随着社会经济的飞速发展，人们的生活方式特别是饮食习惯发生巨大变化，营养摄入的不均衡导致肥胖和糖尿病等慢性代谢疾病的发生率逐年上升。糖尿病已逐渐成为世界范围内日益严重的社会健康问题，预计到2040年，将会有6.42亿成年人患糖尿病[1]。
二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl peptidase Ⅳ，DPP-Ⅳ）抑制剂是新型糖尿病治疗药物[2]。然而，长期服用合成的DPP-Ⅳ抑制剂会产生耐药性和肝肾损伤等副作用[3]。生物活性肽是对生物机体生命活动有益或是具有生理作用的肽类化合物，是一类分子质量小于6 000 Da，具有多种生物学功能的多肽[4]，其分子结构复杂程度不一，介于氨基酸与蛋白质之间，由2 个至数十个氨基酸通过肽键连接而成[5]。DPP-Ⅳ抑制活性肽主要来源于天然动植物，具有生物活性高、副作用低等优点，在高效性和安全性等方面具有突出优势[6]，具有辅助控制血糖水平的潜力[7]。
近年来，已从豆类[7]、藜麦[8]、谷物[9]、油菜[10]、猪皮凝胶[11]、猪骨骼肌[12]、乳清蛋白[13]、酪蛋白[14]和骆驼乳[15]等中水解得到DPP-Ⅳ抑制肽。关于血液中DPP-Ⅳ抑制肽鲜有报道。血中富含血红蛋白，血红蛋白由2 个α-亚基和2 个β-亚基组成，是一种非膜的复合变构蛋白，能运输氧并调节血液酸碱平衡[16]，血红蛋白酶解肽段具有抗氧化[17-18]、降血压[19-20]和抗菌[21-22]等多种活性，且分子质量小，可被直接吸收[23]，是一种非常有前途的功能性食品原料。生物信息学是用于管理、规划和解释与生物系统相关信息的计算方法，它利用各种数据库、在线工具和软件等获取目标功能。利用ExPASy Cutter[24]和BIOPEP[25]等在线平台的肽剪切工具，可以根据蛋白质的氨基酸序列及特异蛋白酶的剪切位点在理论上预测肽的组成，并将肽段与数据库中的DPP-Ⅳ多肽进行比较[26]，从而选择合适的底物及蛋白酶。
本研究以驴血红蛋白为原料，通过借助ExPASy Cutter和BIOPEP在线平台筛选合适的蛋白酶。在单因素试验基础上，通过响应面法优化酶解条件制备驴血红蛋白源DPP-Ⅳ抑制活性肽，为推动DPP-Ⅳ抑制活性肽产业化发展提供理论依据，以提高驴血的附加值，促进驴产业的发展。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
选择检疫合格的3 岁乌公驴，在宰杀过程中收集新鲜血液，通过20 目筛后滤入含有1%柠檬酸钠抗凝剂容器中。上述过程于内蒙古呼和浩特市蒙驴食品定点屠宰场完成。
蛋白酶K（4 0 U/m g） 德国M e r c k 公司；DPP-Ⅳ抑制剂筛选试剂盒 美国Abnova公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝胶制备试剂盒 北京索来宝科技有限公司；氯化钠、浓盐酸、氢氧化钠、乙醇、柠檬酸钠均为分析纯。
1.2 仪器与设备
FD-1真空冷冻干燥机 北京德天佑科技发展有限公司；5804R高速冷冻离心机 艾本德（中国）有限公司；DK-8D水浴锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；PHS-3C雷磁pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；MULTISKAN GO全光谱酶标仪 美国Thermo Fisher公司；凝胶成像仪、Mini protein II型垂直电泳系统美国Bio-Rad公司。
1.3 方法
1.3.1 驴血红蛋白的提取及SDS-PAGE分析
采集新鲜驴血过20 目筛后，放入含有1%柠檬酸钠抗凝剂容器中，5 000×g、4 ℃条件下离心5 min，去上层，按上述步骤重复3 次，收集红细胞，置于4 ℃冰柜中保存备用。将红细胞中加入2 倍体积4 ℃预冷的去离子水，于4 ℃冰柜中静置过夜后，12 000×g、4 ℃条件下离心20 min，去沉淀，收集上清液，即得驴血红蛋白。采用SDS-PAGE检测驴血红蛋白纯度，分离胶质量分数12%、浓缩胶质量分数5%、电压110 V、电泳时间90 min。电泳结束后，用考马斯亮蓝染色，脱色后将胶片置于胶片观察灯上观察。
