V）在4 ℃条件下洗涤5 min；取出碎肉，将碎肉和去离子水料液比以1∶1（m/V）充分混匀并打浆，加入一定量NaCl，混匀后于4 ℃条件下作用1 h，添加质量分数0.2%柠檬酸（以碎肉质量计）混匀后于4 ℃条件下作用1 h；添加一定量CaCl2搅拌均匀后再添加一定量TG混合均匀，纱布过滤除去多余水分后，将剩余的碎肉装入直径为3 cm的圆柱形模具中按压紧实，在不同温度和时间条件下进行固化；最后将其置于自封袋中90 ℃加热30 min，加热后的样品真空包装，于-20 ℃冷藏。
1.3.2 固化条件的选取
根据前期的实验结果，确定重组罗非鱼肉制品的NaCl、TG、CaCl2添加量分别为0.5%、1 U/100 g、0.4%（均以碎肉质量计），选取3 个不同的温度及时间条件，分别为：4 ℃固化12 h、25 ℃固化2 h、40 ℃固化30 min，重组鱼肉制品制备方法同1.3.1节，样品在不同条件下固化完成后置于自封袋中90 ℃加热30 min，充分冷却后于4 ℃放置24 h测定理化性质。
1.3.3 可表达水含量、水分活度、干物质含量测定
可表达水含量：可表达水含量是间接测定持水力的一种方法。称取质量为（2.0±0.2）g的样品放入2 层滤纸中，置于50 mL离心管底部，1 500×g离心10 min；用滤纸擦拭样品表面水分进行称质量[12]。可表达水含量按式（1）计算。
式中：m0为样品初始质量/g；m1为样品最终质量/g。
水分活度：使用手持式水分活度仪测定。
干物质含量：称取（5.0±0.2） g样品于预先称质量的坩埚中，将样品在98 ℃条件下干燥24 h后再次称质量，干物质含量按式（2）计算。
式中：m2为干燥后样品质量/g；m3为干燥前样品湿质量/g。
1.3.4 色度测定
使用色差仪测定样品的色度，于光源C和2°的测定条件下测定并记录样品的亮度值（L*）、红度值（a*）和黄度值（b*）。白度按式（3）计算。
1.3.5 质构测定
使用质构仪对样品进行质构分析，将样品切成2 cm高度的圆柱体，使用直径为50 mm（P/50）的圆柱形探针进行质构分析。测定条件为：测前速率2.0 mm/s，测试速率1.0 mm/s，回复速率2.0 mm/s，下压次数2 次，测定并记录样品的5 个质构参数（硬度、弹性、胶着性、内聚性和咀嚼性）。
1.3.6 单因素试验
以硬度为指标，分别测定NaCl添加量（0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）、CaCl2添加量（0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%）和TG添加量（0、0.5、1.0、1.5、2.0 U/100 g）对重组罗非鱼肉制品的硬度的影响。
确定TG添加量为1 U/100 g，CaCl2添加量为0.4%，分别添加0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的NaCl，分析NaCl的最优添加量。
确定NaCl添加量为0.5%，CaCl2添加量为0.4%，分别添加0、0.5、1.0、1.5、2.0 U/100 g的TG，分析TG的最优添加量。
确定NaCl添加量为0.5%，TG添加量为1 U/100 g，分别添加0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的CaCl2，分析CaCl2的最优添加量。
1.3.7 响应面优化试验
在单因素试验的基础上，使用Design-Expert 8.0软件进行响应面优化设计，以硬度为响应值，以NaCl、TG和CaCl2的添加量为因变量，设计3因素3水平的响应面试验，优化重组罗非鱼肉制品的制备工艺。响应面分析因素及水平如表1所示。
表 1 响应面分析因素及水平
Table 1 Codes and levels of independent variables used in response surface analysis
因素 编码水平-1 0 1 A NaCl添加量/% 0.4 0.5 0.6 B TG添加量/（U/100 g） 0.5 1.0 1.5 C CaCl2添加量/% 0.3 0.4 0.5
1.4 数据处理
所有数据均表示为平均值±标准差，采用OriginPro 2016软件作图。采用SPSS Statistics 19.0软件进行数据间单因素显著性差异分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。
