随着居民生活水平的提高，消费者的食品安全意识和健康观念逐渐提升，因此对食品质量安全和营养卫生也提出了更高要求。猪肉在我国居民肉类食品中消费量最高，2016年我国猪肉产量为肉类总产量的62%[1]。然而，生鲜猪肉极易发生变质腐烂现象，造成严重经济损失。因此，在猪肉的贮藏、运输和销售环节中，实时监测猪肉的新鲜度十分必要。
传统的肉类新鲜度评价方法包括理化分析、微生物数量检测和感官评定等方法。挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量与猪肉新鲜度相关性最高，是目前肉品新鲜度检测中的重要理化指标[2-3]。但是上述方法存在操作复杂、费时耗力、对实验人员技术要求较高等局限。新兴的检测方法，如红外光谱、超声波、核磁共振技术和电子鼻等需要借助仪器，成本较高，且不适用于密封包装产品的检测[4-5]。因此，探索微型、简单、方便快捷的猪肉新鲜度无损检测方法具有重要意义，同时为消费者选择肉制品提供可靠依据。
新鲜度指示标签是一种可实时监测食品品质变化的技术，国内外学者在提高指示标签的应用方面拥有众多研究，并已经取得了一定进展。许多国外企业与学者尝试将其应用于鱼类、牛肉和水果等不同食品中。例如负载溴甲酚绿（pH 4.72）的标签可实时监测包装内鳕鱼鱼头的TVB-N含量，根据标签的颜色变化可以准确判断鱼类的新鲜度[6]。Kuswandi等[7]基于甲基红和溴甲酚紫构建了双传感器标签用于监测牛肉新鲜度，该标签可以清晰、容易地检测到牛肉的腐败，并准确反映牛肉的新鲜度，其中甲基红标签由红色变为黄色，而溴甲酚紫标签由黄色变为紫色。Aranya等[8]以淀粉为主要原料，通过添加壳聚糖、甲基红和溴百里酚蓝制备一种新型指示标签，其物理性能良好，适用于新鲜榴莲中硫化合物的检测。国内新鲜度指示标签的发展较为缓慢，尚处于起步阶段。朱惠绵等[9]通过在指示卡基材中添加复合酸碱指示剂、缓冲溶液等成分，研制出一种能通过颜色变化直接反映食品包装环境中CO2体积分数的指示卡，当包装环境中的CO2超过一定体积后，该指示卡在60 min内即可作出响应并及时指示包装食品的质量。邹小波等[10]以玫瑰茄花青素提取物制备可检测肉类新鲜度的智能指示膜，并比较分析不同基材复合膜在机械性能、水溶性、微观结构以及颜色稳定性等方面的差异。然而这些研究仍处于实验室研究阶段，尚未能广泛应用。
新鲜度指示标签的构建（如包装中挥发性气体与指示剂的选择）是新鲜度指示标签有效监测食品品质的关键因素。生鲜猪肉变质速率较快，因此需要响应更为及时的标签指示体系，而目前研究的指示标签的响应速率较慢、灵敏度较低[11]，并且较难区分食品新鲜等级，因此，新鲜度指示标签的构建及响应仍需进一步深入研究。本研究以甲基纤维素和聚乙二醇-6000为基材，通过添加溴甲酚紫、溴百里酚蓝等酸碱指示剂溶液制得新鲜度指示标签，检测其在不同质量浓度NH3环境中的显色情况，并设计一种非接触式包装，以期有效避免指示标签对猪肉样品的污染，考察其用于实时监测瘦猪肉新鲜度的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜去皮猪精瘦肉 河北省石家庄市北国超市。
聚乙二醇-6000 天津市科密欧化学试剂有限公司；甲基纤维素、甲基红指示剂、溴甲酚紫指示剂 阿拉丁试剂（上海）有限公司；溴百里酚蓝指示剂 天津市鼎盛鑫化工有限公司；食品级聚乙烯（水蒸气透过率为150 g/（m2·d））保鲜膜 无锡市优能塑业有限公司。
1.2 仪器与设备
CR-400色彩色差计 日本柯尼卡美能达控股公司；ST2100实验室pH计 奥豪斯仪器（常州）有限公司；SX500高压灭菌锅 日本Tomy公司；101-2A型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司；生化培养箱上海一恒科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 指示标签的制备
