羊肉因其瘦肉多、肌纤维细嫩、味美多汁、易消化并富含人体必需氨基酸和微量元素等优点，被认为是肉类食品中的“贵族”[1-2]。肌肉品质包括肌肉的色泽、嫩度、系水力、熟肉率和pH值等，其化学成分与营养性密切相关。近年来，随着收入水平的提高，羊肉的消费增长日趋加快，供需缺口不断扩大，于是市场上不断出现不合格羊肉和掺假羊肉制品问题，羊肉的品质成为人们最为关注的重要因素之一[3-4]。为增强对羊肉产品质量的监控，建立多种检测方法以评价羊肉及其制品品质，包括感官鉴别[5]、酶联免疫吸附测定[6]以及聚合酶链式反应[7]等。羊肉营养价值的评定主要包括水分、蛋白质、脂肪、灰分含量等，尤其是多不饱和脂肪酸和氨基酸含量，它们与人类心脑血管及其他由于机体代谢产生的疾病密切相关[8]。肉品中氨基酸的含量及组成是评价蛋白质营养价值高低的主要因素，直接影响肉品蛋白质营养价值[9]。非必需氨基酸甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸和必需氨基酸异亮氨酸是肉品香味的前体氨基酸，与肉品的风味直接相关[10]。检测氨基酸含量及组成是评定羊肉营养价值不可或缺的一部分。
氨基酸检测技术不断发展，常用的氨基酸检测方法有分光光度法[11]、高效液相色谱法[12]、毛细管电泳法[13]及其他方法[14]。这些氨基酸检测技术虽然准确度高，但对技术人员要求较高、耗时长、成本高。近年来，近红外光谱（near infrared spectroscopy，NIRS）技术的出现改变了这一状况。与传统的分析技术相比，NIRS技术具有快速、无污染、实验重现性好、精度高等优点，是食品安全检测行业主要的发展方向[15]。本研究采用NIRS技术对乌珠穆沁羊肉中氨基酸含量进行预测，探索该方法的应用前景，为测定羊肉中氨基酸含量提供一种快速、准确的方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
于锡林郭勒盟东乌珠穆沁旗，选取相同饲喂条件、体质量相近的6 月龄乌珠穆沁羊42 只，屠宰后分别采集臂三头肌、股二头肌以及背最长肌，共126 块肌肉样本，放入冻存管中，迅速放入液氮，－80 ℃保存备用。
茚三酮显色液、pH缓冲液 内蒙古罡耀商贸有限公司；盐酸（分析纯） 天津市福晨化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
Antaris™ II傅里叶变换NIRS分析仪 美国赛默飞世尔科技公司；LA8080氨基酸分析仪 日本日立公司；－80 ℃冰箱 海尔公司；FA2204分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司；N-EVAPTM氮吹仪美国Organomation公司；ZFD-5140全自动新型恒温鼓风干燥箱 上海智城分析仪器公司。
1.3 方法
1.3.1 氨基酸含量的测定
参照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》[16]采用氨基酸分析仪进行测定。
1.3.2 羊肉光谱采集与处理
取出冻存的肉样解冻5 min，用不锈钢刀将解冻后的样本切碎成肉糜状，取5～10 g置于傅里叶变换NIRS分析仪样品杯中进行检测。参数设置：扫描分辨率16 cm－1，增益8×，扫描次数250。每个样本扫描3 次，保存平均光谱。
利用TQ Analysis软件分析光谱特征，采用多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）和标准化正态变量（standardized normal variate，SNV）变换对光谱进行预处理[17-18]，消除由于环境造成的光谱间差异，随后对全光谱求一阶导数或二阶导数以放大光谱中的特征信息，突出可能与定量信息相关的波段，并选择Savitzky-Golay方法或Norris方法平滑光谱中的噪音，最后利用波段信息进行关联建模。通过偏最小二乘（partial leastsquare，PLS）法建立NIRS预测模型，用交叉验证法检验模型的稳定性。
1.4 数据处理
采用Excel 2010软件对不同部位肌肉样本的氨基酸含量数据进行处理，采用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析，结果以平均值±标准差表示，P＜0.05表示差异显著，P＞0.05表示差异不显著。
