随着经济的发展和生活水平的提高，人们对肉品的消费要求由量的需求转向对质的需求。作为质量的重要要素，风味在肉品质量评价中起到至关重要的作用。肉品风味包括肉的滋味和香味，滋味主要是指甜味、咸味、鲜味、酸味和苦味等。鲜味物质包括无机盐类、有机酸类、有机碱类、游离氨基酸及其盐类、核苷酸及其盐类、肽类等[1]。鲜味物质对肉品鲜味的贡献取决于其含量与味觉阈值之比[2]。目前研究发现具有鲜味特征的核苷酸及其衍生物共有30多种，其中肌苷酸在猪肉中含量较高，对肉品鲜味的贡献远高于其他呈味核苷酸（鸟苷酸、腺苷酸等），为主要呈味核苷酸[3-5]。畜禽屠宰后，肌肉中腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）迅速降解为肌苷酸，但肌苷酸在肌肉中不稳定，其在磷酸酶作用下会分解为肌苷，并在核苷水解酶作用下进一步分解为次黄嘌呤，肌苷与次黄嘌呤具有苦味，给肉的鲜味带来负面作用，使鲜味强度降低[6]。此外，氨基酸也是肉类主要呈味物质之一，具有鲜味的氨基酸包括谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸及酪氨酸，其中谷氨酸与天冬氨酸味觉阈值较低，在猪肉中的含量较高，为主要的鲜味氨基酸[7]，其能与肌苷酸发生协同作用，共同作用于鲜味受体[8]，使鲜味强度增强[9]。谷氨酸和肌苷酸协同作用后还能缓冲酸、碱等不良味道[10-11]。肌苷酸与鲜味氨基酸协同作用后的鲜度强度可用味精当量（equivalent umami concentration，EUC）表示[12]。
目前，肌肉中肌苷酸与游离氨基酸含量已被用作肉类滋味评定的重要指标，被广泛应用于畜禽肉的品质评定[13]。本研究选择商品化猪场养殖的杜长大外三元杂交猪、北京黑猪、东北民猪和五指山猪等地方品种商品猪为实验材料，分析其背最长肌中肌苷酸、肌苷、次黄嘌呤等主要呈味核苷酸、谷氨酸及天冬氨酸等主要鲜味氨基酸含量差异，并计算其EUC，为目前市场上不同品种猪肉鲜味差异的原因探究提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
选择商业化猪场中健康、符合上市要求的不同品种猪30 头，其中东北民猪5 头、五指山猪5 头、北京黑猪10 头、杜长大外三元杂交猪10 头，宰前24 h禁食，宰后24 h取背最长肌，－20 ℃冻藏备用。
肌苷酸二钠、肌苷、次黄嘌呤标准品 美国Sigma公司；谷氨酸、天冬氨酸标准品 德国Dr.Ehrenstorfe公司；高氯酸、氢氧化钠（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；三乙胺（色谱级） 美国Thermo Fisher Scientific公司；甲醇（色谱级） 德国Merck公司；无菌微孔亲水性滤膜（0.22 μm） 天津市科亿隆实验设备有限公司。
1.2 仪器与设备
Alliance 2965高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪（配有24875紫外检测器） 美国Waters公司；Zorbax SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美国Agilent公司；AG245分析天平、BPH-7200 pH计 瑞士Metler-Toledo公司；Genius 3旋涡混合器 德国IKA公司；LD5-2B高速离心机 北京京立离心机有限公司；JR-B03绞肉机德国德玛仕有限公司；SB-5200D超声仪 宁波新智生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 肌苷酸、肌苷、次黄嘌呤含量测定
1.3.1.1 样品前处理
将猪肉样品绞碎，称取2.0 g（精确至0.000 1 g）于50 mL离心管中，加入10 mL体积分数6%高氯酸作为提取剂，涡旋混匀，4 ℃静置提取1 h，5 000 r/min离心10 min，取上清液，沉淀用体积分数6%高氯酸再次提取，合并2 次上清液，用3 mol/L氢氧化钠调节pH值至6.5，加水定容至50 mL，摇匀，过0.22 μm无菌微孔亲水性滤膜，滤液装入2 mL进样瓶，HPLC测定，外标法定量。