制备方法参照文献[10,12]。配制溴甲酚紫、溴百里酚蓝染料指示剂（5 g/L）和溴百里酚蓝与甲基红（质量比3∶2）混合指示剂（5 g/L），将30 g/L甲基纤维素和10 g/L聚乙二醇-6000在蒸馏水中溶解并混合均匀，静置24 h去除气泡，按40 mL/L分别加入各染料并搅拌均匀，调节pH值（表1），倒入玻璃平皿，40 ℃热风干燥8 h去除溶剂，揭下指示膜并将其剪成1.2 cm×1.2 cm大小，以1.5 cm×1.5 cm滤纸为背景制备6 种指示标签，将其排列分布于密封盒盖表面，用聚乙烯保鲜膜覆盖标签和滤纸，密封，以避免指示标签与猪肉样品的接触。
表1 制备指示剂的材料
Table 1 Materials used for preparing indicators
指示标签 染色剂种类 初始pH 1溴甲酚紫 4.47 2溴百里酚蓝 5.50 3溴百里酚蓝+甲基红 5.16 4溴甲酚紫 4.25 5溴百里酚蓝 4.24 6溴百里酚蓝+甲基红 4.39
1.3.2 指示标签对不同质量浓度NH3的显色灵敏度测试
利用浓氨水的易挥发性质释放NH3，使密封盒内NH3达到不同质量浓度（1、3、5、10、20、30 μg/mL）。在恒定照明条件下，利用色差仪根据CIE-L*a*b*颜色系统，以蒸馏水空白样品为色差参比，测定指示标签的颜色指标[11]。L*为明亮度，a*为红绿度，b*为黄蓝度。按照下式计算总色差值（ΔE）。
式中：ΔL*＝L*-L0*、Δa*＝a*-a0*、Δb*＝b*-b0*；L*、a*、b*为样品密封盒标签的测定值；L0*、a0*、b0*为蒸馏水空白样品密封盒标签的测定值。
1.3.3 指示标签对猪肉新鲜度的检测
1.3.3.1 样品处理
将新鲜精瘦猪肉于无菌环境下切分成每块（150±10）g，放入密封盒，对照组密封盒中加入（150±10）g蒸馏水，用粘贴好6 种标签的盖子密封，置于4 ℃生化培养箱中贮存16 d。实验组分为2 部分，第1部分包括3 组平行样品，用于每天测定标签和肉样的ΔE值，并进行感官评价；第2部分包括17 组样品，每天取1 组样品检测猪肉腐败相关指标（包括TVB-N含量、菌落总数、pH值和持水性）。
1.3.3.2 指标测定
按1.3.2节方法测定对照组和3 个样品组中每个标签和精瘦猪肉的颜色变化并计算ΔE。TVB-N含量：参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中的自动凯氏定氮仪法[13]。菌落总数：参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》[14]。pH值：称取10 g样品切碎，加入盛有90 g蒸馏水的绞肉机中，破碎匀浆2 min，用pH计测定。持水力参照文献[12]的方法。
1.3.3.3 感官评价
根据表2感官评分标准，对样品气味、黏度、色泽、组织状态4 个感官特性进行评价，对每个特性细化分级，组织9 名经过感官评价训练的人员进行评分，分别计算总分并取平均值，结果7 分以上为良好品质，5 分是可接受限度[15-16]。
表2 猪肉新鲜度感官评定表
Table 2 Criteria for sensory evaluation of pork freshness
指标 评分标准 评分气味（2.5 分）表层和深层均有腐臭气味 0.0～0.5表层有严重酸味或酸霉味 0.6～1.3表层有轻微氨味或酸味 1.4～2.0鲜猪肉正常气味 2.1～2.5黏度（2.5 分）表面外膜、切断面发黏，肉汁浑浊 0.0～0.8表面有一层微湿的外膜，切断面发黏 0.9～1.8切断面稍湿，不发黏，肉汁透明 1.9～2.5色泽（2.5 分）表面暗红发白，无光泽，切断面发暗 0.0～0.8表面暗红，无光泽，切断面色泽较暗 0.9～1.8表面和切断面呈鲜红色，颜色均匀，有光泽 1.9～2.5组织状态（2.5 分）组织失去原有的弹性，出现腐烂 0.0～0.5用手指按压后凹陷，不能复原 0.6～1.3用手指按压后不能完全复原，肉质柔软，弹性小 1.4～2.0用手指按压后立即还原，肉质紧密，有弹性 2.1～2.5
1.4 数据处理
所有实验均重复测定3 次，结果以平均值±标准差表示。用SPSS 16.0软件处理指标测定数据。使用一般线性模型程序进行单因素方差分析，比较5%显著水平的平均值。用主成分分析评估指示标签的可行性。用Origin Pro 9.0软件进行偏最小二乘回归分析，根据指示标签获得的数据预测TVB-N含量和菌落总数。
