传统中式火腿富含蛋白和许多重要微量元素，满足人们对红肉制品口感和营养的需求[1-3]。但研究表明，红肉内存在一种唾液酸——N-羟乙酰神经氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc），随着红肉及其加工肉制品的过多摄入可能会引发癌症[4-6]，增加患结肠癌、乳腺癌、冠心病等疾病的风险[7-11]。
Neu5Gc是一种酸性氨基糖类[12]，其结构是含11 个碳原子的9碳单糖衍生物，是50多种唾液酸中最常见的3 种核心单体之一[13-14]，主要位于动物细胞膜糖蛋白上和糖脂末端[15]。健康人体自身不能合成Neu5Gc，但可以从外源性食物中获得Neu5Gc[16]。已有资料证实人体中Neu5Gc的唯一来源是红肉、奶制品等动物源食品的摄入，尤其是红肉[17]。膳食Neu5Gc可形成“自身异种抗原”[18]，通过人体组织代谢[16]在体内积累，与人体存在的抗Neu5Gc抗体[19]结合引发持续免疫反应，可能产生或促进慢性炎症，从而导致癌症或其他慢性炎症加剧[9,17,20-22]。庄滢滢等[23]研究发现Neu5Gc摄入量与低度慢性炎症因子C-反应蛋白和白细胞介素6水平呈正相关。Samraj等[17]采用富含Neu5Gc的食物（0.25 mg/g颌下腺黏蛋白）饲喂7 只Neu5Gc缺陷小鼠，短期喂食时其中2 只出现全身炎症迹象，而长期暴露于这种饮食导致这2 只小鼠出现早期肝细胞癌症状，癌症发病率增加5 倍。红肉中的Neu5Gc主要以结合态存在，其含量约为游离态Neu5Gc含量的30 倍[24-25]。饮食中游离态Neu5Gc会迅速随尿液和粪便排出体外，只有结合态Neu5Gc能在人体肠道、血液和肝脏中稳定存在，引发炎症反应[17]。为降低食物中总Neu5Gc的含量可能会促使人们减少红肉摄入量，因此，探析将结合态Neu5Gc转化为游离态Neu5Gc的行之有效的方法十分必要。
目前可以通过物理法、生物法、酶法等降低食物中Neu5Gc含量，但关于游离态和结合态Neu5Gc之间转化的深入研究报道不足[26-32]。郑婉婷等[33]发现新鲜猪肉经腌制处理后3 种不同形态Neu5Gc含量均降低。晏印雪等[27]研究发现发酵肉制品中Neu5Gc含量均低于未发酵肉制品。火腿加工过程中经过失水、发酵和成熟等工艺，使火腿理化性质发生变化，因此，研究加工过程中Neu5Gc的动态变化有利于拓展红肉制品中Neu5Gc的降解方法和解析其中的变化机理。
本研究采用盘县火腿制作工艺加工新鲜猪后腿，以新鲜猪后腿和不同加工时间的火腿为实验材料，采用高效液相色谱-荧光检测（high performance liquid chromatography-fluorescence detector，HPLC-FLD）法对传统中式火腿加工过程中3 种不同形态Neu5Gc的含量进行动态监测，探寻不同加工阶段对不同部位肌肉（股二头肌和半膜肌）制作火腿中结合态和游离态Neu5Gc含量变化的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
15 只新鲜猪后腿由贵州省贵阳花溪巨龙屠宰场提供，质量（15.22±0.50）kg，猪品种为长白猪，其年龄、饲养条件相同；半年、1 年和2 年的盘县火腿购于贵州杨老奶食品有限公司。
Neu5Gc标准品、1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧苯盐酸盐（1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene dihydrochloride，DMB）、β-巯基乙醇（色谱纯） 美国Sigma公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯） 德国Applichem公司；硫酸铵、冰醋酸、亚硫酸钠、硫代硫酸钠（均为分析级） 国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