1.3.1.2 色谱条件
Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；紫外检测波长250 nm；进样量10 μL；流动相A：体积分数1%三乙胺（用磷酸调pH值至3），流动相B：甲醇，流动相A、B体积比98∶2，等梯度洗脱；流速1 mL/min；柱温25 ℃。
1.3.1.3 待测物含量计算
样品中待测物含量按式（1）计算。
式中：X为样品中待测物含量/（mg/g）；ρ为根据标准曲线得到的样品溶液中待测物质量浓度/（mg/L）；V为样品溶液体积/mL；m为样品质量/g。
1.3.2 游离氨基酸含量测定
参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》[14]的方法对谷氨酸和天冬氨酸含量进行测定。
1.3.3 EUC计算
EUC表示呈味核苷酸与鲜味氨基酸协同作用后的整体鲜味强度，以具备同等鲜味强度的谷氨酸单钠含量来表示[12]，按式（2）计算。
式中：1 218为协同作用常数；ai为鲜味氨基酸含量/（g/100 g）；bi为鲜味氨基酸相对于谷氨酸单钠的鲜味系数（谷氨酸为1，天冬氨酸为0.077）；aj为呈味核苷酸含量/（g/100 g）；bj为呈味核苷酸相对于肌苷酸的鲜味系数（肌苷酸为1，肌苷、次黄嘌呤不与鲜味氨基酸产生协同作用，故无鲜味系数）。
1.4 数据处理
用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计分析；用Origin 8.5软件作图。
2 结果与分析
2.1 肌苷酸、肌苷、次黄嘌呤含量测定方法考察
目前我国尚未规定畜禽肉中肌苷酸及其降解物（肌苷、次黄嘌呤）含量测定的标准方法，文献报道的测定方法中测定条件差异较大，因此本研究对猪肉中肌苷酸及其降解物含量测定的前处理方法和HPLC条件进行优化，并从方法线性关系、回收率、精密度等方面进行方法学考察。
表1 肌苷酸、肌苷和次黄嘌呤的线性关系、回收率和精密度（n=6）
Table 1 Recovery, precision (relative standard deviation) and calibration curve equations of inosinic acid, inosine and hypoxanthine (n= 6)
目标物 线性范围/（mg/L） 线性方程 相关系数（R2） （mg/L） 回收率/% 相对标准偏差/%添加量/肌苷酸 5～100 0 y=15 245x+117 324 1.000 0 20 87.97 5.38 50 97.51 0.87 100 98.42 0.21肌苷 2～500 y=23 968x+86 753 0.999 9 10 85.63 1.86 20 90.38 4.07 50 87.03 2.40次黄嘌呤 1～250 y=43 646x+35 848 0.999 7 2 110.84 4.65 5 91.07 1.52 10 93.73 2.30
由表3可知，从线性关系来看，经过前处理方法和HPLC条件优化后，在一定线性范围内肌苷酸、肌苷、次黄嘌呤峰面积与质量浓度均呈良好线性关系，R2均大于0.999。按照低、中、高3 个水平向猪肉样品中添加一定量的肌苷酸、肌苷和次黄嘌呤标准溶液，使处理后溶液中肌苷酸添加量分别为20、50、100 mg/L，肌苷添加量分别为10、20、50 mg/L，次黄嘌呤添加量分别为2、5、10 mg/L，每个水平做6 个重复，计算回收率。结果表明，肌苷酸、肌苷、次黄嘌呤回收率均为80%～120%，相对标准偏差均小于10%，满足方法要求。
2.2 不同品种猪肉中肌苷酸、肌苷、次黄嘌呤含量比较
图1 不同品种猪肉中肌苷酸、肌苷、次黄嘌呤含量
Fig. 1 Contents of inosinic acid, inosine and hypoxanthine in pork from different breeds