2 结果与分析
2.1 指示标签对于不同质量浓度NH3的显色结果
图1 指示标签对于不同质量浓度NH3的显色结果
Fig. 1 Color rendering of indicator labels for NH3 at different concentrations
由图1可知：6 种指示标签在不同质量浓度NH3环境中均发生不同颜色变化，这是因为浓氨水挥发释放NH3，导致密闭环境中碱性气体质量浓度增加，指示标签的颜色也随之发生变化；标签1、2、5表现为黄-绿-蓝的变色趋势，标签4仅观测到由黄色变为蓝色，标签3由最初的红色变为黄色，最终变为蓝色和绿色，标签6变色较为缓慢，由红色逐渐变为绿色。以上结果表明，指示标签的灵敏度差异与指示剂种类和成膜基质的初始pH值相关。
图2 不同质量浓度NH3环境中6 种指示标签的ΔE
Fig. 2 Total color difference of six indicator labels when exposed to different concentrations of NH3
由图2可知，随着环境中NH3质量浓度的增加，指示标签颜色变化越来越明显，此结果与陈慧芝[17]的研究结果一致。在NH3质量浓度为1 μg/mL时，标签4 ΔE明显增大，达到50.87，但NH3质量浓度进一步增大，标签4 ΔE无明显变化，这也解释了标签4只有2 种显色的原因。对于不同NH3质量浓度，6 种标签颜色均发生明显变化，说明用指示标签的颜色变化来实时监测冷鲜肉密封包装中碱性气体含量具有潜在可行性。Dilidaer等[18]对用于监测包装火腿新鲜度的酚红标签进行评价，结果表明该标签可以对CO2气体含量迅速作出变色反应，且实用性较好。由于猪肉腐败过程中也会产生CO2等其他气体，所以指示标签对于其他气体的响应灵敏度也值得进一步探究。
2.2 贮存期间猪肉品质的变化
2.2.1 贮存期间猪肉颜色的变化
图3 4 ℃贮存条件下猪肉ΔE的变化
Fig. 3 Variation in total color difference of lean meat during storage at 4 ℃
由图3可知，在4 ℃贮存条件下，随着贮存时间延长，猪肉ΔE不断增加，表明猪肉颜色发生变化。这是由于猪肉中肌红蛋白被氧化成氧合肌红蛋白和高铁肌红蛋白，颜色由鲜红色变为红褐色或紫红色[19]。ΔE＞12时，表示不同的颜色空间，即可以通过肉眼很容易观察到颜色变化[20]。贮存16 d时，猪肉呈暗红色，ΔE＜12，但已产生非常明显的腐臭味，且几乎完全失去弹性，这说明消费者无法凭借肉眼观察直观地判断猪肉的新鲜度。
2.2.2 贮存期间猪肉TVB-N含量的变化
图4 贮存期间猪肉TVB-N含量的变化
Fig. 4 Variation in TVB-N content in lean meat during storage
TVB-N含量是评价猪肉新鲜度的重要参考指标[21]。新鲜肉TVB-N含量≤10 mg/100 g，次级鲜肉TVB-N含量10～15 mg/100 g，腐败肉TVB-N含量达到15 mg/100 g以上[22]。由图4可知：猪肉TVB-N含量在贮存0～6 d时低于10 mg/100 g，表明样品为新鲜级别；贮存7～10 d时，TVB-N含量为10～15 mg/100 g，此时猪肉已有轻微异味，为中等新鲜度。贮存11 d猪肉样品腐败变化明显，已有严重的腐臭气味，TVB-N含量达到（16.51±0.51）mg/100 g。刘飞等[23]采用近红外光谱有效变量快速检测猪肉TVB-N含量的测定结果与本实验结果相似。猪肉在贮存期间发生腐败变质，主要是因为微生物污染产生的代谢物（如胺、醛、酮和酯类）以及其他生化反应产生异味和感官排斥的低分子质量物质。
2.2.3 贮存期间猪肉菌落总数的变化
图5 贮存期间猪肉菌落总数的变化
Fig. 5 Variation in total bacterial colony in lean meat during storage
