禽肉是我国主要食用肉类之一，广受消费者欢迎[1]。 禽肉营养丰富，味道鲜美，富含蛋白质、脂肪、风味物质等，是人们膳食中不可或缺的重要组成部分[2]。鸡肉在炖煮过程中可释放小肽、游离氨基酸、无机盐、核酸代谢物等物质，赋予鸡汤一定的风味，核酸代谢物是炖肉中与鲜味相关的主要化合物，其中5’-肌苷酸（5’-inosine monophosphate，IMP）对鲜味贡献大[3-4]。核苷酸属于一类有机化合物，由嘌呤碱基或嘧啶碱基、核糖或脱氧核糖以及磷酸3 种物质组成，五碳糖通过β-糖苷键连接，与有机碱合成核苷，核苷与磷酸合成核苷酸，核苷和核苷酸是胞内化合物，参与各种调节和代谢功能[5]。动物宰后短时间内，组织中ATP含量变化较小，随着磷酸肌酸的耗尽及糖原酵解停止，ATP合成反应停止，开始迅速分解。糖原酵解产生的乳酸及ATP降解产生的磷酸，使肌肉pH值下降，肌肉达到极限pH值时，大部分ATP降解为 5’-腺苷酸（5’-adenosine monophosphate，AMP），进而分解生成IMP、无机磷酸和氨，IMP进一步降解生成肌苷（inosine，I）、次黄嘌呤（hypoxanthine，Hx）、磷酸和核糖等[6-7]，AMP及其降解产物结构如图1所示。
图1 肌苷及其关联物结构式
Fig. 1 Structural formulae of inosine and its related compounds
A. AMP；B. IMP；C. I；D. Hx。
随着生活质量的提高，人们对食品的风味、新鲜程度等指标开始广泛关注。近年来，学者开始关注IMP的鲜味贡献，随着IMP降解产生Hx，赋予苦味“异味”，Hx的检测被用于评估食品工业中鱼类的新鲜度。因此无论是研究风味还是研究新鲜度，AMP的降解产物及其相互关系均为肉质评定的重要指标[8-9]。目前，核苷酸及其关联物的研究多集中在生物性样品（如血液、尿液）[10-14]、 中药[15]、保健品（如人参、鹿茸）[16-17]、食用菌[18-22]、水产品（如中华绒螯蟹[23]、草鱼[24]、对虾[25-26]、梭子蟹[27]）等，也有学者研究不同贮藏条件下鸡肉IMP的变化规律[7]， 同时测定AMP及其降解产物的研究还鲜有报道。核苷酸及其关联物的研究方法主要有毛细管电泳法[9,12,28]、生物传感器法[8,13]、高效液相色谱法[12,25,27]、高效液相色谱-飞行时间质谱法[15,28]、高效液相色谱-串联质谱法[10-11,14]等，由于鸡肉基质较为复杂，为了同时满足分离度、灵敏度及定量的需求，本研究利用超高效液相色谱-串联质谱开发出一种鸡肉中AMP、IMP、I、Hx的高效、简易的分析方法，为同时测定动物源性食品中多种核苷酸关联物提供思路，为动物源性食品的风味和新鲜度指标研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鸡肉购自北京市某连锁超市，鸡胸肉及鸡腿肉各200 g，搅碎处理。
IMP（纯度100.0%）、AMP（纯度100.0%）、Hx（纯度99.4%）、乙腈（色谱纯） 上海安谱实验科技股份有限公司；I（纯度98.0%） 上海泰坦科技股份有限公司；甲醇、三氯乙酸、高氯酸（均为优级纯） 国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
1290超高效液相色谱-6470串联四极杆质谱仪 美国Agilent公司；S-100涡旋仪、SR-Ⅱw振荡器 日本 Taiyo公司；DT1028H超声波提取仪 德国Bandelin 公司；CR21N离心机 日本Hitachi公司；Milli-Q纯水仪 美国Millipore公司；ABM-2均质机 株式会社日本精机制作所。
1.3 方法
1.3.1 提取
鸡肉经组织研磨仪研磨后，准确称取2 g（精确至0.001 g）于50 mL离心管中，加入10 mL提取溶剂（分别考察体积分数6%高氯酸、体积分数10%甲醇水溶液、3%高氯酸+10%甲醇水溶液和体积分数5%三氯乙酸的提取效果），选用合适的提取方式提取20 min（分别考察匀浆、超声、振荡、添加陶瓷均质子涡旋4 种提取方式的提取效果），以12 000 r/min离心4 min，将上清液转移至另一离心管中，于残渣中再加入10 mL提取溶剂，重复以上步骤，合并2 次提取溶液，用5.0 mol/L及0.5 mol/L NaOH溶液调节pH值（分别考察将pH值调节至4.5、5.0、5.5、6.0时的效果），待净化。
1.3.2 净化
取提取液5 mL至净化柱（分别考察PRIME HLB固相萃取柱、QuEChERS法、MCX柱3 种净化方式的效果），收集净化液于10 mL接收管中，涡旋0.5 min，过0.22 μm滤膜，供超高效液相色谱-质谱测定。