1260高效液相色谱仪（配有荧光检测器和自动进样器）、ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm） 美国安捷伦科技有限公司；CTFD-12S冷冻干燥机 青岛永合创信电子科技有限公司；S825-12DT超声清洗器 上海冠特超声仪器有限公司；DY89-II电动玻璃匀浆机 上海安亭科学仪器厂；AR224CN电子分析天平 奥豪斯仪器（贵州）有限公司；H2-16KR台式高速冷冻离心机 湖南可成仪器设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品制备和预处理
盘县火腿加工工艺参考文献[34]，主要工艺：新鲜猪后腿预冷12 h→鲜腿修割、定形→腌制（分别按腿胚质量的6%、3%和1.5%上盐腌制3 次，间隔时间分别为2、3、3 d；3 次上盐后，剩余腌制期阶段视腌制情况进行补盐，补盐量控制在腿胚质量的1.5%）→上挂晾晒→发酵成熟
新鲜肉样：分别取0、15、40（腌制期）、60（晾晒期）、80、100、120 d（发酵期）的火腿半膜肌、股二头肌以及成品火腿，以腌制0 d的肉样（新鲜肉样）为对照组。15 只新鲜猪后腿采用上述工艺进行加工，其中7 只每个时间点均取样，每次取样部位尽量保持一致，每只火腿取6 个不同点，每只腿取至少100 g，现场切块包装，置于-20 ℃冰箱备用。然后再选取5 只火腿（编号为腿Ⅰ、鲜腿Ⅱ、鲜腿Ⅲ、鲜腿Ⅳ、鲜腿Ⅴ）用于比较新鲜猪后腿（0 d）与发酵结束时（120 d）火腿之间3 种形态Neu5Gc的变化，取样步骤同上。
干基肉样：分别对0、40（腌制期）、60（晾晒期）、90、120 d（发酵期）的火腿半膜肌、股二头肌进行取样。样品经冷冻干燥处理，置于-80 ℃冰箱备用，用于排除水分含量对加工过程中不同形态Neu5Gc含量变化的影响。其余腿胚备用。
1.3.2 总Neu5Gc含量测定
参考Martin等[35]的方法稍作改进。准确称取（1.005 5±0.000 5）g样品，加入10 mL质量分数30%饱和硫酸铵溶液，用匀浆机研磨匀浆，室温下放置2 h，进行冷冻干燥。冷冻干燥后的粉末加入10 mL 2 mol/L醋酸溶液，于80 ℃水浴3 h，然后12 000 r/min、4 ℃离心15 min，过滤，再次冷冻干燥。冷冻干燥粉末溶于1 mL超纯水中，加入0.2 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，37 ℃水浴30 min，过滤，采用HPLC-FLD法检测。每组做3 次平行。
1.3.3 游离态Neu5Gc含量测定
参考Ji Suna等[36]的方法稍作改进。准确称取（1.005 5±0.000 5）g样品，加入10 mL质量分数30%饱和硫酸铵溶液，匀浆后室温下放置2 h，以12 000 r/min、4 ℃离心15 min，过滤，收集沉淀进行冷冻干燥。冷冻干燥粉末溶于1 mL超纯水中，加入0.2 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，37 ℃水浴30 min，过滤，采用HPLC-FLD法检测。每组做3 次平行。
1.3.4 HPLC-FLD法检测Neu5Gc含量
DMB衍生液的配制及衍生条件：参考Martin等[35]的方法配制含8 mmol/L DMB溶液、1.5 mol/L冰醋酸、0.25 mol/L硫代硫酸钠、0.25 mol/L亚硫酸钠、0.8 mmol/L β-巯基乙醇的衍生液，向标准品中按照体积比9∶1加入DMB衍生液，50 ℃避光衍生2.5 h。衍生结束后，用有机相过滤器过滤，放入HPLC仪中检测。HPLC检测条件[35,37]：ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃，FLD激发波长373 nm、发射波长448 nm，流动相为乙腈-甲醇-超纯水（8∶7∶85，V/V），流速0.9 mL/min，进样体积10 μL。
配制1 mmol/L Neu5Gc标准品溶液，分别取25、50、100、150、200 μL 1 mmol/L Neu5Gc标准品溶液配制浓度分别为50、100、200、300、400 μmol/L的混合标准液。按照上述步骤进行衍生化和HPLC-FLD法检测。以Neu5Gc标准品浓度为纵坐标，Neu5Gc标准品峰面积为横坐标绘制标准曲线，得到标准曲线方程y＝0.305 0x+
6.769 1（R2＝0.999 4）。
总Neu5Gc和游离态Neu5Gc含量采用HPLC-FLD法检测通过标准曲线方程计算得到。结合态Neu5Gc含量为总Neu5Gc含量与游离态Neu5Gc含量之差。