根据GB/T 9959.2—2008《分割鲜、冻猪瘦肉》，新鲜肉类的微生物数量≤106 CFU/g[24]。由图5可知，贮存期间猪肉菌落总数逐渐增加，贮存10 d时，菌落总数超过限值，与TVB-N含量达到可接受限值的时间一致。肉类营养丰富，可以满足多种腐败菌和病原菌的生长需求，是理想的天然微生物培养基，因此新鲜猪肉极易遭到微生物污染[25]。
2.2.4 贮存期间猪肉pH值的变化
图6 贮存期间猪肉pH值的变化
Fig. 6 Variation in pH in lean meat during storage
由图6可知，贮存前期猪肉pH值呈波动变化，贮存7 d时pH值为6.40±0.05，贮存16 d时，猪肉pH值为7.00±0.12；pH值变化趋势与廖宜涛等[26]的研究结果基本一致。贮存前期猪肉pH值出现波动，可能是由于肌肉中肌糖原分解产生的乳酸和磷酸等酸性物质中和了猪肉表面细菌生长代谢产生的碱性物质。由于pH值增加更有利于微生物的生长，因此贮存后期猪肉变质更加明显。
2.2.5 贮存期间猪肉持水力的变化
图7 贮存期间猪肉持水力的变化
Fig. 7 Variation in water-holding capacity of lean meat during storage
由图7可知，贮存期间猪肉持水力总体呈下降趋势，由最初的85.33%降低到68.67%。猪肉持水性是指在冷冻、冷藏、绞碎等加工处理过程中，猪肉维持自身水分及吸收外部添加水分的能力。持水性是衡量猪肉品质和营养价值的重要指标，与猪肉的嫩度、弹性、口感、质地等品质具有直接联系[27]。研究发现，随着肌肉中蛋白质含量的减少，其持水力和结合水含量也随之降低[28]。李侠等[29]研究发现，随着贮存时间的延长，猪肉中肌原纤维蛋白不断氧化以及肌原纤维骨架被破坏，肉的持水性变差。
2.2.6 贮存期间猪肉感官品质的变化
图8 贮存期间猪肉感官评分的变化
Fig. 8 Variation in sensory evaluation score of lean meat during storage
猪肉的感官品质包括颜色、气味、表面黏性、弹性和嫩度等，直接反映了猪肉的新鲜度。由图8可知：猪肉感官评分在贮存过程中逐渐下降；贮存7 d时，感官评分低于7 分（良好品质），贮存10 d时，感官评分低于5 分，低于可接受限度，与TVB-N含量达到可接受限值的时间基本一致。贮存11 d时样品出现渗液和难以接受的腐败异味。
综上所述，贮存11 d时猪肉TVB-N含量、菌落总数和感官评分均超过可接受限值[30]，因此，确定猪肉腐败临界时间点为贮存11 d；确定贮存0～6 d为新鲜期，贮存7～10 d为中等新鲜期，贮存11～16 d为腐败期。
2.3 指示标签在猪肉贮期间的显色情况
2.3.1 指示标签颜色和ΔE变化情况
由图9可知：随着贮存时间的延长，猪肉的颜色变深，新鲜度降低，同时，指示标签的颜色也发生不同程度的变化。猪肉变质时会释放挥发性有机碱，导致密封包装环境中碱性气体成分增加。同时，密封包装中样品水分挥发，渗入指示膜中成为指示剂。因此，随着包装顶部空间中碱性腐败挥发性气体逐渐增加，指示标签的颜色随pH值的增加而变化，从而显示出肉类的腐败情况。Huang Shaoyun等[31]用紫草提取的天然染料和琼脂制备一种用于检测鱼类新鲜度的指示标签，结果表明，新鲜度标签的颜色响应与鱼肉样品中TVB-N含量的变化相关。因此，指示标签可以通过肉眼可见的颜色变化来指示猪肉的腐败情况。
图9 4 ℃贮存包装猪肉的不同新鲜度指示标签的颜色变化
Fig. 9 Color changes of freshness indicator labels for packaged lean meat during storage at 4 ℃
A～F. 贮存时间分别为1、3、7、9、11、16 d。