1.3.3 溶液配制
标准储备溶液：分别准确称取固体标准物质AMP、IMP、I、Hx各10 mg，分别置于4 个50 mL烧杯中，Hx先用2 mL 0.5 mol/L硫酸溶液促进溶解，其他物质加适量的一级水溶解，并用一级水转移并定容至100 mL容量瓶中，摇匀，配制成质量浓度为100 µg/mL的单标储备液，4 ℃冰箱中避光保存。
混合标准溶液：分别吸取各单标储备液适量，用一级水配制成各物质质量浓度梯度为50、100、200、500、1 000 ng/mL的混合标准工作溶液。
1.3.4 仪器条件
色谱条件：色谱柱：SB-Aq RRHD柱（3.0 mm× 100 mm，1.8 µm）；柱温30 ℃；进样体积2 μL；流动相A：甲酸-水溶液（1∶99，V/V）；流动相B：乙腈；流速0.3 mL/min。洗脱梯度见表1。
表1 梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution program
时间/min 流动相体积分数/%流动相A 流动相B 0.00 99 1 0.80 99 1 1.20 92 8 1.90 92 8 2.20 65 35 6.00 30 70 6.01 99 1 7.00 99 1
质谱条件：电喷雾（electrospray ionization，ESI）离子源，正离子模式，毛细管电压2 800 V，干燥气流速11 L/min，喷针气压力241 kPa（35 psi），离子源温度270 ℃，鞘气流速10 L/min，鞘气温度300 ℃，多反应监测模式参数见表2。
表2 4 种化合物质谱多反应监测模式参数
Table 2 Multiple reaction monitoring mode parameters in mass spectroscopy of four compounds
注：*. 定量离子。
化合物 保留时间/min母离子（m/z）子离子（m/z）去簇电压/V碰撞能量/eV AMP 3.929 348 136.0*119.0 90 90 20 76 IMP 2.551 349 137.0*119.0 70 70 12 68 I 4.032 269 137.0*119.0 60 60 8 40 Hx 4.036 137 119.0*110.0 90 90 24 24
1.3.5 结果计算
样品中4 种化合物含量用下式计算。
式中：X为样品中目标化合物含量/（mg/kg）；C为由标准工作曲线拟合得到的样品提取液中目标化合物含量/（ng/mL）；V为最终定容体积/mL；n为样品处理过程中的稀释倍数；m为样品质量/g。
1.4 数据处理
数据处理采用Microsoft Excel 2017软件；化学结构式采用Chemsketch软件绘制；柱状图采用Originpro 8.5软件绘制。
2 结果与分析
2.1 提取溶剂的选择
作为化合物分析的第1步，选择合适的提取溶剂，将目标物从样品基质中高效、快速地提取出来非常重要[29-30]。 本研究选择体积分数6%高氯酸、体积分数10%甲醇水溶液、3%高氯酸+10%甲醇水溶液和体积分数5%三氯乙酸作为提取溶剂，分别考察4 种溶剂的提取效果。由于样品基质本身含有目标化合物，采用基质曲线，以排除基质中所含目标物对实验结果造成的影响。
对比使用不同提取溶剂、加标量为100 ng/mL时的加标回收率。由图2可知，用10%甲醇水溶液作提取溶剂时，IMP、I和Hx的加标回收率都在90%以上，但AMP没有响应，这可能是由于AMP含有氨基，需要提供更多的H+使其发生电离。另外3 种提取溶剂中，使用3%高氯 酸+10%甲醇水溶液时，4 种目标化合物的加标回收率都在85%左右，最高达到88%。使用6%高氯酸和5%三氯乙酸时，4 种目标化合物的加标回收率均不到80%，因此选用3%高氯酸+10%甲醇水溶液作提取溶剂。
图2 不同提取溶剂对加标回收率的影响（n=3）
Fig. 2 Effect of extraction solvents on spiked recoveries (n = 3)
2.2 提取方式的选择
鸡肉中脂肪和蛋白质的含量都很高，在提取过程中对化合物的提取效率会有一定影响。选择合适的提取方式，减小基质对于化合物的干扰很有必要。本研究考察常见的4 种提取方式：12 000 r/min转速下匀浆5 min、超声波提取仪中超声20 min、振荡器振荡30 min、添加陶瓷均质子涡旋20 min，由于样品基质本身含有目标化合物，采用基质曲线，以排除基质中所含目标物对实验结果造成的影响。