肌苷酸及其降解物肌苷、次黄嘌呤对猪肉鲜味具有重要影响[15]。由图1可知，品种对猪肉中肌苷酸、肌苷和次黄嘌呤的含量有极显著影响（P＜0.01）。比较3 种地方品种猪肉与杜长大外三元杂交猪肉中肌苷酸、肌苷、次黄嘌呤含量发现，东北民猪肌苷酸含量（2.202 mg/g）显著高于杜长大外三元杂交猪（2.092 mg/g）（P＜0.05），北京黑猪肌苷酸含量最低（1.988 mg/g），显著低于杜长大外三元杂交猪（P＜0.05），五指山猪肌苷酸含量（2.028 mg/g）与杜长大外三元杂交猪之间无显著差异。杜长大外三元杂交猪肌苷含量最低（0.542 mg/g），显著低于东北民猪（0.618 mg/g）（P＜0.05），极显著低于北京黑猪和五指山猪（P＜0.01）。东北民猪次黄嘌呤含量最低（0.065 mg/g），极显著低于其他3 个品种猪（P＜0.01），五指山猪、北京黑猪与杜长大外三元杂交猪相比均无显著差异。总体来看，3 种地方品种与外来品种相比，背最长肌中肌苷酸、肌苷、次黄嘌呤含量差异不一，从肌苷酸含量对鲜味贡献来看，东北民猪呈鲜味的肌苷酸含量最高，呈苦味的次黄嘌呤含量最低，肌苷含量虽高于杜长大外三元杂交猪，但显著低于北京黑猪（P＜0.05），极显著低于五指山猪（P＜0.01），表明东北民猪在鲜味呈味表现上具有明显优势。
目前，关于中国地方品种猪与外来品种、外来杂交品种猪肉中肌苷酸及其降解物含量差异的比较研究，国内外已有相关报道。Ellis等[16]研究发现，我国地方品种小梅山猪肌肉中肌苷酸含量显著高于外来瘦肉型品种及外来品种与小梅山猪的杂交品种。也有研究发现，有些中国地方品种与外来品种相比，肌苷酸含量并不占优势，如地方品种荣昌猪的肌苷酸含量与外来品种长白猪之间无显著差异[17]；小梅山猪、小梅山猪二元杂交、小梅山猪三元杂交猪背最长肌的肌苷酸含量与大约克猪均无显著差异[18]；金华猪肌苷酸含量与长白、大约克杂交猪之间无显著差异，金华猪与长白猪的杂交品种肌苷酸含量显著低于长白、大白的杂交品种[19]；地方品种甘肃黑猪的肌苷酸含量低于外来品种与地方品种杂交的甘肃长白猪，而呈苦味的肌苷和次黄嘌呤含量高于甘肃长白猪[20]。同时，不同地方品种猪肉中肌苷酸及其降解物含量的差异比较也有相关研究，如地方品种青海八眉猪的肌苷酸含量高于甘肃黑猪，而青海八眉猪的次黄嘌呤与肌苷含量低于甘肃黑猪[20]。本研究发现，东北民猪肌苷酸含量最高，次黄嘌呤含量最低，从鲜味呈味上与杜长大外三元杂交猪相比具有显著优势，但北京黑猪和五指山猪在肌苷酸及其降解物含量上并无鲜味呈味优势，表明并非所有的地方品种猪在肌苷酸及其降解物含量上比杜长大外三元杂交猪具有更好的鲜味呈味优势。肌苷酸及其降解产物含量除了受品种因素影响外，还与饲料等多种因素有关。凌俊等[21]研究不同蛋白日粮对猪肉中肌苷酸含量的影响，结果发现，不同蛋白日粮可显著影响猪肉中肌苷酸含量；Wang Xiaofang等[22]研究发现，在饲料中添加黄酮类物质后，畜禽肌肉中肌苷酸含量显著提高。张会丰等[23]对不同养殖模式下肉鸡肌肉肌苷酸含量差异进行比较，发现同种饲料喂养条件下，散养肉鸡肌肉中肌苷酸含量显著高于笼养肉鸡。本实验选用的品种猪来自于各商业化猪场，故饲料营养、饲养环境及宰前处理有所差异，各品种猪饲养和屠宰条件对其肌苷酸含量的影响还有待进一步研究。
2.3 不同品种猪肉中鲜味氨基酸含量比较
图2 不同品种猪肉中谷氨酸及天冬氨酸含量
Fig. 2 Contents of glutamic acid and aspartic acid in pork from different breeds
肌肉中氨基酸含量及组成受动物品种等因素影响。由图2可知，在4 个不同品种中，谷氨酸和天冬氨酸的含量差异变化趋势类似。北京黑猪谷氨酸含量最高（3.872 g/100 g），极显著高于东北民猪和五指山猪（P＜0.01），与杜长大外三元杂交猪差异不显著，东北民猪谷氨酸含量（3.545 g/100 g）与杜长大外三元杂交猪无显著差异，五指山猪（3.307 g/100 g）显著低于东北民猪（P＜0.05），极显著低于北京黑猪和杜长大外三元杂交猪（P＜0.01）。北京黑猪天冬氨酸含量最高，极显著高于东北民猪和五指山猪（P＜0.01），显著高于杜长大外三元杂交猪（P＜0.05），杜长大外三元杂交猪极显著高于五指山猪（P＜0.01），与东北民猪差异不显著。