2 结果与分析
2.1 乌珠穆沁羊不同部位肉的氨基酸含量
表1 羊肉不同肌肉组织的氨基酸组成及含量（n=42）
Table 1 Amino acid contents of different muscle tissues of sheep (n= 42)g/100 g
注：*. 必需氨基酸（essential amino acid，EAA）；#. 鲜味氨基酸（umami amino acid，UAA）；TAA. 总氨基酸（total amino acid）；同列小写字母不同，表示差异显著（P＜0.05）。
氨基酸 臂三头肌 股二头肌 背最长肌天冬氨酸（Asp）# 1.60±0.29 1.65±0.34 1.70±0.34组氨酸（His） 0.58±0.17b 0.59±0.18b 0.68±0.20a精氨酸（Arg）# 0.93±0.27 0.99±0.30 1.02±0.32脯氨酸（Pro） 0.63±0.19 0.86±1.32 0.71±0.20丝氨酸（Ser） 0.65±0.12 0.69±0.15 0.70±0.14谷氨酸（Glu）# 2.91±0.55 2.99±0.63 2.99±0.59甘氨酸（Gly）# 0.78±0.13b 0.81±0.22ab 0.90±0.31a丙氨酸（Ala）# 1.04±0.18b 1.07±0.21ab 1.12±0.21a半胱氨酸（Cys） 0.31±0.05 0.30±0.05 0.31±0.05酪氨酸（Tyr） 0.44±0.09 0.45±0.10 0.46±0.09缬氨酸（Val）* 0.90±0.15 0.92±0.17 0.95±0.18蛋氨酸（Met）* 0.35±0.12 0.34±0.11 0.34±0.12异亮氨酸（Ile）* 0.69±0.14 0.70±0.16 0.73±0.16亮氨酸（Leu）* 1.35±0.23 1.39±0.27 1.42±0.28苯丙氨酸（Phe）* 0.67±0.15 0.69±0.15 0.68±0.14赖氨酸（Lys）* 1.74±0.38 1.75±0.42 1.83±0.43苏氨酸（Thr）* 0.79±0.15 0.82±0.18 0.84±0.18 TAA 16.35±3.10 17.00±3.42 17.40±3.44 EAA 6.49±1.26 6.60±1.40 6.80±1.43 UAA 7.26±1.34 7.51±1.59 7.73±1.54
由表1可知：只有少数氨基酸含量在不同部位羊肉间存在显著差异，组氨酸在背最长肌中的含量显著高于臂三头肌和股二头肌（P＜0.05），甘氨酸和丙氨酸在背最长肌中的含量显著高于臂三头肌（P＜0.05）；其他氨基酸、TAA、EAA以及UAA含量在不同部位羊肉间差异均不显著。各成分分布变化均匀，变化范围较大，符合正态分布，样品集的选择相对合理。
2.2 乌珠穆沁羊肉NIRS分析结果
图1 126 个样品平均光谱图
Fig. 1 Average spectra of 126 muscle samples
对126 个样品进行傅里叶变换NIRS扫描，结果如图1所示。样品光谱相对集中，光谱各波段变化趋势基本一致。在1 200 nm和1 450 nm处有明显吸收峰，分别为C－H振动的二级倍频、O－H伸缩振动的一级倍频以及N－H伸缩振动的一级倍频；在1 730 nm处吸收峰较低，为C－H的一级倍频吸收。
2.3 PLS法建模
通常在建模前需要对采集的光谱进行预处理，来平衡NIRS采集过程中因为环境干扰导致的光谱基线漂移[19-20]。对不同预处理方法进行组合，通过PLS法建立NIRS预测模型，结合交叉验证法验证模型的稳定性，选择交叉验证均方根误差（root mean square error of cross validation，RMSECV）最小且决定系数（R2）较高的模型作为建模结果。所建立模型的因子数、校正均方根误差（root mean square error of calibration，RMSEC）、RMSECV、R2校正、R2验证如表2所示。
表2 乌珠穆沁羊肉中氨基酸含量的NIRS预测模型参数
Table 2 Parameters of prediction models for amino acid contents in Wuzhumuqin sheep meat