1.3.5 水分含量测定
采用直接干燥法，称取5 g绞碎肉样（精确至0.01 g），用水分测定仪测定水分含量。每个样品测定2 次，结果取平均值。
1.4 数据处理
实验结果以平均值±标准差表示；采用Origin 2019b软件制作绘图；采用SPSS 17.0软件中Tukey s-b（K）法进行单因素方差分析，P＜0.05表示有显著性差异。
2 结果与分析
2.1 传统中式火腿加工过程中新鲜肉样Neu5Gc的变化
图 1 传统中式火腿加工过程中总Neu5Gc（A）和游离态Neu5Gc（B）的HPLC图
Fig. 1 HPLC Chromatograms of total Neu5Gc (A) and free Neu5Gc (B)during traditional Chinese dry-cured ham processing
下标1～7. 分别为0、15、40、60、80、100、120 d的肉样。
Neu5Gc的保留时间为7.901～8.528 min，由图1A可知，火腿加工不同时期所测Neu5Gc色谱图分离效果良好，0 d时总Neu5Gc色谱图中杂峰很少，随着时间的延长，杂峰逐渐增多，说明火腿加工过程中物质间不断转化，这些杂峰可能是蛋白质水解、脂质氧化等化学反应的产物[38-40]。由图2B可知，火腿加工过程中所测游离态Neu5Gc色谱图分离效果良好，但杂峰较多，说明未酸解的样品所得色谱图杂峰较多，且游离态Neu5Gc含量很低，可见样品预处理中酸解后不仅可以检测总Neu5Gc含量，且减少了其他物质干扰，保证Neu5Gc色谱图的分离效果。
2.2 传统中式火腿加工过程中干基肉样Neu5Gc的变化
图 2 不同加工时期火腿干基肉样中水分含量（A）和总Neu5Gc（B）、结合态Neu5Gc（C）、游离态Neu5Gc含量（D）的变化
Fig. 2 Changes in contents of moisture (A), total Neu5Gc (B), bound Neu5Gc (C) and free Neu5Gc (D) in ham (on dry basis) at different
processing stages
小写字母不同，表示同一部位不同加工时间差异显著（P＜0.05）。
水分含量是影响火腿加工过程中Neu5Gc含量的重要因素。由图2A可知，随着加工时间的延长，至120 d时火腿股二头肌和半膜肌的水分含量由最初的74.13%分别降低至53.56%和46.61%。为了排除水分含量变化对Neu5Gc含量的影响，样品经冷冻干燥处理后按照新鲜样品的检测方法测定火腿干基肉样中的Neu5Gc含量。由图2B～D可知，随着加工时间的延长，半膜肌和股二头肌中总Neu5Gc和结合态Neu5Gc含量均逐渐降低（P＜0.05），而游离态Neu5Gc含量先增加后减少（P＜0.05）。腌制期间（0～40 d）水分和盐分发生迁移，此阶段股二头肌和半膜肌中结合态Neu5Gc含量均降低，游离态Neu5Gc急剧增加，但总Neu5Gc含量变化不显著；晾晒期间（40～60 d）温度升高使肉样组织中酶活性和化学反应效率提高，游离态Neu5Gc的降解速率大于结合态Neu5Gc的解离速率，导致3 种形态Neu5Gc的含量均降低；发酵期（60～120 d）糖蛋白和脂质末端的结合态Neu5Gc继续解离成为游离态Neu5Gc[41-42]，但其解离速率低于游离态Neu5Gc的降解速率，导致总Neu5Gc和结合态Neu5Gc含量继续降低，游离态Neu5Gc含量较稳定。晾晒期结束时，半膜肌中3 种形态Neu5Gc的含量均低于股二头肌；进入发酵期后，随着发酵时间的延长，股二头肌中3 种形态Neu5Gc的含量整体低于半膜肌。不同加工阶段干基肉样中3 种形态Neu5Gc含量变化趋势揭示，传统中式火腿加工过程中总Neu5Gc和结合态Neu5Gc含量逐步降低。晏印雪等[27]研究发现不同发酵红肉制品中Neu5Gc含量存在显著差异（P＜0.05），且均低于未发酵红肉制品中的Neu5Gc含量，揭示了发酵对Neu5Gc降解的影响。
2.3 传统中式火腿典型加工工艺对3 种形态Neu5Gc转变的影响
表 1 传统中式火腿加工过程中总Neu5Gc、结合态Neu5Gc、游离态Neu5Gc含量的变化（鲜样）