图10显示了6 种指示标签在4 ℃条件下贮存不同时间的颜色变化。指示标签4、5、6的颜色变化分别与指示标签1、2、3相似。根据上述腐败指标检测结果，猪肉品质可以分为新鲜（贮存0～6 d）、中等新鲜（贮存7～10 d）和腐败变质（贮存11～16 d），指示标签4的颜色在这3 个阶段均有明显变化，0～6 d为金色，7～10 d为棕黄色，11～16 d为蓝色，但在同一阶段内变化不明显，因此能较好地指示猪肉的新鲜程度。标签3在猪肉贮存期间颜色也呈显著变化，0～7 d呈现红色，8 d时颜色逐渐变为黄色，11 d时变为绿色，与猪肉新鲜度变化结果基本一致。其他标签不能提供猪肉腐败的可靠信息，例如：标签1在贮存0～9 d的颜色变化不明显；标签2颜色在贮存12 d时才发生变化，而此时猪肉已腐败变质；标签5和标签6也同样存在颜色变化迟缓的问题，无法有效区分猪肉的新鲜期和中等新鲜期。Liu等[32]用溴甲酚绿制备传感标签用于监测和评估鱼的新鲜度，观察到传感标签出现黄-绿-深蓝的颜色变化，说明此类新鲜度指示标签对于鱼类的新鲜度检测具有实际意义。根据其显色原理，该标签也可应用于牛羊肉等其他肉类产品的检测实践中。
图10 4 ℃猪肉腐败实验中指示标签的颜色变化
Fig. 10 Color changes of indicator labels for lean meat during storage at 4 ℃
图11 4 ℃猪肉腐败实验指示标签的ΔE
Fig. 11 Changes in total color difference of freshness indicator labels for lean meat during storage at 4 ℃
由图11可知，新鲜期（贮存0～6 d）所有指示标签ΔE均相对较低。与其他标签相比，标签4在贮存7 d时ΔE超过12，说明颜色变化显著，而在腐败期（贮存11～16 d）ΔE达到40。因此，指示标签4最适合用于区分猪肉新鲜期、中等新鲜期和腐败期。
2.4 指示标签颜色变化的主成分分析和偏最小二乘分析结果
图12 不同贮存期指示标签颜色数据的主成分分析图
Fig. 12 Principal component analysis of color changes of indicator labels 3 and 4 for freshness of refrigerated pork
对不同指示标签的颜色信息进行主成分分析，由图12可知，指示标签3的颜色信息不能区分新鲜期和中等新鲜期猪肉样品，指示标签4的颜色信息能较好地区分新鲜期（贮存0～6 d）、中等新鲜期（贮存7～10 d）、腐败期（贮存11～16 d）猪肉样品；主成分1和主成分2的总贡献率为91.55%，表明该结果能较好地反映原始数据集信息。因此，指示标签4的颜色变化与猪肉样品在4 ℃冷藏条件下新鲜度变化的相关性最佳，且肉眼易察觉，这一结果与Chun等[33]研究结果相似。
偏最小二乘法是一种多元投影法，可用于分析指示标签4的颜色测定数据以预测包装猪肉的TVB-N含量和菌落总数。基于标签4的颜色测定数据，得到TVB-N含量的预测模型为Y=0.84X+1.07（R2=0.928 5）；菌落总数的预测模型为Y=0.8X+1.01（R2=0.923 0），模型预测精度良好。由于TVB-N含量和菌落总数是确定猪肉新鲜度的重要参数，因此偏最小二乘分析结果也表明指示标签4在评估包装猪肉新鲜度方面具有应用潜力。
3 结 论
为检测猪肉在4 ℃冷藏条件下的新鲜度，选取3 种测定食品新鲜度指标的酸碱指示剂（溴甲酚紫、溴百里酚蓝以及溴百里酚蓝和甲基红混合指示剂）制备6 种猪肉新鲜度指示标签。本研究中使用的所有指示标签在不同质量浓度的NH3环境中均发生了不同的颜色变化。将指示标签用于监测猪肉的新鲜度变化，结果表明，指示标签4（初始pH值为4.24的溴甲酚紫指示剂）的颜色变化情况与贮存过程中TVB-N含量和菌落总数具有显著相关性，即猪肉新鲜期呈金色、中等新鲜期呈棕黄色和腐败期呈蓝色，能够用于实时监测猪肉的新鲜度变化。新鲜度指示标签在猪肉保鲜和检测方面具有较大的潜力，对密封包装冷鲜猪肉的无损检测方法提供了一定的参考。目前，我国将指示标签应用于实时监测食品新鲜度的研究还处于起步阶段，指示标签对于包装中其他气体（如CO2等）以及其他肉类的显色反应有待进一步研究。指示标签作为一种新兴监测技术，无疑将会为食品保鲜行业起到非常重要的助推作用。
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