2 结果与分析
2.1 固化条件对重组罗非鱼肉可表达水含量、水分活度及干物质含量的影响
表 2 TG及固化条件对重组罗非鱼肉可表达水含量、水分活度和
干物质含量的影响
Table 2 Effect of TG addition and curing conditions on expressible water content, water activity and dry matter content in restructured tilapia meat
注：同列小写字母不同，表示差异显著（P＜0.05）。表3同。
固化条件 可表达水含量/% 水分活度 干物质含量/%4 ℃、12 h（无TG） 23.10±3.13bc 0.98±0.01a 26.82±0.02b 25 ℃、2 h（无TG） 26.43±0.77b 0.98±0.01a 26.75±0.01b 40 ℃、30 min（无TG） 32.88±1.60a 0.98±0.01a 26.61±0.01b 4 ℃、12 h（有TG） 18.88±0.04c 0.97±0.01b 30.31±0.01ab 25 ℃、2 h（有TG） 15.54±2.36c 0.97±0.01ab32.86±0.01a 40 ℃、30 min（有TG） 21.85±0.06bc 0.98±0.01a 31.23±0.01a
可表达水含量与持水力的高低有关，持水力表示产品保持水分的能力，能影响产品的风味、口感、色度等指标[13]。可表达水含量越低，鱼肉制品持水性越强[14]。由表2可知，添加TG后，重组罗非鱼肉制品的可表达水含量显著降低，这说明TG能显著提高重组罗非鱼肉制品的持水力。在不同的固化条件下，不添加TG的重组罗非鱼肉可表达水含量在4 ℃条件下获得最低值（23.10±3.13）%。添加TG后，在25 ℃条件下固化2 h的重组罗非鱼肉可表达水含量最低，持水力最好，且可表达水含量低于由大西洋鲭鱼（Scomber scombrus）制得的类似火鸡肉的重组鱼肉制品[15]及由长鳍金枪鱼（Thunnus alalunga）制得的重组鱼肉制品[10]。
较低的水分活度可降低生物反应速率，延缓微生物的生长，延长产品的保质期。不添加TG的重组罗非鱼肉水分活度为0.98，而添加TG之后，重组罗非鱼肉的水分活度为0.97～0.98。在40 ℃固化30 min的重组罗非鱼肉显示出最高的水分活度，4 ℃固化12 h水分活度最低。Andrés-Bello等[16]报道重组金头鲷（Sparus aurata）制品的水分活度为0.973，与重组罗非鱼肉制品的水分活度接近。
添加TG后，不同固化条件下获得的重组罗非鱼肉的干物质含量均显著增加，这可能是由于TG的添加可使蛋白质的交联增加，蛋白质得率升高。
综上，添加TG在25 ℃下固化2 h获得的重组罗非鱼肉制品品质最优。
2.2 固化条件对重组罗非鱼肉色度的影响
表 3 TG及固化条件对重组罗非鱼肉色度的影响
Table 3 Effect of TG addition and curing conditions on color of restructured tilapia meat
固化条件 L* a* b* 白度4 ℃、12 h（无TG） 76.80±1.05c -5.47±0.21c14.90±0.72c 71.91±1.18c 25 ℃、2 h（无TG） 78.27±1.38ab -5.13±0.12bc15.90±0.59ab 72.56±0.97b 40 ℃、30 min（无TG） 77.80±1.69b -4.73±0.40b16.50±0.35ab 71.93±0.51c 4 ℃、12 h（有TG） 77.53±1.35b -4.83±0.15b 15.60±0.06b 72.21±1.14bc 25 ℃、2 h（有TG） 79.97±1.69a -4.40±0.17ab16.20±0.64ab 73.84±1.08a 40 ℃、30 min（有TG） 79.83±2.08a -4.16±0.15a16.80±0.06a 73.44±1.98a