氨基酸 因子数 RMSEC RMSECV R2校正 R2验证TAA 3 1.080 1.190 0.853 0.818 EAA 2 0.533 0.567 0.828 0.803 UAA 6 0.501 0.755 0.876 0.687 Asp 3 0.122 0.129 0.776 0.743 His 5 0.071 0.079 0.886 0.861 Arg 4 0.173 0.173 0.785 0.739 Pro 2 0.081 0.103 0.791 0.672 Ser 2 0.060 0.063 0.747 0.712 Glu 2 0.264 0.276 0.756 0.731 Gly 6 0.044 0.069 0.878 0.655 Ala 2 0.093 0.099 0.696 0.641 Cys 7 0.025 0.029 0.651 0.526 Tyr 4 0.041 0.044 0.772 0.724 Val 4 0.074 0.079 0.752 0.713 Met 9 0.055 0.063 0.796 0.725 Ile 4 0.057 0.060 0.789 0.767 Leu 4 0.114 0.114 0.771 0.736 Phe 2 0.058 0.061 0.783 0.755 Lys 4 0.142 0.152 0.878 0.858 Thr 2 0.075 0.078 0.707 0.680
由表2可知，TAA、EAA、组氨酸、赖氨酸含量的NIRS预测模型R2校正分别为0.853、0.828、0.886、0.878，交叉验证后，R2验证分别为0.818、0.803、0.861和0.858，预测准确度较高。TAA、EAA、组氨酸、赖氨酸含量NIRS预测模型交叉验证结果见图2～5。
图2 TAA含量预测模型的验证集及交叉验证结果
Fig. 2 RMSEC and RMSECV of prediction model for TAA content
图3 EAA含量预测模型的验证集及交叉验证结果
Fig. 3 RMSEC and RMSECV of prediction model for EAA content
图4 组氨酸含量预测模型的验证集及交叉验证结果
Fig. 4 RMSEC and RMSECV of prediction model for His content
图5 赖氨酸含量预测模型的验证集及交叉验证结果
Fig. 5 RMSEC and RMSECV of prediction model for Lys content
2.4 模型的验证
选择20 个未参加建模的不同部位羊肉样本，扫描光谱并带入预测模型进行验证。本研究中乌珠穆沁羊肉各氨基酸含量的预测值与真实值之间差异较小，变化趋势一致，构建的预测模型较理想。分别计算预测模型的验证集标准偏差与预测标准偏差的比值（ratio of standard deviation of the validation set to standard error of prediction，RPD），判断模型的预测效果。当RPD≥3.0时，表明模型具有较高的预测能力，能够对未知样品进行精确预测；当RPD大于或接近2.0时，表明模型具有良好的预测能力，虽不能精确预测，但在误差允许范围内仍能用于大批量样品的预测工作。在样品浓度范围相同的前提下，RPD越大，准确性越高。本研究中EAA、组氨酸、精氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸含量预测模型的RPD均大于1.74，TAA含量预测模型的RPD为2.60，其中TAA、EAA、组氨酸和赖氨酸预测模型的外部验证结果如图6～9所示。
图6 TAA含量预测模型外部验证结果
Fig. 6 External validation results of TAA prediction model
图7 EAA含量预测模型外部验证结果
Fig. 7 External validation results of EAA prediction model
图8 组氨酸含量预测模型外部验证结果
Fig. 8 External validation results of His prediction model