Table 1 Changes in contents of total Neu5Gc, conjugated Neu5Gc and free Neu5Gc in traditional Chinese dry-cured ham (on fresh basis)during processing
注：同列小写字母不同，表示差异显著（P＜0.05）。
加工时间/d总Neu5Gc含量/（µg/g） 结合态Neu5Gc含量/（µg/g） 游离态Neu5Gc含量/（µg/g）股二头肌 半膜肌 股二头肌 半膜肌 股二头肌 半膜肌0 279.92±8.60ab279.92±8.60ab 274.9±4.77b 274.9±4.77b 5.02±0.95c 5.02±0.95c 15 308.77±1.89ab326.96±19.91ab 298.9±2.45a313.72±13.29a 9.91±3.01c 13.25±6.66b 40 312.73±2.58a349.30±18.73a 273.22±6.13b321.21±9.73a 39.52±9.68a 28.09±0.74a 60 322.77±1.08a304.83±7.19ab 288.04±1.79ab273.79±5.73b 34.74±2.50a 31.05±4.26a 80 295.47±18.78ab281.99±5.63ab 244.83±9.76c273.16±4.65b 36.99±0.73a 27.79±3.68a 100 268.78±12.49ab282.17±15.10ab235.80±10.50c255.29±9.07bc 32.97±1.45a 26.88±3.03a 120 226.61±7.07b252.81±9.15b 203.89±5.43d225.55±4.98c 22.72±3.78b 27.26±0.82a
由表1可知，随着加工时间的延长，火腿样品中总Neu5Gc和结合态Neu5Gc含量均呈先升高后降低的趋势，这是由于腌制期与晾晒期火腿中水分含量大幅度减少（图2A），导致在单位质量下干物质含量增加，而Neu5Gc主要以结合态存在于糖蛋白和糖脂的糖基化末端[41-42]，因此导致总Neu5Gc和结合态Neu5Gc含量的增加。发酵期间（60～120 d），火腿半膜肌中总Neu5Gc和结合态Neu5Gc含量降低，120 d时总Neu5Gc和结合态Neu5Gc含量与鲜腿（0 d）时具有显著差异（P＜0.05），股二头肌中总Neu5Gc和结合态Neu5Gc含量变化规律与半膜肌相似。Neu5Gc含量的升高主要与水分流失有关。在腌制期（0～40 d），火腿股二头肌总Neu5Gc的增加量低于半膜肌，可能是因为股二头肌失水速率低于半膜肌的原因所致。晾晒期（40～60 d），火腿股二头肌总Neu5Gc继续增加，而半膜肌总Neu5Gc开始降低，表明股二头肌中Neu5Gc的变化慢于半膜肌。发酵期（60～120 d），股二头肌总Neu5Gc和结合态Neu5Gc的减少量均高于半膜肌，说明发酵期股二头肌结合态Neu5Gc的解离速度较半膜肌快，具体原因有待深入研究。
鲜腿（0 d）的游离态Neu5Gc含量很低。Ji Suna等[36]等的研究结果表明，游离态Neu5Gc含量在3、38 日龄和成年猪肌肉中的变化不具有规律性，但总Neu5Gc、结合态Neu5Gc含量是游离态Neu5Gc的数十倍。由表1可知，随着加工时间的延长，游离态Neu5Gc含量先增加后降低。游离态Neu5Gc含量增加，一是由于水分流失，干物质含量相对增加；二是火腿加工过程中结合态Neu5Gc与糖蛋白和脂质末端解离。发酵期结合态Neu5Gc解离速率低于游离态Neu5Gc的降解速率，从而导致游离态Neu5Gc含量的降低。发酵期游离态Neu5Gc显著高于鲜腿（P＜0.05）。
2.4 不同成熟期传统中式火腿中Neu5Gc含量的变化
表 2 新鲜猪腿与新制成品火腿中Neu5Gc含量的比较
Table 2 Comparison of Neu5Gc contents in fresh hind legs and newly prepared hams
µg/g
注：-.未检测到。