目前关于不同品种猪肉中氨基酸含量比较也有相关研究报道。有研究发现，不同品种猪肉中除酪氨酸、天冬氨酸、组氨酸外，其余氨基酸含量差异均显著，其中安徽地方品种定远黑猪、皖南花猪、安庆六白猪背最长肌中鲜味氨基酸含量均显著高于外来瘦肉型品种猪[24]。但也有研究发现，地方品种莆田黑猪背最长肌中鲜味氨基酸总含量与外来品种杜洛克猪和大约克猪相比无显著差异，且3 个品种中大约克猪谷氨酸含量最高[25]。本研究结果显示，北京黑猪谷氨酸含量除与杜长大外三元杂交猪差异不显著外，均显著高于其他品种，北京黑猪天冬氨酸含量均显著高于其他品种。总体来说，并不是所有地方品种猪肉的鲜味氨基酸含量具备显著优势。与肌苷酸相同，氨基酸含量除受品种因素影响外，也可能与不同猪场的饲养环境、饲料营养、屠宰时间、屠宰前处理等因素有关，各因素对商品化各品种猪的具体影响尚需进一步细化研究。
2.4 不同品种猪肉EUC比较
除了比较不同品种猪肉肌苷酸、肌苷、次黄嘌呤、谷氨酸和天冬氨酸含量差异外，引入EUC对肌苷酸与谷氨酸、天冬氨酸之间的协同呈鲜作用进行比较分析。当肌苷酸与鲜味氨基酸同时存在时，对鲜味的呈现产生协同效应，主要机理为鲜味氨基酸和肌苷酸与舌前部的T1R1/T1R3鲜味受体蛋白相互结合，使其空间结构发生改变，增强鲜味传导作用[26-27]。在肌苷酸和谷氨酸起协同作用时，也有味觉缓冲作用，对酸味和苦味产生抑制性作用[11]。谷氨酸与肌苷酸质量比1∶1混合时，其协同作用最为明显，可达到单独使用谷氨酸的7 倍[28]，当肌苷酸二钠与谷氨酸二钠质量比1∶1混合后，肌苷酸的味觉阈值可由25 mg/100 g降为6.3 mg/100 g[29-30]。目前，一般使用EUC来衡量谷氨酸与肌苷酸的协同增鲜作用。
图3 不同品种猪肉的EUC
Fig. 3 EUC of pork from different breeds
由图3可知，在4 个品种中，东北民猪EUC最高，达到999.38 g/100 g，但与杜长大外三元杂交猪和北京黑猪均差异不显著，五指山猪EUC（855.93 g/100 g）极显著低于其他3 个品种（P＜0.01），表明其肌苷酸和鲜味氨基酸协同作用后的鲜味相对其他3 个品种更差，但并不代表五指山猪风味更差。五指山猪肉可能在挥发性香气方面具有优势，有研究发现五指山猪肌肉中与风味有关的脂肪和脂肪酸等含量较高，其肉香味更浓[31]。
在4 个品种中，东北民猪在肌苷酸含量上占优势，北京黑猪在鲜味氨基酸含量上占优势，但二者与杜长大外三元杂交猪的EUC相比并无显著差异，表明东北民猪和北京黑猪肉在肌苷酸和鲜味氨基酸协同作用后带来的鲜味与杜长大外三元杂交猪肉相比不占明显优势。但猪肉中的肌苷酸与氨基酸含量会随加热方式的变化而变化，且不同品种猪肉在同一加热方式下的变化规律不同。有研究发现，梅山猪背最长肌加热后的肌苷酸含量为加热前的85%，而杜洛克猪背最长肌加热后的肌苷酸含量仅为加热前的63%[32]。也有研究发现，猪肉中谷氨酸等氨基酸含量在水煮、高温炖煮和高压蒸煮3 种加热方式下的变化规律不一致[33]。因此，对于不同品种猪肉中肌苷酸和鲜味氨基酸含量差异，以及其在同一加工条件下的变化规律差异还有待进一步研究。此外，肉制品鲜味的呈现除与鲜味核苷酸和鲜味氨基酸有关外，还与有机酸类[34]、有机碱类[35]、肽类[36-37]等有关，且不同类别的鲜味物质之间存在增强效应、加和作用与抑制作用[9]，对于不同品种肉之间总体鲜味物质的差异还有待进一步研究。
3 结 论
通过对4 个品种猪肉的肌苷酸及其降解物以及鲜味氨基酸含量差异进行分析发现：地方品种东北民猪肌苷酸含量显著高于其他3 个品种（P＜0.05），次黄嘌呤含量极显著低于其他3 个品种（P＜0.01）；北京黑猪鲜味氨基酸含量最高，其中天冬氨酸含量显著高于其他品种（P＜0.05），谷氨酸含量显著高于除杜长大外三元杂交猪以外的其他品种（P＜0.05）；但东北民猪和北京黑猪EUC与外来品种杜长大外三元杂交猪之间并无显著差异，五指山猪EUC极显著低于其他3 个品种（P＜0.01）。3 种地方品种猪肉肌苷酸和鲜味氨基酸协同作用后带来的鲜味特征均不占明显优势，但对于猪肉加工后鲜味物质含量差异还有待于深入研究。
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