对比不同提取方式、加标量为100 ng/mL时的加标回收率。由图3可知，通过匀浆提取的效果最差，加标回收率为75%左右，且相对标准偏差较大，接近2%。通过振荡提取的加标回收率为80%左右，通过超声提取的加标回收率为85%左右，振荡和超声提取的相对标准偏差均约为1%。添加匀浆均质子涡旋的提取效果最好，加标回收率为90%以上，最高达93%，且相对标准偏差小，约为0.5%，因此提取方法选用添加匀浆均质子涡旋。
图3 不同提取方式对加标回收率的影响（n=3）
Fig. 3 Effect of extraction methods on spiked recoveries (n = 3)
2.3 提取液最适pH值的选择
pH值对分析物保留时间和分离效果影响很大，比较不同pH值提取液对目标化合物分离的影响。
由图4可知，当提取液pH值为5.5和6.0时，加标回收率均在80%以下，当提取液pH值为4.5时，加标回收率为81%～87%，当提取液pH值为5.0时加标回收率最高，平均值为91.3%。可能是由于pH值影响目标物质在质谱仪中的电离效果，在pH值为5.0时电离最完全，故选取pH 5.0作为提取液的最适pH值。
图4 不同提取液pH值对加标回收率的影响（n=3）
Fig. 4 Effect of extraction pH on spiked recoveries (n = 3)
2.4 净化方式的选择
样品经过提取后，上清液中还含有大量油脂，油脂分子质量较大，在流动相中流动缓慢，极易堵塞色谱柱，另外油脂和蛋白质对4 种目标物的检测产生基质干扰，降低方法的灵敏度。为了能有效对鸡肉样品进行净化和富集，除去油脂、蛋白质等基质干扰，选择合适的净化方式也十分有必要。本研究选择PRIME HLB固相萃取柱、QuEChERS法、MCX柱3 种方式对样品进行净化。由于样品基质本身含有目标化合物，采用基质曲线，以排除基质中所含目标物对实验结果造成的影响。
对比不同净化方式、加标量为100 ng/mL时的加标回收率。由图5可知，用QuEChERS法和MCX柱净化时的加标回收率均不到90%，相对标准偏差为0.6%～0.9%。用PEIME HLB柱净化时，平均加标回收率达90%以上，相对标准偏差最高只有0.4%，故选取PEIME HLB柱作为净化方式。
图5 不同净化方式对加标回收率的影响（n=3）
Fig. 5 Effect of purification methods on spiked recoveres (n= 3)
2.5 色谱条件优化
在周俊华等[29]的研究基础上，选择乙腈和甲酸水溶液作为流动相，比较Hilic Plus柱、C18柱和SB-Aq柱3 种色谱柱对4 种化合物的分离效果。由图6可知，由于4 种化合物均为极性化合物，在C18柱上保留较弱，易受到杂质的干扰，目标化合物与杂质不能达到有效分离。Hilic柱可以将4 种化合物分离，但分离度不佳、整体响应不高。SB-Aq柱可将4 种化合物有效分离且峰形对称、尖锐，各物质分离度及响应都较Hilic Plus柱高，因此选用SB-Aq柱作为分析色谱柱。考虑到样品基质的复杂性，在后续研究中，选择梯度洗脱来改善分离效果。
图6 使用3 种色谱柱时4 种目标化合物的分离效果
Fig. 6 Separation efficiencies of four target compounds on three chromatographic columns
A. C18柱（4.6 mm×100 mm，2.7 µm）；B. Hilic Plus柱（4.6 mm× 100 mm，3.5 µm）；C. SB-Aq柱（3.0 mm×100 mm，1.8 µm）。
2.6 质谱条件优化
AMP、IMP、I中连接碱基与戊糖的糖苷键在酸性条件下不稳定，容易断裂得到带正电荷的基团，在正离子模式下灵敏度较高，因此选取ESI+模式进行检测。 在ESI+模式下，通过直接进样法，优化各化合物的质谱条件，然后通过全扫描模式，得到化合物[M+H]+准分子离子峰，以此作为它们的母离子。在此基础上，通过子离子扫描寻找子离子，选择2 个丰度较高、本底噪音较低的子离子，并优化去簇电压和碰撞能量，最终选定定量分析条件。各化合物的保留时间、母离子、主要碎片离子、最佳碰撞电压和去簇电压详见表2。定性、定量离子流图见图7，检测样品时，通过质谱仪将母离子打碎成相对应的子离子，且相对丰度与图7一致时，则可确定存在此化合物。
图7 4 种化合物定性、定量离子流图
Fig. 7 Qualitative and quantitative ion current chromatograms for four compounds
A. AMP；B. IMP；C. I；D. Hx。