取样腿 取样部位新鲜猪腿 新制发酵火腿（120 d）总Neu5Gc含量游离Neu5Gc含量结合态Neu5Gc含量总Neu5Gc含量游离态Neu5Gc含量结合态Neu5Gc含量腿Ⅰ 股二头肌 21.79±0.02 - 21.79±0.02 20.50±0.59 4.25±0.39 16.25±0.20半膜肌 22.98±2.01 4.80±0.49 18.18±1.52腿Ⅱ 股二头肌 26.74±3.85 2.56±0.08 24.18±3.77 22.05±1.83 4.11±0.33 17.93±1.50半膜肌 24.35±3.71 4.51±0.07 19.84±3.64腿Ⅲ 股二头肌 30.62±2.98 - 30.62±2.98 23.75±1.66 3.82±0.29 19.94±1.37半膜肌 25.39±3.22 4.26±0.66 21.13±2.55腿Ⅳ 股二头肌 25.32±1.45 - 25.32±1.45 19.89±3.01 3.78 16.11半膜肌 21.67±2.65 3.57 18.10腿Ⅴ 股二头肌 15.00±0.34 - 15.00±0.34 13.10 3.36 9.74半膜肌 13.78±2.43 3.05±0.79 10.73±1.64
由表2可知，新鲜猪后腿中总Neu5Gc含量为15.00～30.62 µg/g，与报道中结果[33,43-44]一致。经120 d加工（发酵60 d）后，其中总Neu5Gc和结合态Neu5Gc含量均降低，游离态Neu5Gc含量增加。
表 3 发酵期为半年、1 年和2 年成品火腿中不同形态Neu5Gc的含量
Table 3 Contents of total, free and bound Neu5Gc in finished hams with fermentation periods of half a year, one year and two years
发酵时间/年 总Neu5Gc含量/（µg/g）游离态Neu5Gc含量/（µg/g）结合态Neu5Gc含量/（µg/g）0.5 15.09±0.39 2.69±0.10 14.51±0.50 1 14.52±0.38 6.18±0.57 10.46±0.54 2 28.30±0.43 7.46±0.09 22.95±0.52
上述传统中式火腿因发酵期短，仅60 d，仍属新制火腿。为进一步了解长时间发酵的传统中式火腿中Neu5Gc变化，选择发酵半年、1 年和2 年的成品火腿检测其中3 种形态Neu5Gc含量。由表3可知，发酵半年、1 年和2 年成品火腿中总Neu5Gc含量分别为15.09、14.52、28.30 µg/g，游离态Neu5Gc含量分别为2.69、6.18、7.46 µg/g，结合态Neu5Gc含量分别为14.51、10.46、22.95 µg/g。与新制火腿加工过程（0～120 d）中Neu5Gc的变化不同，长时间发酵成品火腿中游离态Neu5Gc含量明显增多，与文琦[43]的研究结果一致。
年龄、饲养条件等不同均会使火腿中Neu5Gc含量不同[45]，导致差异的原因有待研究。无论发酵期长短，新鲜猪后腿和成品火腿间的总Neu5Gc含量相近，与新鲜猪后腿相比，成品火腿中水分含量降低，但未导致总Neu5Gc含量显著升高，间接证明传统中式火腿的加工过程具有降低Neu5Gc含量的作用，其降解机制还需深入研讨。
3 结 论
本实验对传统中式火腿加工过程中以及企业成品火腿中Neu5Gc含量进行检测。随着加工时间的延长，总Neu5Gc、结合态Neu5G、游离态Neu5Gc的含量均呈先升高后降低的趋势；新鲜猪后腿中几乎不含或含有极少量的游离态Neu5Gc，但加工过程中火腿游离态Neu5Gc含量有所增加；发酵半年、1 年和2 年的成品火腿中也发现了游离态Neu5Gc，明显高于新鲜猪后腿中游离态Neu5Gc；在不同加工时期，干基肉样中总Neu5Gc、结合态Neu5Gc含量逐渐降低，且发酵期降低幅度较大，差异性显著（P＜0.05），游离态Neu5Gc含量先升高后降低。
综上，无论是在实验室腌制火腿还是成品火腿中，均发现火腿加工工艺有利于结合态Neu5Gc从糖蛋白和脂蛋白末端的解离，从而转化为游离态Neu5Gc，游离态Neu5Gc进一步的降解导致了总Neu5Gc的降低。目前，尚未有关于发酵过程中化学、微生物变化对火腿中不同形态Neu5Gc转化影响的研究，进一步研究应阐释发酵期间这些变化对Neu5Gc降解的影响。
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