由表3可知，未添加TG的重组罗非鱼肉L*为76.80～78.27，a*为-4.73～-5.47，b*为14.90～16.50，白度差异较小。添加TG后，重组罗非鱼肉的L*略微升高，为77.53～79.97，a*无明显变化，为-4.83～-4.16，b*略微升高，为15.60～16.80，白度略微升高。不同固化条件对色度影响较小，TG的添加能使重组罗非鱼肉的白度略微升高，在25 ℃下固化2 h白度最高。相比于其他重组鱼肉制品，重组罗非鱼制品的白度略高，重组金头鲷（Sparus aurata）的L*为68.7～72.6[16]，重组比目鱼的L*为40.14～53.70[17]，这可能与鱼的种类有关。
2.3 固化条件对重组罗非鱼肉质构的影响
图 1 TG及固化条件对重组罗非鱼肉质构参数的影响
Fig. 1 Effect of TG addition and curing conditions on textural parameters of restructured tilapia meat
由图1可知，TG的添加显著改善了重组罗非鱼肉制品的质构，硬度、胶着性和咀嚼性均显著上升，弹性和内聚性也略微升高。重组罗非鱼肉制品在固化温度为25、40 ℃条件下显示出较高的硬度、胶着性和咀嚼性，而弹性和内聚性在不同固化条件下无明显差异，这可能是因为25、40 ℃条件下内源性TG活性较高，TG的最适温度接近45 ℃[18]。添加TG，固化温度为40 ℃的重组罗非鱼肉制品硬度高于25 ℃下的样品，而弹性却低于25 ℃下的样品。
总之，在25 ℃固化2 h、添加TG的重组罗非鱼肉制品能获得最优质构，数值接近其他研究报道的重组鱼肉制品，在添加25 g/kg NaCl和TG的条件下获得的重组鲢鱼制品的硬度达到2 350 g[19]。重组鱼肉制品的最优固化条件可能与鱼类栖息地温度有关[20-21]，来自冷水鱼的鱼糜凝胶具有较低的机械性能和较低的固化温度，而来自温水鱼类的凝胶具有较高的固化温度属性[22]。
2.4 单因素试验结果
图 2 NaCl添加量对重组罗非鱼肉硬度的影响
Fig. 2 Effect of NaCl addition on hardness of recombinant tilapia meat
由图2可知，重组罗非鱼肉制品的硬度随着NaCl添加量的升高先增大后减少，最优添加量为0.5%。钠盐添加过多会使肌肉蛋白过度溶解，从而导致重组罗非鱼肉制品质构变差。过量的钠盐也会造成人体血压升高，患心血管疾病概率增加[22]。低盐重组罗非鱼肉制品满足了消费者及肉类工业对新型肉制品的要求，因而选取0.5%为NaCl的最优添加量。
图 3 TG添加量对重组罗非鱼肉硬度的影响
Fig. 3 Effect of TG addition on hardness of recombinant tilapia meat
由图3可知，TG的添加可显著提升重组罗非鱼肉制品的硬度，硬度随着TG添加量的升高先增大后减小，在添加量1 U/100 g时达到最大硬度。这是因为TG的添加可以促进鱼肉蛋白之间的交联作用，改善重组罗非鱼肉制品的质构，并减少钠盐的使用[23-24]。综上，重组罗非鱼肉制品的最优TG添加量为1 U/100 g。
图 4 CaCl2添加量对重组罗非鱼肉硬度的影响
Fig. 4 Effect of CaCl2 addition on hardness of recombinant tilapia meat
由图4可知，CaCl2的添加可显著改善重组罗非鱼肉制品的质构，重组罗非鱼肉制品的硬度随着CaCl2添加量的升高先增大后减小，在添加量0.4%时达到最优。Ca2+的使用可以较好地提高TG的活性，从而改善重组罗非鱼肉制品的质构和感官。Lee等[20]发现，添加0.2%的CaCl2可以改善鱼糜的凝胶特性，墨西哥比目鱼（Cyclopsetta chittendeni）和岩栖无鳔石首鱼（Menticirrhus saxatilis）也通过添加0.2% CaCl2使产品的质构得到改善[14]。因此，选取重组罗非鱼肉制品的CaCl2最优添加量为0.4%。
2.5 响应面优化试验结果
表 4 重组罗非鱼肉制品响应面优化方案及结果
Table 4 Experimental design and results for response surface analysis
试验号 A NaCl添加量/%B TG添加量/（U/100 g）C CaCl2添加量/% 硬度/g 1 1 2 989 2 1-1 0 3 134 1 0 3-1 0 1 3 075 4 0 1-1 2 973 5 0 3 801 6 0 0 0 3 975 0 0 7-1 1 2 997 8 1 0-1 3 046 0-1 0 -1 3 081 10 0 0 0 3 743 11 -1 1 0 3 188 12 0 0 0 3 701 13 1 1 0 3 113 14 -1 -1 0 3 174 15 0 0 0 3 801 16 0 1 1 2 770 17 0 -1 -1 2 294 9