2.7 方法学考察
2.7.1 线性关系、检出限及定量限
利用逐级稀释法向样品中添加混合标准溶液，配制成AMP、IMP、I、Hx质量浓度梯度均为50、100、200、500、1 000 ng/mL的基质标准溶液，在选定的前处理和仪器条件下进行测定。以3 倍信噪比确定检出限，10 倍信噪比确定定量限。
由表3可知，该方法在50～1 000 ng/mL范围内线性良好，4 种目标化合物相关系数均大于0.996，AMP检出限和定量限分别为0.05、0.20 mg/kg，IMP检出限和定量限分别为0.02、0.10 mg/kg，I和Hx检出限和定量限均分别为0.03、0.15 mg/kg。
表3 4 种目标化合物的回归方程、相关系数、检出限和定量限
Table 3 Calibration curve equations, correlation coefficients, limits of detection and limits of quantification of four target compounds
化合物 线性方程 相关系数 检出限/（mg/kg）定量限/（mg/kg）AMP y=39.1x+1 765.5 0.996 5 0.05 0.20 IMP y=44.1x-801.5 0.998 2 0.02 0.10 I y=168.5x+5 561.4 0.997 7 0.03 0.15 Hx y=23.4x+567.3 0.999 6 0.03 0.15
2.7.2 稳定性实验
取2 g鸡肉样品，按照选定的前处理方法进行处理，将所得溶液按照选定的仪器方法于放置0、2、4、6、8、10、12 h进样测定。由表4可知，4 种目标化合物含量测定的相对标准偏差为0.3%～0.8%，表明样品溶液在12 h内稳定。
表4 鸡肉中4 种目标化合物在不同放置时间内的含量变化
Table 4 Changes in contents of four compounds in chicken at different storage times
放置时间/h AMP含量/（mg/kg）IMP含量/（mg/kg）I含量/（mg/kg）Hx含量/（mg/kg）0 10.1 365.3 232.5 148.1 2 10.0 364.3 231.5 148.0 4 10.0 364.7 231.1 147.5 6 9.9 363.7 230.6 147.8 8 9.9 362.3 229.9 147.5 10 10.0 361.6 228.5 148.3 12 9.9 361.3 228.3 147.3相对标准偏差/% 0.8 0.5 0.7 0.3
2.7.3 加标回收率和精密度实验
称取鸡肉样品6 份，每份2.0 g，向样品中分别添加不同质量浓度的混合标准溶液，使加标量分别为0.25、1.00、5.00 mg/kg，按照选定的前处理方法和仪器方法进行加标回收率和精密度实验。
由表5可知，在3 个加标水平下，4 种目标化合物的加标回收率为79.63%～91.08%，相对标准偏差均小于5.0%，表明所建立的方法准确度较好，能满足鸡肉中4 种目标化合物含量测定要求。
表5 鸡肉基质加标回收率及精密度测定结果（n=6）
Table 5 Spiked recoveries and precision (RSDs) in chicken matrix (n= 6)
化合物 加标量/（mg/kg） 加标回收率/% 相对标准偏差/%AMP 0.25 1.00 5.00 79.83～84.73 80.33～83.67 81.85～84.84 2.1 2.7 3.0 IMP 0.25 1.00 5.00 86.36～89.03 87.17～91.08 86.25～88.78 1.5 1.9 3.5 I 0.25 1.00 5.00 82.13～85.63 86.43～89.73 84.72～87.42 1.0 4.5 2.1 Hx 0.25 1.00 5.00 79.63～83.83 83.59～87.26 82.85～85.62 2.1 1.8 1.5
3 结 论
建立鸡肉中AMP、IMP、I、Hx 4 种化合物的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。在优化条件下，4 种化合物得到有效分离，基线平稳，稳定性好；对样品进行不同水平加标实验，结果表明，回收率较高，精密度较好。该方法简便、可靠、实用性强，适合于鸡肉中AMP、IMP、I、Hx含量的测定。
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