1.3.2 计算机模拟酶解驴血血红蛋白
利用UniProt数据库（http://www.uniprot.org/）获得原料蛋白质一级结构，由在线软件PeptideCutter（http://web.expasy.org/peptide_cutter/）进行胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K模拟水解，将水解得到的多肽整理分类，与BIOPEP（http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep）数据库中的DPP-Ⅳ抑制肽进行对比，筛选出合适的蛋白酶。
1.3.3 蛋白水解度的测定
在中性和碱性条件下，采用pH-Stat法[27]测定蛋白水解度。在水解反应开始时，调节pH值为8.00，反应结束后测定反应体系pH值，用0.50 mol/L NaOH溶液将反应体系pH值再次调至8.00，记录所用NaOH溶液体积，按式（1）计算蛋白水解度。
式中：V为NaOH溶液所用体积/mL；c为NaOH溶液浓度/（mol/L）；1/T为2.26；m为蛋白质质量/g；htot为每克蛋白质中所含肽键的物质的量（8.30 mmol/g）。
1.3.4 DPP-Ⅳ抑制活性测定
采用荧光法，按照DPP-Ⅳ抑制剂筛选试剂盒说明书步骤操作，37 ℃孵育30 min，在激发波长360 nm、发射波长460 nm条件下检测荧光强度。按式（2）计算DPP-Ⅳ抑制率。
式中：a为抑制剂孔荧光强度；b为背景孔荧光强度；c为DPP-Ⅳ孔荧光强度。
1.3.5 单因素试验
选定最佳蛋白酶后，研究酶解时间、酶解温度和加酶量对驴血红蛋白水解度和DPP-Ⅳ活性抑制率的影响。
1.3.5.1 酶解时间对驴血红蛋白酶解产物DPP-Ⅳ抑制活性和水解度的影响
设定底物质量浓度1 g/100 mL、加酶量400 U/g、酶解温度60 ℃、pH 8，分别酶解1、2、3、4、5 h，以水解度和DPP-Ⅳ抑制率为指标，确定最适酶解时间。
1.3.5.2 酶添加量对驴血红蛋白酶解产物DPP-Ⅳ抑制活性和水解度的影响
设定底物质量浓度1 g/100 mL、酶解温度60 ℃、pH 8、酶解时间3 h，分别考察加酶量为240、320、400、480、560 U/g时的水解度和DPP-Ⅳ抑制率，确定最适加酶量。
1.3.5.3 酶解温度对驴血红蛋白酶解产物DPP-Ⅳ抑制活性和水解度的影响
设定底物质量浓度1 g/100mL、蛋白酶K添加量480 U/g、pH 8、酶解时间3 h，分别考察酶解温度50、55、60、65、70 ℃时的水解度和DPP-Ⅳ抑制率，确定最适酶解温度。
1.3.6 响应面法优化驴血红蛋白制备DPP-Ⅳ抑制活性肽的工艺条件
以DPP-Ⅳ抑制活性率为指标，在单因素试验基础上，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，采用3因素3水平响应面试验，确定驴血红蛋白制备DPP-Ⅳ抑制活性肽的最佳工艺条件。试验因素水平见表1。
表 1 响应面试验因素水平编码表
Table 1 Code and level of independent variables used for response surface analysis
因素水平 A酶解时间/h B酶解温度/℃ C酶添加量/（U/g）－1 2 60 400 0 3 65 480 1 4 70 560
1.4 数据处理
每项测定均重复3 次，采用SPSS 22软件进行数据分析，采用Design-Expert V8.0.6和SPSS 22软件绘制图表。
2 结果与分析
2.1 驴血红蛋白纯度检测
图 1 驴血红蛋白的SDS-PAGE图
Fig. 1 SDS-PAGE pattern of donkey hemoglobin
由图1可知，电泳只显示一条蛋白质条带，说明该血红蛋白的分子质量均一，为典型的血红蛋白SDS-PAGE图像。
2.2 计算机模拟酶解驴血红蛋白的结果
表 2 计算机模拟酶解驴血红蛋白的多肽数量