响应面试验结果见表4，利用Design-Expert 8.0软件对表4数据进行多元回归拟合，获得以重组罗非鱼肉制品硬度为响应值的回归方程：Y=-14 060.80+2 161.50A+570.31B+4 862.93C-1.75AB-12.75AC-45.30BC-206.35A2-19.82B2-550.10C2。
表 5 响应面回归模型方差分析
Table 5 Analysis of variance (ANOVA) for response surface quadratic model
注：**. 极显著（P＜0.01）。
来源 自由度 平方和 均方 F值 P值模型 9 3 021 000 335 700 25.65 0.000 2**A 1 6 962 6 962 0.53 0.489 4 B 1 52 003.13 52 001.13 3.97 0.086 4 C 1 23 871.13 23 871.13 1.82 0.218 8 AB 1 306.25 306.25 0.02 0.882 7 AC 1 650.25 650.25 0.05 0.830 0 BC 1 205 200 205 200 15.68 0.005 5**A2 1 179 300 179 300 13.70 0.007 6**B2 1 1 034 000 1 034 000 79.03 0.000 1**C2 1 1 274 000 1 274 000 97.37 0.000 1**残差 7 91 599.55 13 085.65失拟项 3 48 010.75 16 003.58 1.47 0.349 7纯误差 4 43 588.8 10 897.2总和 16 3 113 000
由表5可知，模型P=0.000 2＜0.01（极显著），失拟项P=0.349 7＞0.05（不显著），说明方程对试验有较好的拟合性，实验误差较小，相关系数R2=0.970 6，表明模型充分拟合试验数据。该模型可以较好地对重组罗非鱼肉制品的制备工艺进行分析和预测，各因素对于重组罗非鱼肉硬度影响的大小顺序为B＞C＞A，即TG添加量＞CaCl2添加量＞NaCl添加量。交互项BC、A2、B2、C2对重组罗非鱼肉制品的硬度有极显著影响。上述数据表明，此模型可以较好反映重组罗非鱼肉制品NaCl添加量、TG添加量、CaCl2添加量之间的关系，因此该二次模型成立，可以用于预测重组罗非鱼肉制品的制备工艺。
图 5 各因素交互作用对重组罗非鱼肉制品硬度的影响
Fig. 5 Response surface and contour plots showing the effect of interaction among various factors on hardness of restructured tilapia meat
根据回归方程得出不同影响因素的响应面图和等高线图，在响应面图中，曲面越陡峭，则该曲面的自变量对响应值的影响越显著。由图5可知，TG添加量和CaCl2添加量的响应面图变化斜面更为陡峭，表明TG添加量和CaCl2添加量对重组罗非鱼肉制品硬度的影响最显著，与方差分析结果相符。
通过Design-Expert 8.0软件分析得重组罗非鱼肉制品的最佳加工条件为NaCl添加量0.52%、TG添加量0.95 U/100 g、CaCl2添加量0.39%，此时重组罗非鱼肉制品的硬度预测值可得到最大值3 804 g。为了验证所得条件的可行性，对最优条件进行3 次验证实验，得到重组鱼肉的硬度为3 821 g，与理论值相比相对误差小，证明响应面法得到的回归模型可靠。
3 结 论
添加TG后在25 ℃条件下固化2 h获得的重组罗非鱼肉制品品质最优，通过单因素试验和响应面试验优化得到重组罗非鱼肉制品的最佳工艺为NaCl添加量0.52%、TG添加量0.95 U/100 g、CaCl2添加量0.39%，此时重组罗非鱼肉制品的硬度可达3 804 g，各因素对于重组罗非鱼肉硬度影响的大小顺序为TG添加量＞CaCl2添加量＞NaCl添加量。
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