图9 赖氨酸含量预测模型外部验证结果
Fig. 9 External validation results of Lys prediction model
3 讨 论
不同年龄阶段的乌珠穆沁羊肉氨基酸含量不同。孟和那仁[21]的研究表明，6 月龄乌珠穆沁羊肉的水分、干物质、脂肪和蛋白质含量等食用品质指标较高，具有很好的食用价值。王莉梅等[22]研究表明，6 月龄和18 月龄乌珠穆沁羊肉品质差异不大，略优于12 月龄，且6 月龄和18 月龄羊肉的氨基酸组成优于12 月龄。本实验结果表明，6 月龄乌珠穆沁羊不同部位肌肉组织中TAA含量差异不大。
目前，NIRS技术已被广泛用于预测肉类化学物质的组成及含量评价其品质，但微量营养成分含量预测结果的准确度往往低于常量成分，相关研究进展缓慢，国内外鲜有利用NIRS技术预测肉中氨基酸含量的报道，这可能是由于建立稳定模型需要大量的实际测定数据。刘晓琳等[23]利用NIRS技术预测冷鲜羊肉中蛋白质、脂肪和水分含量，相关系数分别为0.931 2、0.915 7和0.920 0；Viljoen等[24]利用NIRS技术对冻干羊肉中的灰分、干物质、粗蛋白以及粗脂肪含量进行快速检测；Guy等[25]证明NIRS技术可以作为一种快速、方便的方法来预测羔羊肉中的主要脂肪酸组成；Fowler等[26]利用手持NIRS仪原位预测羔羊肉肌内脂肪含量，相关系数为0.58。本实验结果证明NIRS技术具有预测羊肉肌内氨基酸含量的可行性，进一步为屠宰线上利用NIRS技术检测羊肉品质提供了理论依据。
不同氨基酸存在不同的特征光谱，使其定标模型建立的最佳波长范围不一致。陶琳丽等[27]研究20 种氨基酸的分子结构与其NIRS的相关性，发现20 种氨基酸主要存在4 个特征光谱区域，分别为1 050～1 200、1 300～1 500、1 600～1 850 cm－1和2 000～2 502 cm－1，利用此4 个NIRS特征区域对氨基酸进行定量和定性分析提高了氨基酸NIRS模型预测的准确性。李军涛等[28]利用NIRS技术快速测定小麦中EAA含量发现，赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸及色氨酸在1 100～2 498 nm范围内的预测效果最佳，其余6 种EAA在400～2 498 nm范围内的预测效果最佳。本研究选择在1 000～2 500 nm范围内对不同氨基酸含量建立预测模型，预测效果良好，准确度较高。
不同的预处理方法可以改善定标模型的效果。二阶导数处理能够加强样品光谱间的差异[29]，MSC和SNV结合处理可以消除由于环境干扰造成的光谱间差异。陆艳婷等[30]在粳稻7 种EAA含量NIRS分析中发现，不同光谱预处理方法对NIRS模型的预测结果有较大影响，预处理后模型的校正效果得到提高。亐开兴等[31]建立牛肉中基础营养成分和氨基酸含量的NIRS预测模型，结果表明，水分、脂肪、蛋白质、灰分、天冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸等含量的NIRS预测模型的
均超过0.66，丝氨酸、谷氨酸、半胱氨酸含量NIRS预测模型的
为0.286～0.584，甘氨酸含量NIRS预测模型的
最低，为0.286；本实验结果较其更理想。
4 结 论
本实验建立了乌珠穆沁羊肉中17 种氨基酸的定量预测模型，TAA、EAA、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸、谷氨酸、丝氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸含量预测模型的
均超过0.70，其中TAA、EAA、组氨酸和赖氨酸含量NIRS预测模型的R2验证分别为0.818、0.803、0.861和0.858，准确度较高。对各预测模型进行外部验证，EAA、组氨酸、精氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸含量预测结果的RPD超过1.74，TAA含量预测结果的RPD为2.60，模型预测性能良好，达到应用水平，可作为快速、准确测定羊肉营养成分的方法。
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