Table 2 Number of peptides derived from donkey hemoglobin digested by various proteases as obtained from computer simulation
蛋白酶 二肽 三肽 四肽 五肽 其他胰蛋白酶数量 4 0 4 1 16占比/% 16 0 16 4 64类型 4 0 4 1 16胃蛋白酶数量 15 13 10 3 11占比/% 28.85 25.00 19.23 5.77 21.15类型 15 13 10 3 11木瓜蛋白酶数量 31 24 12 4 5占比/% 40.79 31.58 15.79 5.26 6.58类型 27 24 12 4 5蛋白酶K数量 37 31 4 5 1占比/% 47.44 39.74 5.13 6.41 1.28类型 35 31 4 5 1
表 3 计算机模拟酶解的DPP-Ⅳ抑制肽数量
Table 3 Number of DPP-Ⅳ inhibitory peptides derived from donkey hemoglobin digested by various proteases as obtained from computer simulation
蛋白酶 肽 BIOPEP的ID 蛋白酶 肽 BIOPEP的ID YR 8944胰蛋白酶NV 8851 VK 8921 GE 8781 VH 8937 GF 8782 FL 8555 KT 8816 GF 8782 KA 3174 VQ 8925 NF 8842 YH 8937 PA 3179 YF 8935 QL 8874 LL 3182 NE 8841 AA 8637 GE 8781胃蛋白酶HL 8557 NF 8842 AL 8559 QA 8867 AE 8758 GV 8786 PG 8855 KA 3174 VL 8922 GA 8524 EG 8770 PT 8863 KG 8810 QV 8879 AG 8760 HA 3184 KT 8816 HL 8557 MF 8827 SL 8560 PT 8863 KA 3174 YF 8935 PW 8865 HF 8791 HV 8797 QL 8874 RL 8886 SY 8897 NA 8839蛋白酶K木瓜蛋白酶
本研究分别使用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K对驴血红蛋白进行模拟酶解。由表2可知，使用胰蛋白酶水解得到25 种多肽，共25 条，其中二肽4 种，共4 条，在总多肽数量中的占比为16%，四肽4 种，共4 条，在总多肽数量中的占比为16%。使用胃蛋白酶水解得到52 种多肽，共52 条，其中二肽15 种，共15 条，在总多肽数量中的占比为46.90%；三肽13 种，共13 条，在总多肽数量中的占比为40.60%。使用木瓜蛋白酶得到72 种多肽，共76 条，其中二肽27 种，共31 条，在总多肽数量中的占比为28.88%，三肽24 种，共24 条，在总多肽数量中的占比为25%；使用蛋白酶K水解得到76 种多肽，共78 条，其中二肽35 种，共37条，在总多肽数量中的占比为47.40%；三肽31 种，共31 条，在总多肽数量中的占比为39.70%。模拟水解的结果表明，蛋白酶K理论上释放的肽段数量和种类较多，酶解效果优于其他蛋白酶。
由表3可知，将模拟酶解得到的多肽与BIOPEP数据库进行对比发现，使用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K水解分别得到3、7、14、26 种已知的DPP-Ⅳ抑制活性肽。因此，本研究选用蛋白酶K作为最佳蛋白酶进行后续实验。
2.3 单因素试验结果
2.3.1 酶解时间对驴血红蛋白酶解产物DPP-Ⅳ抑制活性和水解度的影响
图 2 酶解时间对驴血红蛋白酶解产物DPP-Ⅳ抑制活性和水解度的影响
Fig. 2 Effect of hydrolysis time on DPP-Ⅳ inhibitory activity and degree of hydrolysis
小写字母不同，表示水解度组间差异显著（P＜0.05）；大写字母不同，表示DPP-Ⅳ抑制率组间差异显著（P＜0.05）。图3～4同。
由图2可知，在酶解1～3 h内，驴血红蛋白水解度呈递增趋势（P＜0.05），随着酶解时间的延长，水解度稍有降低；这是因为随着水解的进行，底物蛋白质不断减少，酶解产物逐渐积累，从而抑制酶解反应的进行。DPP-Ⅳ抑制活性随酶解时间的延长呈先上升后下降趋势，在酶解3 h时达到最大，为54.75%，这与吉薇[28]使用动物蛋白酶水解南极磷虾蛋白制备DPP-Ⅳ抑制肽的研究结果一致。这是因为随着酶解时间延长，蛋白质水解生成的肽含量增多，DPP-Ⅳ抑制率随之增大，继续水解导致底物的酶解程度过大，使得到的活性多肽进一步水解成氨基酸，多肽含量降低，活性肽的数量也随之减少。
2.3.2 酶添加量对驴血红蛋白酶解产物DPP-Ⅳ抑制活性和水解度的影响
由图3可知，酶添加量为240～480 U/g时，驴血红蛋白水解度呈递增趋势（P＜0.05），随着酶添加量的增加，水解度变化幅度较小，曲线趋于平缓。抑制率DPP-Ⅳ随酶添加量的增加呈先上升后下降趋势，在480 U/g时达到最大，为55.02%。这可能是因为酶添加量较小时，随着酶量的增多，蛋白质分解逐渐完全，DPP-Ⅳ抑制率和水解度也逐渐增大。当酶添加量达到480 U/g，此时酶分子相对于底物来说已趋向饱和，DPP-Ⅳ抑制率达到最大值，继续增大酶添加量，蛋白分子水解完全导致具有DPP-Ⅳ抑制活性的多肽分子减少，DPP-Ⅳ抑制率降低，这与Nongonierma等[29]酶解制备DPP-Ⅳ抑制肽时的结论类似。
图 3 酶添加量对驴血红蛋白酶解产物的DPP-Ⅳ抑制活性和水解度的影响
Fig. 3 Effect of enzyme dosage on DPP-Ⅳ inhibitory activity and degree of hydrolysis
2.3.3 酶解温度对驴血红蛋白酶解产物DPP-Ⅳ抑制活性和水解度的影响
图 4 酶解温度对驴血红蛋白酶解产物DPP-Ⅳ抑制活性和水解度的影响
Fig. 4 Effect of hydrolysis temperature on DPP-Ⅳ inhibitory activity and degree of hydrolysis
由图4可知，随着酶解温度的升高，驴血红蛋白水解度和酶解产物DPP-Ⅳ抑制率均呈先升高后降低的趋势，当酶解温度为65 ℃时，二者均达到最大，继续升高酶解温度，DPP-Ⅳ抑制活性显著下降（P＜0.05）。推测随着酶解温度的升高，可能是由于蛋白酶K的结构发生一定改变，从而影响酶解效果[30]，也可能是由于DPP-Ⅳ抑制肽的结构发生变化使其活性下降。因此，选择65 ℃为最适酶解温度。
2.4 响应面试验结果
通过Design-Expert V8.0.6设计响应面试验，结果如表4所示。得到回归方程如下：Y＝53.32＋0.33A－0.20B＋1.40C－1.72AB＋1.33AC＋1.60BC－2.32A2－5.10B2－2.76C2。对模型进行方差分析，由表5可知，该模型P＜0.01，失拟项P＝0.2482＞0.05，不显著，表明建模成功，模型回归系数R2＝0.953 1，说明模型拟合程度良好且差异具有统计学意义，该模型可用于确定驴血红蛋白制备DPP-Ⅳ抑制活性肽的最佳工艺。对DPP-Ⅳ抑制率影响顺序为C酶添加量＞B酶解时间＞A酶解温度，模型中一次项C，交互项AB、BC，二次项A2、B2、C2对试验结果有显著影响（P＜0.05或P＜0.01）。
表 4 响应面试验结果
Table 4 Experimental design and results for response surface analysis
实验号 A酶解时间/h B酶解温度/℃C酶添加量/（U/g）Y DPP-Ⅳ抑制率/%1 4 65 560 51.09 2 70 560 47.3 3 2 65 400 48.04 3 4 70 480 47.06 5 2 65 560 48.98 2 6 65 480 53.27 7 3 65 480 51.96 3 8 60 480 48.18 9 3 65 480 54.85 4 10 3 65 480 53.56 11 2 60 480 42.87 12 3 60 400 46.82 13 3 60 560 45.63 14 4 70 480 45.48 15 3 65 480 52.96 16 3 70 400 42.09 17 4 65 400 44.83
表 5 回归方程的方差分析表
Table 5 Analysis of variance of regression equation
注：*. 影响显著（P＜0.05）；**. 影响极显著（P＜0.01）。
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值模型 226.58 9 25.18 15.81 0.000 7**A 0.86 1 0.86 0.19 0.485 2*B 0.31 1 0.31 9.88 0.673 3 C 15.74 1 15.74 7.45 0.016 3*AB 11.87 1 11.87 7.45 0.029 3*AC 7.08 1 7.08 4.44 0.073 0 BC 10.24 1 10.24 6.43 0.038 9*A2 22.74 1 22.74 14.28 0.006 9**B2 109.46 1 109.46 68.73 ＜0.000 1**C2 32.10 1 32.10 20.16 0.002 8**残差 11.15 7 1.59失拟项 6.77 3 2.26 2.06 0.248 2纯误差 4.38 4 1.10总和 237.73 16 R2＝0.953 1
2.4.1 因素交互作用分析
图 5 酶解时间、酶解温度和酶添加量交互作用对驴血红蛋白酶解产物DPP-Ⅳ抑制活性的影响
Fig. 5 Response surface and contour plots showing the influence of interaction between hydrolysis time, temperature and enzyme dosage on the DPP-Ⅳ inhibitory activity of donkey hemoglobin hydrolysate
在响应面分析中等高线形状越接近椭圆形和响应面曲面倾斜度越陡，响应值对于处理条件改变的敏感程度越大，颜色越深，表明因素间的交互作用显著，反之则交互作用不显著[31]。由图5可知，3 种因素交互作用对DPP-Ⅳ抑制率影响较显著。
2.4.2 模型验证试验
通过分析响应面试验结果，得到酶解驴血红蛋白制备DPP-Ⅳ抑制活性肽的最佳条件为：底物质量浓度1 g/100 mL、酶解时间3.15 h、酶解温度65 ℃、pH 8.00、酶添加量400 U/g，此条件下2 mg/mL酶解产物对DPP-Ⅳ的抑制率为53.80%。在最优条件下进行验证，测得此条件下DPP-Ⅳ抑制率为53.44%，接近于理论值，表明该模型可较好地反映各因素与响应值之间的关系。
3 结 论
食源性DPP-Ⅳ抑制肽的研究一般按照以下流程进行[25,33]：1）选取合适的蛋白底物和酶；2）酶解蛋白；3）体外活性分析；4）富集/分离；5）DPP-Ⅳ抑制肽的鉴定；6）DPP-Ⅳ抑制效能验证；7）抑制机制阐述；8）细胞及动物实验验证。该方法耗时且劳动强度大，对蛋白酶的选择缺乏目的性[26]。本研究应用计算机结合传统酶解方法制备驴血红蛋白源DPP-Ⅳ抑制活性肽，有效筛选出蛋白酶K为最佳蛋白酶，其水解所得多肽数量和种类最多，且获得的已知的DPP-Ⅳ抑制活性肽数量也最多，有效地减少了实验过程中的盲目性。实际酶解结果表明，驴血红蛋白酶解物具有一定的DPP-Ⅳ抑制活性；在单因素试验基础上，以DPP-Ⅳ抑制率为响应值，采用响应面分析法研究酶解时间、酶解温度和酶添加量对血红蛋白酶解产物DPP-Ⅳ抑制率的影响，确定蛋白酶K的最优酶解工艺为：底物质量浓度1 g/100 mL、酶解时间3.15 h、酶解温度65 ℃、pH 8.00、酶添加量400 U/g，此条件下2 mg/mL酶解产物对DPP-Ⅳ的抑制率为53.44%，理论值与实测值基本相符。本实验结果为驴血红蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的制备和功能性研究提供了技术参考。
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